专利名称：一种表达猪microRNA-378的方法及专用DNA片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种控制表达猪microRNA-378表达的方法及专用DNA片段。
背景技术：
microRNA (miRNA)是一种短的、含有22个核苷酸的非编码RNA，他们可以通过与靶基因的序列完全或不完全的配对来调控基因的表达，动物成熟的miRNA来源于长为80个核苷酸、具有茎环结构RNA的一个臂上。miRNA可以调控细胞的增殖、凋亡、脂肪的代谢、神经类型、造血细胞的分化以及植物叶与花地发育。miRNA可能与增生类的疾病密切相关，事实上在人类基因组中有很多的miRNA都与常见的肿瘤及癌症有关。大量研究表明，miRNA影响分化及细胞周期，同时影响肌肉的发育。microRNA-378是近年来发现的一个可增加细胞的活力，促进肿瘤的生成过表达可以促进成骨细胞的分化及骨节的形成，对于细胞的增殖与分化有着重要的调节作用的hicioRNA。其对动物机体的影响还有待于进一步的研究。人们在深入了解生物基因调控机制的基础上，构建出一系列可调控转基因表达的系统，使所转基因可按研究者的意愿以时空特异的方式进行表达。目前存在的调控系统很多，其中研究较多、应用最为广泛的是四环素调控系统(简称tet调控系统)；用tet调控系统表达基因是近年来常规调控手段，但该系统能否调控microRNA表达不能预测,特别是对具体的microRNA-378表达能否进行有效调控更是有待研究。将该系统通过添加诱导底物实现外源基因的可控表达。
发明内容
为了解决microRNA-378的表达问题，本发明提供用于表达microRNA-378的前体片段、表达载体，及表达猪microRNA-378的方法。一种用于表达microRNA-378的前体片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一种控制表达猪microRNA-378在猪胎儿成纤维细胞中表达的方法。本发明提供的增强猪microRNA-378表达量的方法，是将含有上述microRNA-378的前体片段的重组载体导入宿主细胞中，富集具有诱导表达活性的细胞集落群，经诱导底物诱导，目的基因的表达量显著高于诱导前。具体步骤是(I)将SEQ ID NO.1所示片段插入pSingle-tTS载体的XhoI位点得到重组载体pSingle-tTS-microRNA-378 ； (2)将重组载体口3;[1^16-1:13-111；[。1'01 熟-378 转化到宿主细胞中，用强力霉素(deoxycycline, D0X)诱导表达。上述microRNA-378的前体片段中含有microRNA-378前体基因。含有上述microRNA-378的前体片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。具体地，所述重组载体是将上述的microRNA-378前体DNA片段插入pSingle_tTS载体的XhoI位点成的重组表达载体pSingle-tTS-microRNA-378。
含有上述miciORNA-378的前体片段转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。上述转基因细胞是将上述SEQ ID NO.1片段导入真核细胞中构成的转基因细胞。进一步，SEQ ID NO.1的DNA片段是通过上述的重组载体导入所述真核细胞中的。上述真核细胞可以是猪胎儿成纤维细胞。含有上述SEQ ID NO.1所示DNA片段的表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围之内。实验证明和正常组细胞内microRNA-378表达相比，pSingle-tTS-microRNA-378细胞组诱导前、后表达效率分别是正常细胞组的7. 132倍及318. 653倍；而对照组转pSingle-tTS诱导前、后表达效率分别是正常细胞组的3. 473及2. 210倍，pSingle-tTS-microRNA-378细胞组经诱导底物诱导后microRNA-378表达效率显著提高。说明构建的可控表达microRNA-378载体在猪PEF细胞中具有很高的表达效率及诱导表达活性。
图1 :PCR扩增猪microRNA-378前体DNA产物电泳图，M是marker，I是猪microRNA-378 前体 DNA。图2 :含有microRNA-378前体DNA的真核可控表达载体示意图
图3 :实时荧光定量PCR测定各组PEF细胞中microRNA-378的表达水平。1:正常组细胞组；2 pSingle-tTS细胞组，未添加DOX诱导物；3 :pSingle_tTS细胞组,添加DOX诱导物；4 pSingle-tTS-microRNA-378 细胞组，未添加 DOX 诱导物；5 pSingle-tTS-microRNA-378 细胞组，添加 DOX 诱导物。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。本发明依赖的遗传资源是猪(Sus scrofa)(大白猪品系，购自唐山市新基源种猪有限公司)。实施例1真核表达载体pSingle-Tts-microRNA-378的构建以猪(Sus scrofa)(大白猪品系,购自唐山市新基源种猪有限公司)基因组DNA(从猪血液提取而来)为模板，设计并合成I对引物Pl及P2，以猪基因组DNA为模板，高保真酶扩增包含microRNA-378前体片段，引物序列上游引物Pl taCTCGAGATCGCGGGCCTGCTCATTT (下划线标注为 Xho I 位点)(SEQID NO. 3)下游引物P2 ataCTCGAGGGGAGAGTCCAAAGGGCTG (下划线标注为 Xho I 位点)(SEQID NO. 4)PCR 扩增反应体系(10μ L) :ddH206. 8μ L ;10XPCR Buffer (Mg2+free) I μ L ;大白猪基因组 DNA 模板 IyL ;Mg2+ (2. 