专利名称：一种快速高效获得抗原特异性b细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种快速高效获得抗原特异性B细胞的方法。
背景技术：
分离、培养及鉴定产生特异性结合某目标抗原的抗体的B细胞的方法在本领域研究中是非常重要的。这种B细胞可以用于制备抗原特异性抗体以及回收编码这种抗体的核酸序列，还可用于抗原结合特性分析等功能测定。抗体由B细胞产生，可以用于鉴定外源性或内源性抗原，如毒素、细菌、病毒、细胞因子、酶等。每种抗体结合于抗原的特定表位。抗体识别特异性表位且与之结合的能力使 抗体成为有用的治疗和诊断工具。目前所使用的，获得免疫系统中针对某种抗原的B细胞，并制备单克隆抗体的方法主要为杂交瘤技术。即用抗原免疫动物，诱导免疫反应，然后用该动物的脾细胞(含大量B细胞)与能无限增殖的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤，通过分泌抗体的抗原特异性检测进行杂交瘤筛选鉴定，获得分泌针对目标抗原抗体的细胞克隆。但是抗原特异性B细胞在脾脏细胞中的“丰度”使分离抗原特异性克隆变得随机性很大。当寻找具体的表位特异性或功能活性的B细胞时，人们希望这一 B细胞经过某种筛选过程，以使获得目的单克隆抗体的成功率变得更大。此外，可在筛选获得的抗原特异性B细胞中克隆抗体的可变区基因序列，将其构建成全长抗体后，在合适的重组蛋白表达系统如哺乳动物细胞或者细菌表达系统中进行表达，直接得到目标单克隆抗体。因此，一种能够快速、高效获得产生针对某抗原特异性抗体的B细胞的方法对于生物学基础研究和抗体相关的诊断和治疗产品的开发是很有价值的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速高效获得抗原特异性B细胞的方法。在本发明的第一方面，提供一种富集目标抗原特异性B细胞(群体)的方法，包括从含有B细胞的群体中富集CD19+/IgG+且能够与目标抗原结合的B细胞，所获得的细胞为目标抗原特异性B细胞。在一个优选例中，所述含有B细胞的群体是含有目标抗原特异性B细胞的群体。在另一优选例中，所述从含有B细胞的群体中富集⑶19+/IgG+且能够与目标抗原结合的B细胞的步骤进行至少一次，如进行1-20次。在另一优选例中，所述的目标抗原是病毒侵染动物体的关键蛋白。在另一优选例中，所述的目标抗原来源于(但不限于)流感病毒，负黏液病毒，疱疹病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，Hiv病毒，手足口病毒。在另一优选例中，所述的目标抗原包括(但不限于)来源于流感病毒的血凝素蛋白(HA)，来源于狂犬病病毒但狂犬病毒G蛋白。
在另一优选例中，利用⑶19结合分子和IgG结合分子来富集⑶19+/IgG+的B细胞。在另一优选例中，以不同的可识别信号来标记所述的⑶19结合分子、IgG结合分子以及目标抗原，从而富集CD19+/IgG+且能够与该目标抗原结合的B细胞。在另一优选例中，所述的可识别信号是荧光标记物，不同的荧光标记物具有不同的激发光波长和发射光波长。在另一优选例中，所述的⑶19结合分子、IgG结合分子和目标抗原可同时加入到含有B细胞的群体中以富集目标抗原特异性B细胞(即CD19结合分子和IgG结合分子、目标抗原组合使用)；或者，所述的CD19结合分子、IgG结合分子和目标抗原分批次加入到含有B细胞的群体以富集目标抗原特异性B细胞(即CD19结合分子、IgG结合分子和目标抗原分开使用)。在另一优选例中，以荧光染料FITC标记⑶19结合分子；以荧光染料APC标记IgG·结合分子；以荧光染料Cy3标记目标抗原。在另一优选例中，所述的以荧光染料Cy3标记目标抗原的步骤包括先将目标抗原与生物素(biotin)偶联，获得目标抗原-生物素偶联物；然后将与荧光染料Cy3偶联的链霉菌亲和素(Streptavidin)与目标抗原-生物素偶联物反应，从而获得以荧光染料Cy3标记的目标抗原。