专利名称：培养附着性细胞的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培养动物细胞的方法及装置，特别是涉及一种培养附着性细胞的方法及装置。
由于在制药及生物科技工业对于由动物细胞生产的产品日渐增加的需求，发展动物细胞培养方法在生物医学界已经是不可或缺的工作，大多数动物细胞的培养，例如哺乳类动物细胞的培养，因为细胞无法在培养基中悬浮生长，所以必须藉助实体让细胞附着。针对培养附着性动物细胞已经发展出许多细胞培养系统，这些系统例如包括有组织培养器、滚动瓶式、细胞培养器、位于搅拌槽的微载体、中空织微及陶瓷系统(参阅Wei-Shou Hu等人的论文，即“Animal Cell Bioreactors-Recent Advances and challenges to Scale-up”The Canadian Journal of Chemical Engineering，“Specialized Techniques”Volume 69，April，1991，pages 409-420；“Specialized Techniques，”Cultureof Animal Cells，Chapter 23，pages 371-377)。
在动物细胞培养的过程中，一个最基本的需求就是要充分供给例如氧气的气体及养份，如果不能供应充足的气体或养份，会阻碍细胞的生长，另外一个需求就是要控制新陈代谢产物的程度，否则当其在培养基中累积到高浓度时，会阻碍细胞的生长。
该滚动瓶式是一种浴式系统，没有培养基的循环设备，该系统包括有容纳培养基并架在支撑物上滚动的瓶子，一般是在一滚动的瓶子内部盛入约有该瓶子内部容积1/10-1/5量的培养基，让细胞附着在该瓶子的内部表面生长，并藉由瓶子滚动时在瓶子未浸到的内部表面上所形成的培养基薄膜促进气相及液相间气体的交换，增加培养基中的溶氧量，因此即使当细胞密度较高时细胞仍能获得气体或氧气充分的供应，这种系统也提供了增加细胞附着的表面积及平缓的搅动，而使用诸如一吸量管或是蠕动泵的注入装置或分配设备增加新鲜的培养基。
但是，该系统却不能够控制pH值及溶氧，而且，因为缺乏培养基的循环装置，所以需要经常更换培养基以移除有毒的新陈代谢废物及养份的消耗，这是非常辛苦的劳力工作。在大量生产时，需要大量数目的瓶子，操作系统非常费力而且难以得到品质均匀的产品，因此，这种滚动瓶式的应用受到了限制。
具有培养基循环系统的细胞培养系统有益于补充培养基及移除新陈代谢的产物，在此种系统中，细胞是持续地浸在其培养基中，并且控制培养基的比例以供给细胞充分的养份及溶氧。
微载体系统为循环型的系统，其能轻易地扩张成大量生产，然而，除了价格昂贵外，基于细胞容易与微实体相分离的原因，尤其是在有高剪力存在的时候，这种系统的操作相当不方便。
另一种培养型的培养系统为栓塞流生物反应器，例如中空织微及陶瓷系统。在中空织微系统中，一培养基以高流速通过织微的内腔并且只有小部分渗透过织微的薄膜，这些中空织微系统通常能提供高的培养密度或效率，但是，因为小分子量的养份供给以及新陈代谢产物的移除通常需要藉由横过薄膜的浓度梯度的分子扩散来达成，所以溶氧及养份难以附着中空织微的长度及厚度而增加，因此，这种中空织微系统仍然难以生产大尺寸的细胞。
在该陶瓷系统中，细胞植入一多孔性陶瓷圆柱的槽道中，并且让培养基通过这些槽道以提供养份及移除新陈代谢物，藉由泵使培养基循环以增加溶氧量，然而，为了能够充分地供给溶氧，通常需要增加培养基的循环速率，而增加培养基的循环速率则会使细胞从附着面脱落，反而对生产效率有不利的影响。
本发明的主要目在于提供一种动物细胞培养系统，包括一能够轻易移除新陈代谢物及重新补充或置换培养基的培养基循环系统，并且允许细胞附着面自培养基中浮现出来，使其能够在培养基的薄膜及气体之间轻易交换气体，能够解决即使在高密度细胞下的氧气不足的问题。
本发明的另一目的在于提供一种培养基循环系统的改进，不会产生高剪力且让培养基对生长的细胞供给充份的溶氧。