5mM) O. 3 μ L ;引物(10 μ Μ)各 O. 3 μ L ;dNTP (2. 5mM)0. 15 4 1^;0嫩聚合酶0. 15yL ;(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增反应程序94°C变性5min，然后开始PCR反应，共33个循环，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s, 33个循环后于72°C延伸IOmin0PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物特异性检验(图1)，可见扩增产物在20(T300bp处有一特异性产物，用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用Xho I酶切纯化产物；同时用Xho I酶切pSingle-Tts载体(购自clontech公司(货号PT3923-5 ));将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804);按公司要求操作步骤转化DH5ci (购自北京全式金公司，货号⑶201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitiOgen北京公司)；选取测序结果表明含有microRNA-378前体DNA的载体，提取质粒备用，将该测序表明正确的质粒命名为pSingle-Tts-microRNA-378 (图 2, pSingle-Tts-microRNA-378 载体序列见 SEQIDN0. 2)。实施例2、本发明的含可控表达猪microRNA-378真核表达载体的细胞水平表达检验1、冻存细胞的复苏与培养pSingle-Tts-microRNA-378质粒用ScaI大量酶切线性化后，QIAGEN纯化试剂盒胶回收线性化片段，产物终浓度为500ng/ul用于细胞转染。从液氮中取出装有猪PK15细胞(购自中国科学院细胞库)的冻存小管，立即投入37-40°C的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在l_2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入ImL DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号12100-046)，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。
2、细胞转染与筛选将猪PK15细胞(购自中国科学院细胞库)分为5组分别是正常饲养组、转 pSingle-Tts 后未经 DOX 诱导组(pSingle-Tts/DOX-)、转 pSingle-Tts 后经 DOX诱导组(pSingle-Tts/DOX+)、转 pSingle-Tts-microRNA-378 后未经 DOX 诱导组(pSingle-Tts-microRNA-378/DOX-)及转 pSingle-Tts-microRNA-378 后未经 DOX 诱导组(pSingle-Tts-microRNA-378/DOX+)。每组 3 个重复。转染前I天，向每孔含10%胎牛血清(购自GIBCO公司，货号21640_079)的500yLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号12100-046)的24孔板中分别接种0. 5-2 X IO5个猪PK15细胞，使细胞在转染前达到90-95%的汇合；用50 μ L的不加血清的DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号12100-046)分别稀释0. 8 μ g步骤I中的待转染各组DNA，并温和的混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2 μ LlipefectaminTM-2000加入50 μ L的无血清、无抗生素的DMEM培养基(购自GIBCO公司，货号12100-046)并轻轻混匀，于室温孵育5min ;5min后，分别将50 μ L的各组DNA稀释液加入50 μ L的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min ;将100 μ L的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37°C、饱和湿度、5%C02的培养箱中培养，于4-6h后用含10%血清(购自GIBCO公司，货号21640-079)的DMEM高糖培养基继续培养，在后代培养中，于细胞培养液中加入I微克/毫升浓度G418 (购自Gibco，货号11811-023)，筛选三周。pSingle-Tts/DOX+组细胞及pSingle-Tts-microRNA-378/DOX+组细胞在细胞培养液中添加终浓度I微克/毫升的强力霉素(D0X，购自clontech，货号631311 )，36小时候提取microRNA，其余各组细胞直接提取microRNA。3、各转染细胞组microRNA-378表达量鉴定I)细胞总RNA提取及cDNA的制备利用MircoRNA分离试剂盒(购自QIAGEN，货号217004)提取并分离microRNA。根据 RevertAid TM First Strand cDNA SynthesisKit (购自 MBI,货号:K1622)使用说明书完成miRNA的第一链的合成。