在另一优选例中，所述的⑶19结合分子是抗⑶19抗体；或所述的IgG结合分子是抗IgG抗体。在另一优选例中，采用流式细胞术富集⑶19+/IgG+且能够与该目标抗原结合的B细胞。在本发明的另一方面，提供一种制备目标抗原特异性的抗体的方法，包括(a)从含有B细胞的群体中富集⑶19+/IgG+且能够与该目标抗原结合的B细胞，所获得的细胞为目标抗原特异性B细胞；(b)从(a)的目标抗原特异性B细胞中获得抗体重链可变区基因和轻链可变区基因；(C)将(b)的抗体重链可变区基因和轻链可变区基因分别与重链恒定区基因和轻链恒定区基因连接，从而表达获得目标抗原特异性的抗体。在本发明的另一方面，提供一种用于富集目标抗原特异性B细胞的试剂盒，包括CD19结合分子；IgG结合分子和目标抗原；以及至少三种不同的可识别信号，分别用于标记所述的抗CD 19抗体、抗IgG抗体和目标抗原；或包括分别以三种不同的可识别信号标记的⑶19结合分子，IgG结合分子和目标抗原。在另一优选例中，所述的目标抗原来源于(但不限于)流感病毒，负黏液病毒，疱疹病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒，手足口病毒；或所述的可识别信号是荧光标记物，选自(但不限于)FITC，Cy3，Cy5，APC0在另一优选例中，所述的试剂盒中包括荧光染料FITC标记的⑶19结合分子；荧光染料APC标记的IgG结合分子和荧光染料Cy3标记的目标抗原。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括进行流式细胞术相关的其它试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、HA/RBD(SARS S蛋白受体结合区)蛋白标记生物素(biotin)。(A)HA-biotin活性检测；(B)RBD-biotin活性检测。图2、抗原特异性目的B细胞的流式细胞分选图。
A :45. 9%表示外周血单个核细胞(PBMC)中单核淋巴细胞群，主要包括B细胞和T细胞；B :CD19+和IgG+(即CD19和IgG双阳性)的细胞为记忆性B细胞，占O. 64% ；C : RBD-Fc，同型对照；D HA特异性记忆B细胞，约占总的记忆B细胞O. 61 %。图3、所制备全人单克隆抗体的浓度。其中，1C4 5A6指21株全人单克隆抗体；Vector指仅瞬转表达载体骨架IgH、IgL于293T细胞的情形。图4、ELISA检测所制备全人单克隆抗体对HA蛋白的结合情况。
具体实施例方式本发明人致力于研究快速、高效分离抗原特异性B细胞克隆群体的方法。经过深入研究，揭示了特别适合于鉴别B细胞的表面标志物，并以特定的抗原筛选包含能与该抗原结合的抗体的B细胞。本发明的方法获得的B细胞的克隆群体可用于B细胞功能研究，制备抗原特异性单克隆抗体以及回收编码这种抗体的可变区基因序列。如本文所用，所述的“抗原”是指一种免疫原，其在刺激B细胞群体后，能够使得一些B细胞分泌对该抗原有特异性结合的抗体。所述的抗原例如来源于流感病毒，负黏液病毒，疱疹病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒，手足口病毒等等。如本文所用，所述的“目标抗原”是指感兴趣的抗原，需要分离对该抗原有特异性结合的特异性B细胞。所述目标抗原可以是抗体可结合的任何物质，包括但不限于肽、蛋白质或其片段；碳水化合物；有机和无机分子；由动物细胞、细菌细胞和病毒产生的受体；酶；生物途径的激动剂和拮抗剂；激素和细胞因子。如本文所用，“目标抗原特异性B细胞”是指能产生结合特定目标抗原的抗体的B细胞。如本文所用，所述的“含有B细胞的群体”是指一种混合细胞群体，其中包含有能够分泌对目标抗原有特异性结合的抗体的B细胞群体。所述的含有B细胞的群体例如是从宿主外周血、脾脏等中得到的包含目标B细胞的细胞分离物。如本文所用，“富集”细胞(群体)是指增加包含在混合细胞群体中所需目的B细胞的含量，通常是指提高“目标抗原特异性B细胞”的频率。因此，富集细胞群体指因富集步骤而产生的具有更高频率目标抗原特异性B细胞的细胞群体，但是这种细胞群体内的B细胞可来源于不同的生殖系(Germline),且分泌可变区基因不同的抗体。
