专利名称：控制玉米穗粗主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米育种和分子生物学领域，通过利用与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，从而利用其对玉米穗粗进行分子标记辅助选择。
背景技术：
玉米是重要的口粮和饲料作物，我国玉米的产量对国家的粮食安全影响很大。玉米育种的理论和实践证明，自交系的产量与其杂交种的产量密切相关(Richey，1946)。而在特定种植密度下，玉米杂交种单位面积的产量由玉米单穗籽粒产量与穗数组成，而单穗籽粒产量又与穗的直径，即穗粗正相关，因此，穗粗性状与玉米产量显著正相关(刘纪麟， 2000)，探明穗粗形成的遗传机理有助于阐明玉米产量性状形成的遗传机理，选育具有大穗型的杂交种是提升我国玉米单位面积产量的一种可行办法。玉米穗粗性状受环境因素影响较小，因此，该性状是理想的分子育种改良性状。玉米穗粗是决定玉米产量的关键性状，它是一种数量性状，受到多个基因的控制。已有多个定位的穗粗相关QTL得到了定位(M^ Rramene. org)。DNA分子标记的研究始于1980年，Bostein等(1980)首先提出了利用RFLP标记构建遗传连锁图，随后几十年，又相继出现了 SSR、AFLP, RAPD, CAPS、SCAR、SNP等几十种分子标记，因为分子标记存在以下优点而备受遗传学家青睐(1)不受季节、环境、基因表达与否的限制；( 多态性高，存在着丰富的等位变异；C3)数量丰富，多态性遍及整个基因组；许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。QTL定位是通过数量性状的表型值与分子标记间的关联分析，即当标记与特定性状连锁时，不同标记基因型个体的表型值间存在显著性差异，以此来确定各个数量性状位点在染色体上的位置和效应，甚至各个QTL间的互作效应(Tanksley，1993)。在QTL分析过程中，首先选择两个在影响目标性状的等位基因间存在差异的亲本材料，然后利用这两个亲本创造一个大的作图群体，分析群体中每个个体的表型值和多位点的基因型，构建两个材料之间的一个多态性遗传图谱用于遗传分析，确定QTL在染色体上的相对位置，并估计 QTL的有关遗传参数(Mauricio，2001)。目前尚未有与控制玉米穗粗主效QTL相连锁的分子标记报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供控制玉米穗粗主效QTL的分子标记及其在分子标记辅助选择的应用，通过检测这些分子标记可以预测玉米穗粗，加快玉米的育种进度。本发明一方面涉及一种控制玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，用玉米DNA，分别采用PCR引物对左端弓丨物5，CAAAAGGTTTTGAATTAAAATATCCGA 禾口右端弓丨物 5， CAAAGGCAAGAACTCTAGCATGAA左端引物5，ACGACAAGAAGGAGGCCAAAG 和右端引物 5，CAAGTAGATCGATCGAGCAGCAG
进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳分离后，分别获得分子标记和 umc2088。在本发明的一个优选实施方式中，所述的凝胶是指6%聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在所所述的玉米品种为黄C和/或许 178。本发明另一方面还涉及上述分子标记的应用，其特征在于将分子标记和umc2088用于玉米的基因型检测，以判断玉米穗粗。在本发明所述的应用的一个优选实施方式中，将黄C和/或许178为父本或母本与其他玉米杂交并繁衍至F2代以上，提取它们的DNA，然后用^ic 1861和umc2088的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，评判这2个标记是否存在，来预测所获得品种或品系的穗粗。
图1是SSR标记umcl861、umc2088对亲本黄C和许178单株6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果；图2是SSR标记umcl861、umc2088对亲本黄C和许178单株琼脂糖凝胶电泳检测结果；图3是SSR标记umc2088对亲本黄C、许178和F2群体随机挑选单株6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；图4是SSR标记umcl861、umc2088与穗粗主效QTL qED2a连锁图(图距单位为 cm) ο
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如《分子克隆》第三版，或根据试剂厂商所建议的条件。亲本黄C和许178杂交得到Fl代，Fl自交得到F2代。F2代单株幼苗期(5片真叶其以后)取少量叶片，利用玉米DNA的小量快速提取方法(杜何为等，2004)，提取F2单株基因组DNA。采用下述引物扩增黄C、许178以及F2分离DNA，利用6%聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳获得分子标记umcl861 左端引物5，CAAAAGGTTTTGAATTAAAATATCCGA ；右端引物5，CAAAGGCAAGAACTCTAGCATGAA采用下述引物扩增黄C、许178以及F2分离DNA，利用6%聚丙烯酰胺凝胶和1 % 琼脂糖凝胶电泳获得分子标记umc2088 左端引物5，ACGACAAGAAGGAGGCCAAAG右端引物5，CAAGTAGATCGATCGAGCAGCAG扩增玉米优良自交系农大108(黄CX许178)的F2分离群体单株，其与所在玉米第一条染色体2. 04bin区段鉴定出玉米穗粗主效QTL，贡献率为13. 9%。
