专利名称：一种葡萄芽变的快速区分方法
技术领域：
本发明涉及一种葡萄芽变的快速区分方法，属于生物学分子标记领域。
背景技术：
芽变(budsport、bud mutation)是体细胞突变(somatic mutation)的一种。芽变选种作为葡萄育种的一种方式，与其它育种方式(实生选种、杂交育种、辐射诱变育种、原生质体融合育种等)相比，有着独特的优势。其变异性状在田间容易被发现，可通过嫁接繁殖被保存下来而没有童期的干扰，可较快地进行鉴定和推广应用。芽变是细胞中遗传物质的突变，只有梢端组织分生层的细胞发生突变时才有可能成为一个芽变。组织发生层学说是目前解释芽变的主要学说，被子植物梢端分生组织都有几个相互区分的细胞层，叫组织发生层，分别用L M Lu、Lm表示。植物的组织即由这三层细胞分别衍生而成，各个组织发生层按不同的方式进行细胞分裂，并且衍生为特定的组织。L !层细胞进行垂周分裂，形成一层细胞，衍生为表皮和果肉。L工工层细胞进行垂周分裂，形成
1-3层细胞，衍生为皮层的外层及孢原组织。Lm层细胞既有平周分裂，又有垂直分裂和斜向分裂，形成多层细胞，衍生为皮层的中内层、输导组织和髓心组织(中柱)。在正常情况下，这三层细胞具有相同的遗传物质基础。如果层间或层内不同部分之间含有不同的遗传物质基础，经细胞分裂、分化发育后，形成具有两种或多种遗传结构的细胞组织使植物的某一器官表现出两种或多种不同性状即嵌合体。葡萄植株的细胞，在受到外界环境条件变化的刺激后，常会发生突然变异，变异后的芽发育成枝并开花结果时，其枝芽及果实的性状都与原株发生了变化。葡萄植株发生芽变后，其突变性状是多种多样的，但必须进行仔细的现察和对比，一般情况下芽变的主要特征有以下几个方面芽变后的叶片肥大，叶厚，色泽变深，枝条节间变短，生长势变强，也有的叶片无毛或裂刻深浅、叶缘的锯齿及尖锐程度发生了变化，还有的叶脉颜色、凹凸度发生 了变化；花蕾的数量、大小发生了变化，有的穂梗变得短粗；果粒、果穗变大，成熟后果粒色泽变深或变浅；树体的萌芽期、花期、果实成熟期提早或延迟；树体抗寒性增强，也有的枝条扦插不易生根，但嫁接成活率无大变化。除发生芽变这一类属于遗传物质的突变外，还普遍存在着可能由于一般的环境条件(包括砧木、肥水、土壤及各种气象和其他生态因子)或一系列栽培措施的影响而出现的饰变。这些饰变是非遗传物质的变异，是不可能遗传给下一代的。传统的芽变鉴定主要通过形态学的观察比较，但是有些情况下，芽变和饰变的性状特征非常相似，仅通过传统的形态学观察无法有效判断植株的突变性状是否属于植株芽变。而且传统的芽变鉴定通过形态学观察比较，受环境和经验影响较大，效率不高。所以准确鉴定芽变具有重要的意义，可快速获得一些具有优良性状的新材料，提高育种效率。反转录转座子在植物基因组中分布广泛，拷贝数多，异质性高，在种内和种间表现出较高的序列差异性和丰富的插入多态性(Applications of retrotransposons asgenetic tools in plant biology. Trends Plant Sci, 2001, 6 (3) : 127-134.);活性反转录转座子常在宿主基因组中产生新的插入位点，从而改变宿主基因组大小和组成，用来在谱系中建立系统发生关系，并产生插入突变(Plant retrotransposons. Annu RevGenet, 1999，33(1) :479-532.);反转录转座子插入、DNA甲基化和表达差异等被认为是果树变异的主要原因。研究表明反转录转座子能导致果树芽变，Yao等发现RaeIme等单性结实的苹果品种是由于反转录转座子插入内含子的MdPI基因造成的(Parthenocarpicapple fruit production conferred by transposon insertion mutations in aMADS-boxtranscription factor. ProcNatlAcad SciUSA,2001, 98(3):1306-1311.),Tignon等在对乔纳金苹果和它的两个红色突变进行差异显示分析时获得一个与Tyl-copia类反转录转座子的RT基因非常相似的一个片段(Identification of Copia —like retrotransposable element by apple. Acta Hortic 546, 2001:515 - 520.)； Kobayashi等发表论文表明红葡萄芽变品种RubyOkuyama和FlameMuscat均是反转录转座子缺失产生的(Retrotransposon-induced mutations in grape skin color. Science, 20
