一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于干细胞组织工程领域及神经生物学领域，具体涉及一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法。
【背景技术】
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[0002]青光眼是一组威胁和损害视神经及其视觉通路，最终导致视觉功能损害，主要与病理性眼压升高有关的临床征群或眼病。其视神经病变的特征是视网膜神经节细胞(RGC)的渐进性丧失以及其轴突与大脑中枢连接的损害。目前临床上降低眼内压的主要治疗，虽可以减缓疾病进展，但并不能完全阻止病情的进一步发展，尤其是对于晚期青光眼的患者更是收效甚微。因此，有必要寻找一种新的治疗策略，减缓或阻止进行性的RGC损害。
[0003]现已有许多研究通过运用干细胞及组织工程学技术，对青光眼神经保护和细胞替代两方面进行了积极的尝试并取得了较大进展。但干细胞移植中存在诸多复杂和关键的问题:如细胞生长部位难以精确控制；移植细胞不能完全生长分化且难以与宿主细胞有效整合，形成功能性突触链接;移植入眼内的细胞存活率较低等等。将干细胞和组织工程学有机结合，可增进或改善视网膜受损组织修复的形态及功能为确保移植体系的质量，有必要对接种于组织支架进行体外培养分化的细胞进行形态及功能的评估和检测。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，利用该方法可以直接反映神经支架上生长的神经样细胞钠离子通道蛋白的表达情况，为后续功能电位的检测奠定基础并提供依据，可作为神经支架功能评价的一项重要指标。
[0005]本发明的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行培养，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基;对培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞进行钠离子通道检测，检测其神经基础功能。
[0007]所述的诱导分化培养基为:每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2supplement lng、非必须氨基酸lng、肝素2yg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1:1混合而成。
[0008]所述的培养是在37°C、5 % C02，饱和湿度下进行培养。
[0009]所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。
[0010]所述的钠离子通道检测是将神经样细胞在组织膜片培养条件下，进行钠离子通道蛋白的免疫荧光鉴定。具体优选是将培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞，吸除其培养基，用PBS洗涤后，用固定液固定，再弃固定液，用PBS洗涤，然后加入PB液，打孔封闭，孵育一抗、二抗、然后DAPI染核，置于载玻片上，加入抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上，活细胞显微镜下观察细胞钠离子通道染色。
[0011]本发明人团队前期已成功将人源性的iPSc细胞诱导分化为人iPSc源性的3D视网膜(Xiufeng Zhong,et al.Generat1n of three-dimens1nal retinal tissue withfunct1nal photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014 Jun 10;5:4047)。本发明将hiPSC来源的三维视网膜组织中的神经层细胞接种于PLGA组织膜片，构建了一个人iPS源性的可降解神经支架。通过前期实验观察发现，同一批神经层细胞分别接种于PLGA膜片及普通盖玻片上，其生长分化的形态并不完全相同。因此对该体系的评估，选择直接对PLGA膜片上培养的神经细胞进行钠离子通道免疫荧光染色，更加真实的反映组织膜片上细胞的状态，为进一步对膜片上细胞进行膜片钳检测功能电位提供依据及基础。
【附图说明】
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[0012]图1是本发明对PLGA膜片上细胞进行了DAPI染色，细胞核呈蓝色荧光，可显示细胞核的位置及形态；
[0013]图2是本发明PLGA膜片上的细胞在诱导分化前经GFP转染，细胞呈绿色荧光，可显示细胞整体形态；
[0014]图3是本发明对PLGA膜片上的细胞进行了Ant1-Nav1.1抗体染色，钠离子通道蛋白呈红色荧光，可显示细胞钠离子通道蛋白是否表达，表达位置等；
[0015]图4是本发明将PLGA膜片上同一视野下细胞的免疫荧光的不同彩色通道图像进行合成，即将同一视野下细胞核的蓝色荧光图像、细胞的绿色荧光图像及钠离子通道蛋白的红色荧光图像合并，在同一副图中显示钠离子通道蛋白的表达情况。
【具体实施方式】
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[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0017]实施例1:
[0018]一、人iPSc源性的3D视网膜分离消化:
[0019]1、采用机械分离的办法，将培养50-60天的人iPSc源性的3D视网膜(具体制备方法参考文南犬:Xiufeng Zhong,et al.Generat1n of three-dimens1nal retinal tissuewith funct1nal photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014Jun 10；5:4047)的神经纤维层放入D-Hanks液中，于50倍正置显微镜下使用0.45mm针头分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分(色素层)，保留金黄色的组织部分(神经纤维层)；将分离的神经纤维层组织使用移液管转移至3.5cm培养皿，使用PBS冲洗10分钟；吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞，置于37°C培养箱中30min;过程后期可将细胞吸入离心管吹打，在10倍正置显微镜下见细胞团被消化成单细胞后加入2ml诱导分化培养基终止消化。将混悬液离心(1000转/5min)后吸出上清，得到种子细