如本文所用，“细胞群体”包括富集前和富集后细胞群体，当进行多个富集步骤时，细胞群体可以是富集前和富集后的。每种细胞群体可直接用于下一步骤，可部分或全部冷冻用于长期或短期贮藏并用于随后的步骤。同时，细胞群体的细胞可单独进行悬浮以得到单细胞悬浮液。一种或多种抗原特异性单细胞悬浮液可一起铺板用于进一步分析或分离其产生的抗体。如本文所用，所述的“可识别信号”是指与CD19结合分子、IgG结合分子或目标抗原结合或偶联的、用于指示(或作为指示标志)CD19结合分子、IgG结合分子或目标抗原与B细胞发生结合的信号。本发明提供了分离抗原特异性B细胞的克隆群体的方法，包括从含有B细胞的群体中富集CD19+/IgG+双阳性且能够与目标抗原结合的B细胞，所获得的细胞为目标抗原特异性B细胞。⑶19是B细胞特异性的标记，表达于除浆细胞之外一切B细胞；IgG是已进行亚型转换的成熟B细胞表面标记，因此使用⑶19结合分子(如抗⑶19抗体)和IgG结合分子(如抗IgG抗体)就可以从含有B细胞的群体中分离B细胞(记忆性B细胞)。为了获得·目标抗原特异性的B细胞,因此加上目标抗原作为筛选标记(Marker)。本发明所述方法可用于富集(或分离)至少一种目标抗原特异性B细胞。本发明的方法包括能分开、组合、连续、重复或周期地使用的一系列培养和选择步骤。优选地，本发明的方法用于分离至少一种目标抗原特异性细胞，所述目标抗原特异性B细胞能用于产生对目标抗原有特异性结合的单克隆抗体或编码这种抗体的基因序列。富集带有特定的可识别信号的细胞的方法是本领域技术人员已知的，多种富集细胞的方法均可用于本发明。本发明中，较佳地，通过在CD19结合分子、IgG结合分子或目标抗原上设置不同的可识别信号，根据判读B细胞上存在的可识别信号，来富集细胞群体。根据分选方法的不同，可以选择不同类型的可识别信号。例如，通过流式细胞分选方法富集细胞群体以形成包含至少一种抗原特异性B细胞的富集细胞群体，所采用的可识别信号较佳地为荧光染料，根据荧光染料特定的激发光波长或发射光波长来判读。本发明的方法可以测定任何目标抗原的抗体特异性结合情况。在利用多于一个富集步骤的方法中，在每个富集步骤中使用的目标抗原可以是彼此相同或不同的。使用相同的目标抗原进行多次的富集步骤，可以提高最终的细胞群体中该目标抗原特异性B细胞的比例。针对相同抗原的多个富集步骤可产生大的和/或不同的抗原特异性富集细胞群体；针对不同抗原的多个富集步骤可产生对不同抗原有交叉特异性的富集细胞群体。在本发明的抗体制备方法中，优选在抗原特异性B细胞的克隆群体富集步骤和培养步骤之后制备抗体。本方法包括对从一个或多个分离的抗原特异性细胞中进行抗体可变区基因基因扩增并进行测序的步骤。可使用本领域已知的用于测序的任何方法，对重链、轻链可变区包括互补决定区(OTR)进行测序。在一个实施例中，本发明提供了包括以下步骤的方法a)制备包含至少一种抗原特异性B细胞的细胞群体；b)例如通过流式细胞分选方法富集细胞群体以形成包含至少一种抗原特异性B细胞的富集细胞群体；
