一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育aa高产菌株的方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法。为了获得高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，本发明利用原生质体融合的方法，将两种具备不同优良特性的高山被孢霉进行融合处理，并结合荧光染色方法对融合子筛选。其具体步骤包括：两亲本菌株的培养、两亲本菌株原生质体的制备、两亲本菌株原生质体的荧光染色、两亲本菌株原生质体的融合及融合子的筛选及验证。本发明所述方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高。该方法可用于提高花生四烯酸生产菌的产量水平、优化花生四烯酸产品的油脂组分和改良菌种性状等用途。
【专利说明】
一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法
[0001 ] 技术领域:
本发明涉及一种高山被孢霉融合子制备及荧光染色筛选的方法。
[0002]【背景技术】:
花生四稀酸(arachidonic acid，缩写AA)，是一种二十碳不饱和脂肪酸，在人体很多生理过程中起着重要作用。具有酯化胆固醇、抑制血小板聚集、降低血液黏度、调节白细胞功能、提高免疫力，促进婴幼儿大脑发育等功能。卫生部在1994年正式批准，可在婴幼儿配方食品中添加AA，1999年AA被正式列入新型营养强化剂。近年来已在保健食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用。
[0003]天然AA少量存在于动物肝和肾上腺、鱼油和微生物(原生动物、变形虫、微藻以及真菌)中，因含量过低不适合大规模的提取生产，近年来，发酵法生产AA—直是国内外研究的热点，高山被孢霉菌种因其油脂含量和AA含量高而被普遍应用于AA的发酵生产，2012年卫生部发布《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》(GB14880-2012)确定其为AA的生产菌。高山被孢霉菌种选育是提高AA产量的有效手段之一。传统的物理、化学诱变等育种方式存在突变方向不定、工作量大等缺点，因此，寻求更简便而高效的育种方式一直是发酵行业的研究课题。
[0004]近年来，利用原生质体融合技术选育微生物菌种受到人们的青睐。同传统的诱变育种技术相比，原生质体融合育种可以打破种属限制，采用某些性状优异的菌株作为融合亲株，可获得性状优良的重组体。原生质体融合技术应用于酵母工程菌及米曲霉工程菌的选育已经比较成熟。目前尚未发现此方法应用于高山被孢霉。
[0005]对于融合子的筛选方法和技术，多利用营养缺陷标记或抗性标记，操作繁琐，工作量大。本发明对制备的原生质体进行荧光染色，可直观判断融合成功的融合子，简单高效。
[0006]本发明通过原生质体融合的方式，再利用荧光染色方法进行筛选融合子以达到育种目的，用以改造尚山被抱霉菌种，提尚其AA广量，优化AA广品的油脂组分，提尚广品品质。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法。
[0008]本发明的目的是利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子的方法进行优良菌种筛选，简单、快速、有效地改造菌株，选育AA高产菌株。
[0009]
本发明的目的通过如下的技术方案来实现。
[0010]本发明利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子的方法，将两种具备不同优良特性的高山被孢霉进行融合处理，并结合荧光染色方法对融合子筛选，具体包括以下步骤:
(I)两亲本菌株的培养分别将两种具备不同优良特性的高山被孢霉接于PDA固体培养基培养5-7天，将孢子刮下，用无菌水制备孢子悬液，稀释至18个孢子/ml，取Iml孢子悬液分别接入250ml的两个三角瓶中，每个三角瓶中都装有50ml PDA液体培养基，28°C，150 r/min振荡培养12-24h，制得两亲本菌株；
(2)两亲本菌株原生质体的制备
将步骤(I)获得的菌丝体，用无菌水洗涤离心2次，再以浓度0.5-1.0 mol/L NaCl溶液洗涤I次并离心，取Img离心获得的湿菌体加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶和几丁质酶，轻摇使离心后的菌丝体和酶解液充分混合，再置于28-32°C、转速70-150r/min的恒温摇床中，酶解2_6h，酶解液用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，于4°C，5000r /min离心1min，沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl溶液洗涤2次后离心获得原生质体；