2)荧光定量PCR检测以I)中制备的cDNA为模板，miRNA的反转录使用茎_环引物，引物序列如下Stem-loop-378:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTTCTG-3’ (SEQID NO. 2) ；U6 - AP:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT (SEQ ID NO. 6)以此cDNA为模板，以U6为内参(引物为U6-SP和U6-AP)，根据实时荧光定量检测试剂盒SYBR* Premix Ex Taq II 使·用说明书进行 Real-time PCR测定 miR_378(universalAP和ssc-miR-378-SP)表达水平，引物序列如下U6-SP:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT, (SEQ ID NO. 7) U6-AP:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATuniversal AP CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC, (SEQ ID NO. 8)ssc-miR-378-SP:GGGACTGGACTTGGAGT (SEQ ID NO. 9)定量PCR反应20R扩增反应体系SYBR Premix Ex mixlOGACTTGGA模板I板L, DyeIIO. 4μ L,引物(10，)各 0. 4, DyeIIO. 4 μ Lu .;反应条件为95 °C 30s ；95 °C 5s,60°C 34s, 40 个循环。荧光定量检测结果如图3所示，各测定组中，和正常组细胞内microRNA-378表达相比，pSingle-tTS-microRNA-378细胞组诱导前、后表达效率分别是正常细胞组的7. 132倍及318. 653倍；而对照组转pSingle-tTS诱导前、后表达效率分别是正常细胞组的3. 473及2. 210倍，pSingle-tTS-microRNA-378细胞组经诱导底物诱导后microRNA-378表达效率显著提高，各组间相差极显著(P < 0.01)o
SEQUENCE LISTING
<110>扬州大学
<120> -种灰达猪microRNA-378的方法及专用DMA片段<130>
<±oO^ 9
<170> Patentln version 33
<210>I
<211>225
<212>DNA <213>人工序列
<400> I
atcgcgggcc Igctcatttt acagctgggg agagaggctg tgagagcccc gcggccggta60
caggaccacg cagccagtgg gtgacagagc cacccagggc tcctgactcc aggtcctgtg120
tgttgcctgg aaatagcact ggacttggag tcagaaggcc tgcgtggagt cgccttcgcc180
gctctctggc tgggtgaccc cggagccagc cctttggact ctccc225
<210>2
<211>4536
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 2
ctcgagatcg cgggcctgct cattttacag ctggggagag aggctgtgag agccccgcgg 60ccggtacagg accacgcagc cagtgggtga cagagccacc cagggctcct gactccaggt 120cctgtgtgtt gcctggaaat agcactggac ttggagtcag aaggcctgcg tggagtcgcc 180ttcgccgctc tctggctggg tgaccccgga gccagccctt tggactctcc cctcgaggag 240cttggcccat tgcatacgtt gtatccatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt 300ccaacattac cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg 360
权利要求
1.一种用于表达microRNA-378的前体片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述microRNA-378的前体片段的重组载体 pSingle-tTS-microRNA-378，其特征在于，是在pSingle_tTS载体的多克隆位点插入有SEQ ID NO.1所示片段。
3.一种增强猪microRNA-378表达量的方法，包括以下步骤(1)将SEQID NO.1所示片段插入pSingle-tTS载体的多克隆位点插得到重组载体 pSingle-tTS-microRNA-378 ；(2)将重组载体pSingle-tTS-miciORNA-378转化到细胞系中，用强力霉素诱导表达。
全文摘要
本发明公开了一种生产猪microRNA-378的方法及其专用DNA片段。该DNA片段如SEQIDNO.1所示。含有上述DNA片段的重组载体pSingle-tTS-microRNA-378也属于本发明的保护范围之内。具体地，上述重组载体是将pSingle-tTS载体的多克隆位点插入有SEQ ID NO.1所示片段上述的猪microRNA-378前体DNA片段插入pSingle-tTS的XhoΙ位点构成的重组表达载体。将重组载体转化到细胞系中，用强力霉素诱导表达生产猪microRNA-378；和正常组细胞内microRNA-378表达相比，经诱导底物诱导后microRNA-378表达效率显著提高，各组间相差极显著(p＜0.01)。
文档编号C12N15/63GK103045598SQ20131002208
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者鞠辉明, 杨跃飞, 白立景, 姜星 申请人:扬州大学