c)从富集B细胞群体中分离单个B细胞；且d)测定单个B细胞是否产生针对抗原有特异性的抗体。本发明公开的B细胞选择、分离方案有很多优势，包括但不限于下列首先，已发现当用本方法制备针对目的抗原(如流感血凝素(HA)蛋白)的抗原特异性B细胞时，所获得的抗原特异性B细胞来源于不同的生殖系，能产生结合HA蛋白多种不同表位的抗体。第二，运用本发明的B细胞筛选方案可获得经过体细胞高频突变的成熟B细胞，由其得到的抗体通常具有很高的亲和力。第三，运用本发明的B细胞筛选方案可得到对靶抗原具有高选择性(抗原特异性) 且为IgG亚类的B细胞。第四，本发明B细胞选择方案倾向于可重现地产生具有抗原特异性的抗体序列，所述抗体序列包含了抗体重轻链可变区基因的完整结构，即具有完整的FWR1，FWR2，FWR3，CDRl，CDR2, CDR2, CDR3, D 区和 J 区。总之，本发明方法可通过使用比先前已知的更有效率的方案用于产生对更多不同表位显示更高结合亲和力的抗体。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明以从接种2009年甲型HlNl流感疫苗志愿者体内获得HA蛋白特异性B细胞为例，详细说明本方法具体操作过程。实施例I、HA蛋白表达纯化根据2009 年甲型 HlNl 流感病毒(A/California/7/2009 (HlNl)，购自华兰生物工程股份有限公司)HA蛋白基因组序列，构建表达载体，使用杆状病毒昆虫细胞(Bac-to-Bac)蛋白表达系统进行表达。具体如下I.取得目的基因模板HA的GenBank号为FJ966082. I (由TAKARA公司全基因合成该目的基因模板)。2.引物的设计与合成，加入酶切位点(EcoRI/XhoI)；按照引物设计原则,使用Primer premier5. O软件设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成。序列分别为HA-SP :5’ -CCG |GAATTC| TACTTCCGTTATGATCATC-3j (SEQ ID NO :1)HA-AS :5’ -CCG |CTCGAG| TTAAATACATATTCTAC-3’ (SEQ ID NO :2)引物序列中的方框分别表示限制性内切酶EcoR I和Xho I位点。3.目的基因进行常规方法PCR扩增；按照以下50ul体系加入各反应物并混合均匀
2 XPfu Plus PCR Master Mix(购自 TIANGEN) 25 μ 引物1+lul
模板Ιμ
ddH2022μ1将加好的反应体系按下列反应条件进行PCR扩增94°C，5min ;(94°C，45sec ；55°C,45sec ；72°C,2min ；32 循环)；72°C,5min ;4°C，终止。4.扩增产物用限制性内切酶EcoR I (TAKARA)和Xho I (TAKARA)酶切然后割胶回收；5. pFastBac-HTb 质粒(购自 Invitrogen)使用限制性内切酶 EcoR I (TAKARA)和Xho I (TAKARA)酶切，然后割胶回收；·6.目的基因与载体的连接，获得pFastBac-HA-His ；7.感受态DH5a (购自Transgen)的转化、涂板、挑克隆、摇菌；8.菌液PCR验证；9.小量抽提质粒(试剂盒购自TIANGEN)；10.测序，经BLAST验证，100%匹配；11.感受态DHlOBac的重组转位、涂板、挑克隆、摇菌；12.菌液PCR验证，采用Ml3通用引物，序列为M13-SP :5’ -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’ (SEQ ID NO 3)M13-AS :5，-AGCGGATAACAATTTCACACAAGG-3’ (SEQ ID NO 4)13.常规方法进行Bacmid粘粒的大量抽提与纯化。I. 2、HA-His蛋白的细胞表达I. 2. I病毒包装，脂质体细胞转染(6孔板)I. 2. I. I转染前一天铺板，3孔(9父105个/孔)。I. 2. I. 2首先观察High Five细胞(购自Invitrogen),细胞长至50-80%可以转染。I. 2. I. 3在6个I. 5ml离心管中各加入ΙΟΟμ I的Sf900II SFM(沿管壁加，不要有气泡)，6个离心管中分为3个A管，3个B管。