(3)两亲本菌株原生质体的荧光染色
将得到的两亲本原生质体分别悬浮于5mlPBS中，并分别加入Ιμ?的DiL(细胞膜红色荧光探针)和Ιμ? D1(细胞膜绿色荧光探针)荧光染色剂，37°C避光温育30min。离心去除染色剂，并用PBS缓冲液洗涤2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl中悬浮。
[0011](4)两亲本菌株原生质体的融合
将(3)中等量的荧光染色的两亲本原生质体悬液在离心管内混合，于4°C，5000r/min离心lOmin，弃上清留沉淀，向沉淀中加入5ml 30%_40%PEG6000，轻轻摇匀，于25_35°C静置30-9011^11，离心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗涤2次并悬浮，获得悬浮液，
(5)融合子的筛选及验证
在倒置荧光显微镜下观察，同一视野下绿色激发光下看到菌体呈橙黄色，蓝色激发光下看到菌体呈绿色，二者组合后呈红色的即为融合子，观察并计算融合率，显微操作吸取融合子涂布再生平板，于28°C倒置培养2-5d，挑取融合原生质体在再生培养基上的菌落，转接到另一再生平板培养，待长出菌丝后转接到TOA培养基茄瓶中培养，使孢子大量生长，制备孢子悬液，接种瓶，于25-30°C，湿度30 — 60%条件下培养2_4d，摇床转速为180_250rmp，将种子液按5-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8-14d，检测AA产量。
[0012]上述技术方案中，所述混合酶解液中各酶的浓度分别为蜗牛酶10-20mg/ml、纤维素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml、几丁质酶0.2-0.5 mg/ml。
所述酶解时间为5h。
[0013]所述NaCl 浓度为 0.8mol/L。
[0014]所述的D1荧光染色剂的配制为ImgD1中加入10ml DMSO获得，所述的Dil荧光染色剂的配制为Img Dil中加入10ml DMSO获得。
[0015]所述的融合剂为30-40%PEG6000，融合操作为:30°C静置lh。融合剂的最佳浓度为35%PEG，30°C静置 lh。
[0016]本发明的优点是:
1.利用原生质体融合技术对具备两种优良性状的菌株进行融合，获得兼具两者优良性状的融合菌株，定向改造菌种。
[0017]2.利用荧光染色方法筛选融合子，直观简便更大大减少了工作量。
[0018]3.目前，尚未发现该方法应用于高山被孢霉育种，为花生四烯酸高产菌株选育提供了一种新的手段。
[0019]【附图说明】:
图1为高山被孢霉原生质体形态示意图，其中图a为原生质体顶端释放示意图，图b为原生质体原位释放示意图，图c为原生质体形态示意图。
[0020]图2为荧光显微镜蓝色激发光和绿色激发光下图片以及它们的组合图，其中图a为蓝色激发光下图片，图b为绿色激发光下图片图c为组合图。
[0021]图3为本发明获得融合菌株AA含量的气相色谱图。(ARA百分含量的计算使用的是面积归一法，即ARA在气相检测图谱中的峰面积占总峰面积的百分比)
【具体实施方式】:
本发明所用菌株G12和F24，均由高山被孢霉alpine cfcc88447(购于中国林业微生物菌种保藏管理中心)紫外诱变后分离纯化获得，菌种以甘油管保存于-80 °C冰箱内，每6个月转存一次。G12，产孢子能力强，有利于传代培养，但油脂含量较低;F24，油脂含量较高，但产孢子能力较弱，不易于传代培养。
[0022]本发明所用的培养基及缓冲液:
1.PDA固体培养基:马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，KH2P04 0.0 5%, MgSO4 0.025%，ρΗ自夕犬.JWS ，
2.PDA液体培养基:马铃薯20%，葡萄糖2%，ΚΗ2Ρ04 0.05%,MgSO4 0.025%，ρΗ自然；
3.再生培养基:以lmol/L山梨醇配制的PDA培养基；
4.PBS: NaH2PO4.H20 2.Hg^Na2HPO4 2.26g 溶于 10ml 水中，PH 6.5,
取上述配制好液体1ml，加入4.68g NaCl后加水定容到10ml即得到I3BS。
[0023]两亲本菌株的培养及产量验证