04,304(5673) :982-982.) ;Breto等证实反转录转座子是造成甜橙基因组变异的原因(TheDiversification of Citrus Clementina Hort. ex Tan. , a Vegetatively PropagatedCrop Species. Mol Phylogen Evol, 2001, 21 (2) :285-293.) 因此，利用反转录转座子标记区分葡萄芽变具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄芽变的快速区分方法。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种葡萄芽变的快速区分方法，包括以下步骤提取亲本葡萄植株及对应的疑似芽变葡萄植株的DNA，用iPBS引物分别对DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳区分芽变，亲本及疑似芽变品种电泳条带有差异，疑似芽变品种为芽变。所述的提取葡萄植株的DNA可以从葡萄植株的叶片、根、茎、果实或花中提取。所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步骤I)研钵预冷后，放入叶片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成细粉放入离心管并-20°C 冷藏 30min ；2)将热的CTAB提取缓冲液装入步骤I)的离心管中，使叶片组织均匀分散在缓冲液中，65°C水浴90min,每隔5min轻轻颠倒摇勻一次；3)将步骤2)的离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，摇勻，4000r/m离心IOmin ；4)取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，摇匀，4000r/m 离心 IOmin ；5)取上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，摇匀，-20°C静置2h，4°C下4000r/m离心IOmin ；6)弃上清液，加入70%乙醇盖住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C静置5h ；7)弃乙醇，风干5h，每管加入300 ii LTE缓冲液，充分溶解后，加入5 y L的RNase，37°C水浴7h，得到葡萄植株的DNA。所述的iPBS 引物是序列表 SEQ ID NO: U SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 或 SEQ IDNO:4的核苷酸序列的引物。
所述的PCR 扩增体系包括无菌 ddH20、I XBuffer、2. Ommol L^1Mg2+>
0.3mmol L^dNTPs.O. I u mol L-1 引物、DNAl. Ong/y L、Taq 酶 0. 05U u L'所述的PCR扩增程序是94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C充分延伸lOmin，其中，变性、退火、延伸三个步骤循环30次。反转录转座子广泛存在于果树基因组中，可以通过改变等位基因或调控基因表达以改变园艺学性状(成熟期和果皮色泽)。本发明鉴定芽变所采用的方法iPBS就是基于反转录转座子的一种分子标记。与常规分子标记技术比较，反转录转座子最大的优势在于它能覆盖全基因组，提供的信息更丰富，可作为高通量标记分析，具有很大的发展潜力。本发明以3组葡萄品种和其对应的早熟芽变葡萄品种为原料，利用iPBS分子标记有效区分了芽变葡萄品种，同时本发明无需预知反转录转座子的相关序列，具有较强的通用性，为有效选择变异奠定了理论基础。本发明操作简便、用途广泛，节约了大量的人力和 物力，便于推广。
图I为引物序列2220、2224、2229、2231的iPBS-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图2为引物序列2256、2295、2298、2373的iPBS-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图3 为引物 GretlFa、GretlRb, VinelRa, TvvlFa 的 IRAP-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式材料本发明选取3组亲本葡萄品种及其对应的早熟芽变葡萄品种，均来自中国农业科学院郑州果树研究所，见表I。表13组葡萄品种
序号(亲本葡萄品种一芽变葡萄品种)名称(亲本葡萄品种一芽变葡萄品种)
15—163京亚一洛浦早生
~18—100巨峰一98-2
~162—161乍娜一90-1实施例1、DNA的提取I、将研钵预冷后，加入少量液氮，并充足预冷；2、取-20°C预冷的新鲜完好干净叶片3g放入研钵中，加入半药勺聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和适量液氮，研磨至细粉，装入离心管，-20°C冷藏30min ;3、配制 CTAB 提取缓冲液称取 CTAB 2g 加蒸馏水 40ml，IM Tris_cl(pH8. 0)10ml，