1.2. I. 4在B管中加入10 μ I的脂质体，加进去后用抢轻轻吹打混匀。I. 2. I. 5在A管中加入4 μ g的质粒(Bacmid粘粒)，同样用移液枪轻轻吹打混勻。I. 2. I. 6待前面两步全部加完后，在用手指轻弹一下，保证充分混匀。I. 2. I. 7用微量移液器将A管中的液体全部转移至B管中，吸A管中的液体时，注意用抢混匀，吹时沿着管壁减少气泡的产生，转移至B管中后在用微量移液器上下吹打几次，保证混匀。1.2. I. 8 静置 15 分钟。I. 2. I. 9取IOOOml微量移液器在I. 5ml离心管中补加入800 μ I Sf900II SFM，共约Iml左右。I. 2. I. 10用吸管吸去六孔板之前的培液，用微量移液器沿孔壁慢慢加入Iml的混合物(加液体的时候速度要慢)，盖上盖子，做好标记。I. 2. I. 11放入37°C培养箱继续培养。I. 2. I. 12培养6-8小时后，将转染液吸去，重新换新鲜的培养液(Sf900IISFM)3ml。I. 2. I. 13继续培养72小时。I. 2. I. 1472小时后，开始收细胞上清(第一代重组杆状病毒)和细胞裂解液。3000rpm离心5min，将细胞上清，即第一代病毒冻存于_70°C ;将离下的细胞加入细胞裂解液，充分振荡使细胞裂解，或超声若干次(5秒一次)，100°C反应五分钟，冻存于_20°C。I. 3、HA-His 蛋白的纯化 ①前期预处理20mM PB (pH 5. 89)透析过夜，O. 45mm孔径膜抽滤；②纯化方法先后以Q-FF柱和SP柱(购自GE Healthcare)串联纯化利用羟基磷灰石填料柱(购自Bio-rad)进行精细纯化；③Q-FF与SP串联纯化后，用SDS-PAGE检测纯化效果，如图IA (SDS-PAGE)和B (Western Blot)。Q-FF柱和SP柱串联纯化方法①平衡柱子，使用Buffer A (Buffer A :20mM磷酸钠，I. OmM EDTA，0. 01%表面活性剂-NP9，5%丙三醇，pH 5. 89)进行平衡，3ml/min流速，直至吸光值平稳，约10个柱体积；②上样，暂停纯化仪，将进液管从Buffer A中取出，插入预处理好的样本中，2ml/min流速进行上样，并收集穿透；③再平衡，当样品上样完毕时，将进液管取出，放入Buffer A中，2ml/min流速直至吸光值再次平稳；④使用Buffer B (20mM磷酸钠，O. 03 % Tergitol (表面活性剂)，5 %丙三醇，pH
7.02)洗脱，并收集洗脱样本，直至吸光值平稳；⑤使用Buffer C(20mM 磷酸钠，150mM NaCl，O. 03 % Tergitol，5 % 丙三醇，pH
7.02)洗脱，并收集洗脱样本，直至吸光值平稳；⑥最后用O. 5M氢氧化钠清洗柱子上的所有杂蛋白，不收集。羟基磷灰石填料柱纯化方法⑦平衡柱子，使用buffer B进行平衡，3ml/min流速，直至吸光值平稳，约10个柱体积；⑧上样，暂停纯化仪，将进液管从buffer B中取出，插入预处理好的样本中，2ml/min流速进行上样，并收集穿透；⑨再平衡，当样品上样完毕时，将进液管取出，放入buffer B中，2ml/min流速直至吸光值再次平稳；⑩使用bufferD (40mM 磷酸钠，O. 05% Tween-20，5% 丙三醇，pH 7.20)洗脱，并收
集洗脱样本，直至吸光值平稳；(11)使用 buffer E (IOOmM 磷酸钠，O. 05% Tween-20，5%丙三醇，pH 7. 20)洗脱，
并收集洗脱样本，直至吸光值平稳；(12)最后用O. 5M氢氧化钠清洗柱子上的所有杂蛋白，不收集。实施例2、HA蛋白生物素标记以及检测
I、HA蛋白生物素标记(I)根据Sulfo-NHS-LC-Biotin手册(Pierce)计算加入生物素试剂的量按照每mo I蛋白对应20mol生物素计算，Iml O. 3mg/ml的HA蛋白需要生物素(IOmM)试剂量