分别将Gl2和F24接于TOA茄瓶培养基培养6天，制备孢子悬液，接种瓶，于25-30°C，湿度30 — 60%条件下培养2-4d，摇床转速为180-250rmp，将种子液按5-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8-14d，检测AA产量，
Gl 2的检测结果:生物量34.15g/L，油脂含量达33.26%，AA含量达36.25%，AA产量4.12g/
L；
F24的检测结果:生物量26.23g/L，油脂含量达43.61%，AA含量达47.16%，AA产量5.39g/L0
[0024]实施例1
(I)两亲本菌株的培养及收集
分别将G12和F24接于TOA固体培养基培养6天，将孢子刮下，用无菌水制备孢子悬液，稀释至18个孢子/ml，取Iml孢子悬液接入装液量为50ml PDA液体培养基的250ml三角瓶中，28°C，150 r/min振荡培养16h，制得两亲本菌株；
(2)两亲本菌株原生质体的制备
将步骤(I)获得的菌丝体，用无菌水洗涤离心2次，再以浓度0.8mol/NaCl溶液洗涤I次并离心，取Img离心获得的湿菌体加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括蜗牛酶10-20 mg/ml、纤维素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml和几丁质酶0.2-0.5 mg/ml，轻摇使离心后的菌体和酶解液充分混合，再置于28 °C、转速80r/min的恒温摇床中，酶解4h，酶解液用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，于4°C，5000r /min离心10111；[11，沉淀用0.8 mol/LNaCl溶液洗涤2次后离心获得原生质体；
(3)两亲本菌株原生质体的荧光染色将得到的两亲本原生质体分别悬浮于5mlPBS中，并分别加入Ιμ?的DiL(细胞膜红色荧光探针)和Ιμ? D1(细胞膜绿色荧光探针)荧光染色剂，37°C避光温育30min，离心去除染色剂，并用PBS缓冲液洗涤2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl溶液中悬浮；
(4)两亲本菌株原生质体的融合
将步骤(3)等量的荧光染色的两亲本原生质体悬液置于离心管内混合，于4°C，5000r/min离心lOmin，弃上清留沉淀，向沉淀中加入5ml 30%PEG6000，轻轻摇勾，于28°C静置451^11，离心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗涤2次并悬浮，获得悬浮液；
(5)融合子的筛选及验证
在倒置荧光显微镜下观察，同一视野下绿色激发光下看到菌体呈橙黄色，蓝色激发光下看到菌体呈绿色，二者组合后呈红色的即为融合子，观察并计算融合率约为20%，显微操作吸取融合子涂布再生平板，于28°C倒置培养2-5d，挑取融合原生质体在再生培养基上的菌落50个，转接到另一再生平板培养，待长出菌丝后转接到PDA培养基茄瓶中培养，使孢子大量生长，制备孢子悬液，接种瓶，于25-30°C，湿度30 — 60%条件下培养2_4d，摇床转速为180-250rmp，将种子液按5-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8-14d，检测AA产量，其中有15株菌产量高于两亲本菌株产量，产量最高的一株菌AA产量达6.14g/L。
[0025]实施例2
(I)两亲本菌株的培养及收集
分别将两株高山被孢霉Gl 2和F24接于PDA固体培养基培养6天，将孢子刮下，用无菌水制备孢子悬液，稀释至18个孢子/ml，取Iml孢子悬液接入装液量为50ml的250ml三角瓶中，28°C，150 r/min振荡培养16h，制得两亲本菌株。
[0026](2)两亲本菌株原生质体的制备
将步骤(I)获得的菌丝体，用无菌水洗涤离心2次，再以浓度0.8moI/L NaCI溶液洗涤I次并离心，取Img离心获得的湿菌体加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括蜗牛酶10_20 mg/ml、纤维素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml和几丁质酶0.2-0.5 mg/ml。轻摇使离心后的菌体和酶解液充分混合，再置于30 °C、转速80r/min的恒温摇床中，酶解5h，酶解液用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，于4°C，5000r /min离心10111；[11，沉淀用0.8 mol/LNaCl洗涤2次后离心获得原生质体。