本发明的另一目的在于提供一种动物细胞培养系统，能够控制及轻易地设计成大规模的生产。
本发明更进一步的目的在于提供一种动物细胞培养系统，能够经细胞附着的表面积及能够轻易地让细胞与其培养实体分离。
上述的目的藉由本发明所提供的培养附着性细胞的装置及方法来达成。
本发明的装置包括一个具有入口装置、出口装置及含有一个让细胞附着的附着面的实体装置的细胞培养室，以及一个用于在该细胞培养室内经由入口装置及出口装置循环培养基的装置。本发明的装置更进一步包括一个当培养基循环时，用于将该附着面浸入该培养基的装置，以及一个当培养基循环时，间歇地将该实体装置从培养基中暴露出来的装置，以经由该培养基在该附着面所形成的薄膜增加气体的交换速率。
该实体装置最好是固定的，且该浸入装置与该暴露装置和该循环装置结合在一起，以升高培养基的液位以浸淹该实体装置并且降低培养基的液位使附着面上留下一层薄膜。提供一用于储存培养基的装置与该培养基循环装置并以流体方式连通。
该浸入及暴露装置可包括在入口及出口装置的控制阀，以控制培养基入口及出口的流量。
本发明的另一特征在于提供一种培养附着性细抱的方法，包括有(a)提供一个细胞培养室，具有一入口、一出口及含有让细胞附着的附着面的实体装置；(b)在该培养室内经由该培养室的入口及出口循环培养基；(c)当培养基在循环时，将该附着面浸在该培养基中；及(d)当该培养基在循环时，间歇地将该实体装置自该培养基中暴露出，以经由在步骤(c)之后在该附着面上所形成的培养基薄膜增加气体的交换率。
该附着面最好间歇地藉由排放培养基来降低培养基的液位，以在附着面上形成一培养基的薄膜，该附着面藉由培养基的供给将培养基的液位升高到附着面之上的位置以浸入培养基中，该培养基是从培养开始不断地循环直到细胞附着到附着面上为止，在细胞附着到附着面上之后，该培养基的液位是在一预定的距离下交换地降低及升高，以将该实体装置的附着面间歇地暴露出，该培养基的循环操作是持续固定变化培养基的液位，以提供培养基平缓的搅动。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明
图1是本发明较佳实施例的培养附着性细胞的装置的示意图。
图2是本发明较佳实施例的局部示意图，其中更详细地表示出该培养室。
图3是本发明较佳实施例使用的平板实体组合的示意图。
如图1、2、3所示，一培养装置包括一个容器1，该容器1具有一个用以容纳一培养基的培养室11、用以供给培养基的上入口12及入口13、一个用以排放培养基的出口14，及一个让溢流向外流出的溢流口15。一个第一储存槽2设在比培养室11低的位置处，而一个第二储存槽3设在比培养室11高的位置处。
一个包括多个实体板71的实体装置7设在培养室11内，用以提供细胞生长的附着面，该等实体板71是朝垂直方向延伸且在水平方向间隔分开排列的平板，虽然在本较佳实施例中只用平板来表示细胞附着的实体，但是本发明所使用的实体装置不应仅限制于此，其他如以往用来让细胞附着的网状平板或填垫材料的实体，也可以用在本发明中。
一个用以循环培养基的循环装置，包括一个供给管41、一个排放管42、一个溢流管43及一循环管线44，该供给管41连接上、下入口12、13及第二储存槽3，该排放管42连接出口14与该第一储存槽2，该溢流管43延伸在该溢流口15与该第一储存槽2之间，该循环管线44则连接该第一储存槽2及第二储存槽3并且结合一泵45，用以将培养基从第一储存槽2输送到第二储存槽3。
阀161、第一、二控制阀162、163及溢流阀164是用以控制培养基在溢流管43、排放管42及供给管41内的流量，藉由三向阀的溢流阀164能够根据培养装置的操作需求，将培养基经由上入口部12或下入口部13供应到该培养室11内。空气滤菌器171及172设在培养室11，空气滤菌器173及174分别设在第一储存槽2及第二储存槽3，一个供气泵5与空气滤菌器171连接以视需要将新鲜空器抽取到培养室11。一个液位计9连接第一储存槽2以监测在第一储存槽2内的培养基的液位变化，当培养基的液位到达一预定的液位时，就启动该泵45将培养基输送到第二储存槽3。