0.5M EDTA (pH 8. 0)4ml和5M NaCl 28ml，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100ml，加热，至沸腾后再加入2%的P -巯基乙醇；4、将热的CTAB提取缓冲液装入步骤2)的离心管中，每管5ml，并将叶片组织均匀分散在缓冲液中，然后放入65°C的恒温水浴锅中90min，每隔5min轻轻颠倒摇匀一次；5、取出离心管，冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，摇匀使混合物成乳浊状，4000r/m离心IOmin ；6、取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，摇匀使混合物成乳浊状，4000r/m离心IOmin ；7、取上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，摇匀，-20°C静置2h ；8、取出并在 4°C下 4000r/m 离心 IOmin ；
9、弃上清液，加入70%乙醇盖住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C静置5h ；10、弃乙醇，风干5h，每管加入300 u LTE缓冲液，充分溶解后，每管加入5 y L的RNase，在37°C的恒温水浴锅中水浴7h，得到葡萄植株的DNA。实施例2、iPBS-PCR 扩增PCR扩增体系及程序参考Kalendar等，如表2、表3所示，引物由上海生物工程技术有限公司合成，如表4所示。表2iPBS-PCR扩增反应体系
权利要求
1.一种葡萄芽变的快速区分方法，其特征在于，包括以下步骤提取亲本葡萄植株及对应的疑似芽变葡萄植株的DNA，用iPBS弓丨物分别对DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳区分芽变，亲本及疑似芽变品种电泳条带有差异，疑似芽变品种为芽变。
2.根据权利要求I所述的一种葡萄芽变的快速区分方法，其特征在于，所述的提取葡萄植株的DNA可以从葡萄植株的叶片、根、茎、果实或花中提取。
3.根据权利要求2所述的一种葡萄芽变的快速区分方法，其特征在于，所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步骤 1)研钵预冷后，放入叶片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成细粉放入离心管并-20°C冷藏30min ； 2)将热的CTAB提取缓冲液装入步骤I)的离心管中，使叶片组织均匀分散在缓冲液中，65°C水浴90min,每隔5min轻轻颠倒摇勻一次； 3)将步骤2)的离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，摇勻，4000r/m离心IOmin ； 4)取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，摇匀，4000r/m离心 IOmin ； 5)取上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，摇匀，-20°C静置2h，4°C下4000r/m离心IOmin ； 6)弃上清液，加入70%乙醇盖住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C静置5h； 7)弃乙醇，风干5h，每管加入300μ LTE缓冲液，充分溶解后，加入5μ L的RNase，37°C水浴7h，得到葡萄植株的DNA。
4.根据权利要求I所述的一种葡萄芽变的快速区分方法，其特征在于，所述的iPBS引物是序列表SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4的核苷酸序列的引物。
5.根据权利要求I所述的一种葡萄芽变的快速区分方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系包括无菌 ddH20、I XBuffer、2. Ommol · L 1Mg2^O. 3mmol · L MNTPs、。· I μ mo I .L1SI物、DNA1.0ng/yL、Taq 酶 0.05U · μ L'
6.根据权利要求I所述的一种葡萄芽变的快速区分方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序是94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C充分延伸lOmin，其中，变性、退火、延伸三个步骤循环30次。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄芽变的快速区分方法，包括以下步骤提取亲本葡萄植株及对应的疑似芽变葡萄植株的DNA，用iPBS引物分别对DNA扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳区分芽变，亲本及疑似芽变品种电泳条带有差异，疑似芽变品种为芽变。本发明以3组早熟芽变葡萄品种为原料，利用iPBS分子标记有效区分了芽变葡萄品种，同时本发明无需预知反转录转座子的相关序列，具有较强的通用性，为有效选择变异奠定了理论基础。本发明操作简便、用途广泛，节约了大量的人力和物力，便于推广。
文档编号C12Q1/68GK102965434SQ201210446959
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者郭大龙, 张国海, 侯小改, 张潇玉, 郭明晓 申请人:河南科技大学