[0027](3)两亲本菌株原生质体的荧光染色
将得到的两亲本原生质体分别悬浮于5mlPBS中，并分别加入Ιμ?的DiL(细胞膜红色荧光探针)和Ιμ? D1(细胞膜绿色荧光探针)荧光染色剂，37°C避光温育30min。离心去除染色剂，并用PBS缓冲液洗涤2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl中悬浮。
[0028](4)两亲本菌株原生质体的融合
将(3)中等量的荧光染色的两亲本原生质体悬液在离心管内混合，于4°C，5000r/min离心lOmin，弃上清留沉淀。向沉淀中加入5ml 35%PEG6000，轻轻摇匀，30°C静置60min。离心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗涤2次并悬浮，获得悬浮液。
[0029](5)融合子的筛选及验证
在倒置荧光显微镜下观察，同一视野下绿色激发光下看到菌体呈橙黄色，蓝色激发光下看到菌体呈绿色，二者组合后呈红色的即为融合子，观察并计算融合率约为40%。显微操作吸取融合子涂布再生平板。于28°C倒置培养2-5d，挑取融合原生质体在再生培养基上的菌落50个，转接到另一再生平板培养，待长出菌丝后转接到PDA培养基茄瓶中培养。使孢子大量生长，制备孢子悬液，接种瓶，于25-30°C，湿度30 — 60%条件下培养2_4d，摇床转速为180-250rmp。将种子液按5-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8-14d，检测AA产量。其中有22株菌产量高于两亲本菌株产量，产量最高的一株菌AA产量达6.59g/L。
[0030]实施例3
(I)两亲本菌株的培养及收集
分别将两株高山被孢霉Gl 2和F24接于PDA固体培养基培养6天，将孢子刮下，用无菌水制备孢子悬液，稀释至18个孢子/ml，取Iml孢子悬液接入装液量为50ml PDA液体培养基的250ml三角瓶中，28°C，150 r/min振荡培养16h，制得两亲本菌株。
[0031](2)两亲本菌株原生质体的制备
将步骤(I)获得的菌丝体，用无菌水洗涤离心2次，再以浓度0.8moI/L NaCI溶液洗涤I次并离心，取Img离心获得的湿菌体加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括蜗牛酶10_20 mg/ml、纤维素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml和几丁质酶0.2-0.5 mg/ml。。轻摇使离心后的菌体和酶解液充分混合，再置于32 °C、转速80r/min的恒温摇床中，酶解6h，酶解液用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，于4°C，5000r /min离心10111；[11，沉淀用0.8 mol/L NaCl洗涤2次后离心获得原生质体。
[0032](3)两亲本菌株原生质体的荧光染色
将得到的两亲本原生质体分别悬浮于5mlPBS中，并分别加入Ιμ?的DiL(细胞膜红色荧光探针)和Ιμ? D1(细胞膜绿色荧光探针)荧光染色剂，37°C避光温育30min。离心去除染色剂，并用PBS缓冲液洗涤2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl中悬浮。
[0033](4)两亲本菌株原生质体的融合、
将(3)中等量的荧光染色的两亲本原生质体悬液在离心管内混合，于4°C，5000r/min离心lOmin，弃上清留沉淀。向沉淀中加入5ml 40%PEG6000，轻轻摇匀，32°C静置90min。离心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗涤2次并悬浮，获得悬浮液。
[0034](5)融合子的筛选及验证
在倒置荧光显微镜下观察，同一视野下绿色激发光下看到菌体呈橙黄色，蓝色激发光下看到菌体呈绿色，二者组合后呈红色的即为融合子，观察并计算融合率约为25%。显微操作吸取融合子涂布再生平板。于28°C倒置培养2-5d，挑取融合原生质体在再生培养基上的菌落50个，转接到另一再生平板培养，待长出菌丝后转接到PDA培养基茄瓶中培养。使孢子大量生长，制备孢子悬液，接种瓶，于25-30°C，湿度30 — 60%条件下培养2_4d，摇床转速为180-250rmp。将种子液按5-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8-14d，检测AA产量。其中有11株菌产量高于两亲本菌株产量，产量最高的一株菌AA产量达5.98g/L。