一个虹吸管(siphon device)6一端连接该第一储存槽2，另一端连接该排放管42，该虹吸管6的高度安排为当工基的液位到达高于该等实体板71高度的液位可使虹吸管6开始吸取培养基，其高度几乎与溢流口15的高度相同。
本发明的培养装置可更进一步包括一个用于在培养室顶部或底部侧边的一或二个均匀分配培养基的装置，如本较佳实施例所示，该均匀分配装置8设置在该培养室11的顶部用以将培养基均匀分配到平的实体板71上，该装置8包括连接到入口13且具有多个分布在培养室11顶部侧边的排放开孔的分配管81，及一个具有针孔的盘82用以容纳来自分配管81的培养基并将其均匀分配到实体板71上，另一方面，也可以使用一喷淋装置(图未示)来代替有针孔的盘82以喷淋培养基。
该装置的操作始于细胞附着阶段，在该阶段，培养基是从第二储存槽3藉由重力或压力梯度由第二控制阀163控制在一适当的稳定速率供给到培养室11中，在此同时溢流口15的阀161打开以将培养基的液位维持在高度h4或是满液位状态，以使所有的实体板71浸在培养基中，从溢流口15流出的培养基藉由重力或压力梯度经由溢流管43向下流到第一储存槽2中，藉由液位计9监测在第一储存槽2内的培养基液位，控制泵45启动以将培养基输送到第二储存槽3中，当第一储存槽2内的培养基液位低于下限时，该泵45停止运作，如此，该培养基经由通过该培养室11及第一储存槽2与第二储存槽3的回路循环，该循环周期约为30分钟，或是依据细胞附着在实体上所需的期间而更短或更长。
在细胞附着到实体板71的表面之后，关闭溢流阀161并且打开第一控制阀162，而第二控制阀163仍然保持打开的状态，因为在此状态下培养基的液位是在满液位或高于虹吸管6的高度，该培养基则藉由虹吸管6产生的吸力经由排放口14抽取到第一储存槽2中，当液位降低时，暴露出该等实体板71的附着面并且在各实体板71上只停留下一层薄的培养基，重复操作以使该等实体板71间歇地从培养基中暴露出来，一个操作循环的周期约需要30秒的时间，依据在管41及43中一定体积率的流量f1及f2，从液位下降开始到液位上升结束的循环周期可用如下所述来决定的。
如图2所示，h1及h2分别表示培养室11底部至实体板71底部的高度，以及培养室11底部至实体板71顶部的高度，h3是培养室11至虹吸管6的高度，以及h4是培养室11底部至溢流口15的高度，培养基的液位高度为H，在图3中，w为培养室的宽度，1为其长度，当培养基供给到培养室中升高培养基液位时，该虹吸管6并未运作并且在溢流管43的培养基流量f2(除以体积)恒保持于零；在此状态之下当0＜H＜h1，或h2＜H＜h3，该液位的上升速率是由该方程式决定u1＝f1/w1 (1)当h1＜H＜h2，该液位的上升速率是由该方程式决定u1＝f1/w(1-Nd)(2)(此处N为实体板的数目，d为各实体板的厚度)在虹吸管6运作而使培养基液位下降的阶段中，假设在管41及43内的培养基流量f1及f2为常数，在这种情况下，当0＜H＜h1， 或h2＜H＜h3，该液位的下降速率是由该方程式决定u2=f2-f1w1---(3)]]>当h1＜H＜h2，该液位的下降速率是由该方程式决定u2=f2-f1w(1-Nd)---(4)]]>因此，将培养基液位从0升高到h3所需的时间是由该方程式决定t1＝w[(h1+h2+h3)1+(h2-h1)(1-Nd)]/f1(5)以及将培养基液位从h3降低到0所需的时间是由该方程式决定t2＝w[(h1+h2-h3)1+(h2-h1)(1-Nd)]/(f2-f1)(6)结果，从液位下降开始到液位上升结束的循环所需要的总时间为
tp＝t1+t2(7)虽然如以上所述的较佳实施例包括有固定的实体板，藉由升高及降低液位将其间歇地从培养基的液面暴露出来，但是也可以使用向上及向下移动实体板的安排方式来使实体板暴露或浸入培养基中。