利用以上分子标记umc1861、umc2088，扫描F2分离群体，对每一个F2单株进行基因型分析。PCR 体系模板 DNA30-50ng，引物 5umol/L，dNIPs 为 200umol/L，2mmol/L MgCl2, IX Taq Buffer,0. 5U iTaqDNA聚合酶，IOul的总反应体系。TaqDNA聚合酶购于上海生工生物工程有限公司。PCR反应程序为94°C 5min ；35 个循环，94°C 30sec, 58°C 45sec，72°C 45sec ； 72°C5min。上述标记的检测方法为改进的6%的变性聚丙烯酰胺凝胶检测。IXTBE为电泳缓冲液，80W的恒定功率，电泳1小时。电泳后进行银染，银染的方法为利用超纯水洗一分钟；1. 5L超纯水加入3g AgN03为染色液，染色10分钟；超纯水清洗30秒；显色液为1. 5L 超纯水，加入30gNa0H、0. 6g无水Na2C03以及7. 5ml甲醛，显色10分钟，用清水冲洗。表型考察为成熟后收回玉米果穗，人工脱粒后量穗直径。利用MapMaker软件进行连锁图构建，WinQTLCart 2. 5复合区间作图法进行QTL的扫描定位。本发明利用优良自交系黄C和许178杂交得到的F2代分离群体鉴定出穗粗QTL qED2a，利用F2代多代回交获得重组自交系，利用玉米IBM2008分子标记umcl861、umc2088 筛选交换单株，利用玉米基因组测序计划释放的玉米自交系B73的BAC序列，扩增SSR位点，筛选在黄C和许178之间存在多态性的SSR位点，进行标记的开发。基于以上结果，2009 年利用152份重组自交系，将qEDh定位到5. OcM以及4. 2cM范围内，分子标记连锁图如图 4所示。本发明应用优良自交系黄C和许178杂交得到的F2代分离群体来进行穗粗QTL 的定位，开发与穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记。本发明使用的遗传材料为黄C和许178 杂交得到的F2家系分离群体和连续多代自交获得的重组近交系。亲本许178的穗粗为 3. 3-3. 6cm,亲本黄C的穗粗为4. 0-4. 6cm2004-2005年，以黄C和许178杂交得到的F2代分离群体为材料，在河南省郑州市和新郑市两地进行穗长、穗粗、穗行数、行粒数、穗粒重和百粒重等6个产量性状的考查， 共鉴定了 53个QTL，其中在两地均检测到的QTL有5个，表现出大量的QTL与环境的互作。 在第二染色体的2. 04bin的Umcl861-umc2088(L0D = 5. 4，R2 = 13. 9% )区段，多点试验证实鉴定了 1个与穗粗、产量等相关的主效QTL，该QTL由来自黄C的位点起增效作用。2008年、2009年，在河南郑州和浚县进行了重组自交系的QTL验证，两年两点的定位结果共同将QTL定位到toicl861-umc2088之间，其遗传距离分别为5. OcM和4. 2cM,附图 1为分子标记与QTL连锁情况。该区段QTL效应分别为2008年郑州R2 = 9. 5%,浚县R2 = 11. 6% ；2009 年郑州 R2 = 9. 6%，浚县 R2 = 12. 4% (WinCatographer 2. 5)。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种控制玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，用玉米DNA，分别采用PCR引物对左端弓丨物5，CAAAAGGTTTTGAATTAAAATATCCGA 禾口右端弓丨物 5， CAAAGGCAAGAACTCTAGCATGAA左端引物 5 ’ ACGACAAGAAGGAGGCCAAAG 和右端引物 5，CAAGTAGATCGATCGAGCAGCAG进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳分离后，分别获得分子标记和umc2088。
2.根据权利要求1所述的控制玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于 所述的凝胶是指6%聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳。
3.根据权利要求1所述的控制玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在所所述的玉米品种为黄C和/或许178。
4.一种如权利要求1至3任意一项所述的分子标记的应用，其特征在于将分子标记 Umc 1861和umc2088用于玉米的基因型检测，以判断玉米穗粗。
5.根据权利要求3所述的分子标记的应用，其特征在于将黄C和/或许178为父本或母本与其他玉米杂交并繁衍至F2代以上，提取它们的DNA，然后用^ic 1861和umc2088的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，评判这2个标记是否存在，来预测所获得品种或品系的穗粗。
全文摘要
本发明公开了一种控制玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记Umc1861和Umc2088，该分子标记可以用于玉米及其衍生品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系穗粗，提高选择的准确性和育种效率。
文档编号C12Q1/68GK102220322SQ201110165009
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者丁冬, 付志远, 刘宗华, 李卫华, 汤继华, 胡彦民 申请人:河南农业大学