[0035]实施例1-3所述的原生质体制备及融合过程，经比较得到最适原生质体制备及融合条件:30°C酶解5h，35%PEG6000，30°C静置保温60min进行融合。
[0036]对实施例2中融合后挑选出的高产菌株传5代验证，性状稳定。第5代摇瓶发酵11天检测结果为:生物量29.22g/L，油脂含量达46.63%，AA含量达48.25%，最终AA产量可达
6.57g/L。证明利用原生质体融合结合荧光染色筛选方法用以筛选AA高产菌获得了良好的效果。
【主权项】
1.一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法，其特征在于，将两种具备不同优良特性的高山被孢霉进行融合处理，并结合荧光染色方法对融合子筛选，具体包括以下步骤: (1)两亲本菌株的培养 分别将两种具备不同优良特性的高山被孢霉接于I3DA固体培养基培养5-7天，将孢子刮下，用无菌水制备孢子悬液，稀释至18个孢子/ml，取Iml孢子悬液分别接入250ml的两个三角瓶中，每个三角瓶中都装有50ml PDA液体培养基，28°C，150 r/min振荡培养12-24h，制得两亲本菌株； (2)两亲本菌株原生质体的制备 将步骤(I)获得的菌丝体，用无菌水洗涤离心2-3次，再用NaCl溶液洗涤1_2次并离心，取Img离心获得的湿菌体加入5ml混合酶解液里，轻摇使离心后的菌体和酶解液充分混合，再置于28-32°C、转速70-150r/min的恒温摇床中，酶解2-6h，酶解液用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，于4°C，5000r /min离心8_10min，弃上清留沉淀，沉淀用NaCl溶液洗涤，2-3次后尚心获得原生质体； (3)两亲本菌株原生质体的荧光染色 将得到的两亲本原生质体分别悬浮于5mLPBS缓冲液中，一个瓶加入IyL的DiL荧光染色剂，另一个瓶中加入IyL D1荧光染色剂，37°C避光温育30min，离心去除染色剂，并用PBS缓冲液洗涤2-3次，然后分别加入到等量的NaCl溶液中悬浮； (4)两亲本菌株原生质体的融合 取步骤(3)得到的等量的荧光染色的两亲本原生质体悬液，加入到离心管内混合，于40C，5000r/min离心1min，弃上清留沉淀，向沉淀中加入5ml融合剂，轻轻摇勾，于25-35°C静置30-90min，离心后沉淀用NaCl溶液洗涤2_3次并悬浮，获得悬浮液； (5)融合子的筛选及验证 在倒置荧光显微镜下观察，同一视野下绿色激发光下看到菌体呈橙黄色，蓝色激发光下看到菌体呈绿色，二者组合后呈红色的即为融合子，观察并计算融合率，显微操作吸取融合子涂布于再生平板，于28 °C倒置培养2-5d，挑取融合原生质体在再生培养基上的菌落，转接到另一再生平板培养，待长出菌丝后转接到TOA培养基茄瓶中培养，使孢子大量生长，制备孢子悬液，接种瓶，于25-30°C，湿度30 — 60%条件下培养2_4d，摇床转速为180-250rmp，将种子液按5-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8-14d，检测花生四烯酸产量。2.根据权利要求1所述的利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法，其特征在于:混合酶解液中各酶的浓度分别为蜗牛酶10-20 mg/ml、纤维素酶5-10mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml、几丁质酶0.2-0.5 mg/ml。3.根据权利要求1所述的利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法，其特征在于:所述的NaCl溶液的浓度为0.5-1.0 mol/L。4.根据权利要求1所述的利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法，其特征在于:所述的D1荧光染色剂的配制为ImgD1中加入1ml DMSO获得，所述的Dil荧光染色剂的配制为Img Dil中加入1ml DMSO获得。5.根据权利要求1所述的利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株 的方法，其特征在于:所述的融合剂为30-40%PEG6000，融合操作为:30°C静置Ih。
【文档编号】C12Q1/04GK106047856SQ201610312823
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】潘淼, 孙立洁, 陈祥松, 袁丽霞, 吴金勇, 凌瑞, 姚建铭
【申请人】中国科学院等离子体物理研究所