权利要求
1.一种培养附着性细胞的装置，包括一个具有入口、出口的细胞培养室、一个设在该细胞培养内的实体装置，及一个用以循环培养基经由该细胞培养室、入口及出口的循环装置，该循环装置连接该入口及出口，其特征在于该循环装置间歇地升高及降低该培养基相对于该实体装置表面的液位，在该实体装置不相对于该培养室移动之下，于一在该实体装置高度上方的高液位与一在该实体装置下方的低液位之间；该循环装置当该培养基达到该低液位时控制该培养基经该入口流入，且当该培养基达到该高液位时控制该培养基经该出口流出。
2.如权利要求1所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置包括一个第一储存槽，该第一储存槽连通该出口且设在比该细胞培养室低的位置处。
3.如权利要求2所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置更包括一个第二储存槽，该第二储存槽其位于该细胞培养室的上游且比该细胞培养室的顶部为高的位置。
4.如权利要求3所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置更包括一个介于该第一及第二储存槽之间的泵。
5.如权利要求4所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置包括一个连接该出口及该第一储存槽，且在该培养基液位到达高液位时产生一吸力的虹吸管。
6.如权利要求5所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置更包括一个连接该出口且控制该培养基液流出量的第一控制阀，及一个连接该入口且控制该培养基液液入该细胞培养室的第二控制阀。
7.如权利要求6所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置更包括一个在该实体装置顶部上方的液位与该细胞培养室连通的溢流管，且该溢流管连接一个溢流阀。
8.如权利要求7所述的培养细胞的装置，其特征在于该循环装置更包括一个监测在该第一储存槽内的培养基液位的装置，且启动该泵运作的均匀分配装置。
9.如权利要求8所述的培养细胞的装置，其特征在于该入口包括一个设在靠近该细胞培养室顶部的第一入口，及一个设在靠近该细胞培养室底部的第二入口。
10.如权利要求9所述的培养细胞的装置，其特征在于该装置更包括用以将气体从该细胞培养室顶部供应到该细胞培养室内的装置。
11.一种培养附着性细胞的方法，包括(a)提供一个具有一个入口、一个出口的细胞培养室，及一个可附着细胞的实体装置；(b)将一培养基送入该细胞培养室内且使细胞附着于该实体装置，其特征在于更包括以下(c)经由该入口及出口循环培养基，且在细胞生长期间交互地升高及降低培养基相对于该实体装置表面的液位，且在该实体装置不相对于该培养室移动之下，于一在该实体装置高度上方的高液位与一在该实体装置下方的低液位之间，以间歇地将细胞沉入培养基且将细胞暴露于一在该培养基液位上方的气体环境；(d)当培养基达到该高液位时控制培养基经该出口流出；及(e)当培养基达到该低液位时控制培养基经该入口流入。
全文摘要
一种附着性细胞培养方法及装置，该装置包括一具入口、出口的细胞培养室、一设在培养室内的实体装置以给细胞附着，及一藉培养室、入口及出口循环培养基的装置。该循环装置间歇升高及降低培养基相对于实体装置表面的液位，在实体装置不相对于培养室移动之下，于一在实体装置高度上方的高液位与一在实体装置下方的低液位之间。该循环装置也可在培养基达到高、低液位时控制其经出、入口流出、入。该方法则是使用该装置以培养细胞。
文档编号C12M3/04GK1168921SQ9711363
公开日1997年12月31日 申请日期1997年6月18日 优先权日1996年6月18日
发明者廖明一, 熊定宇 申请人:廖明一