权利要求
1.一种富集目标抗原特异性B细胞的方法，其特征在于，包括从含有B细胞的群体中富集CD19+/IgG+且能够与目标抗原结合的B细胞，所获得的细胞为目标抗原特异性B细胞。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的目标抗原是病毒侵染动物体的关键蛋白。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的目标抗原来源于流感病毒，负黏液病毒，疱疫病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒,手足口病毒。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，利用CD19结合分子和IgG结合分子来富集CD19+/IgG+的 B 细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，以不同的可识别信号来标记所述的CD19结合分子、IgG结合分子以及目标抗原，从而富集CD19+/IgG+且能够与该目标抗原结合的B细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以荧光染料FITC标记CD19结合分子；以荧光染料APC标记IgG结合分子；以荧光染料Cy3标记目标抗原。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的CD19结合分子是抗CD19抗体；或所述的IgG结合分子是抗IgG抗体。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，采用流式细胞术富集CD19+/IgG+且能够与该目标抗原结合的B细胞。
9.一种制备目标抗原特异性的抗体的方法，其特征在于，包括 (a)从含有B细胞的群体中富集CD19+/IgG+且能够与该目标抗原结合的B细胞，所获得的细胞为目标抗原特异性B细胞； (b)从(a)的目标抗原特异性B细胞中获得抗体重链可变区基因和轻链可变区基因； (C)将(b)的抗体重链可变区基因和轻链可变区基因分别与重链恒定区基因和轻链恒定区基因连接，从而表达获得目标抗原特异性的抗体。
10.一种用于富集目标抗原特异性B细胞的试剂盒，其特征在于，包括 CD19结合分子；IgG结合分子和目标抗原；以及至少三种不同的可识别信号，分别用于标记所述的抗CD19抗体、抗IgG抗体和目标抗原； 或包括 分别以三种不同的可识别信号标记的CD19结合分子，IgG结合分子和目标抗原。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述的目标抗原来源于流感病毒，负黏液病毒，疱疫病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒，手足口病毒；或 所述的可识别信号是荧光标记物，选自FITC，Cy3，Cy5，APC0
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，其中包括 荧光染料FITC标记的CD19结合分子；荧光染料APC标记的IgG结合分子和荧光染料Cy3标记的目标抗原。
全文摘要
本发明涉及一种快速高效获得抗原特异性B细胞的方法。提供了特别适合于鉴别B细胞的表面标志物，并以特定的抗原筛选包含能与该抗原结合的抗体的B细胞。本发明的方法可快速、高效获得抗原特异性B细胞。
文档编号C12N15/13GK102839152SQ201110165320
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者孙兵, 陈爱中, 边超, 王凌凌 申请人:中国科学院上海生命科学研究院