专利名称：金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌致病力强弱主要取决于其产生的侵袭性酶和毒素，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。能引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、 热、肾小球肾炎等变态反应。国际上通用的金黄色葡萄球菌采用培养检测如下(I)样品处理无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成KT1稀释液。(2)增菌培养将KT1稀释液接入7. 5% NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。(3)分离培养将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24 48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形,直径2 3mm,颜色灰或黑色,周围有一浑池带。⑷染色观察从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0. 5 I i! m。(5)血浆凝固酶试验吸取0. 5mL兔血浆与0. 5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。(6)耐热核酸酶试验将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36± I°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。国际上通用的溶血性链球菌采用培养法检测如下(I)样品处理
取25g固体(或25mL液体)检样加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。(2)分离培养吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线于血平板(如检样污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤)，36°C培养24h，接种血平板，36°C培养24h，挑起こ型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验。链激酶试验吸取草酸钾血浆0. 2mL，加0. 8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18 24小时36°C肉浸液肉汤培养物0. 5mL及0. 25%氯化钙0. 25mL,混匀，置于36°C水浴lOmin，血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24小时后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。杆菌肽敏感试验取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有 0. 04单位的杆菌肽纸片置于上述平板上，36 °C培养18 24小时，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。根据上述通用方法，同时检测样品中金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌这两种细菌的周期长(至少48小吋)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点已远远不能满足快速检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供ー种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，解决现有技术中同时检测金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌灵敏的低，周期长等技术问题，以及金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测方法。本发明是这样实现的， ー种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID N01所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO 2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQID NO :3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示，溶血性链球菌探针序列如SEQ ID NO :6所示。本发明进一歩提供ー种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法，包括如下步骤提供金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；进行荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用前述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒。 本发明金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法能同时检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测。
图I是本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒中阳性对照PCR扩增图；图2是本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒阴性对照PCR扩增图；图3是本发明实施例一金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试方法中阳性样本PCR扩增图；图4是本发明实施例一金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试方法中阴性样本PCR扩增图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。本发明实施例提供一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液,所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石腊,所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID NO :1所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ ID NO :3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示，溶血性链球菌探针序列如SEQ ID NO :6所示。具体地，本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其中包括DNA提取液、PCR反应液，可以同时进行金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的检测，该试剂盒中还包括金葡-溶链(即金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌)阴性对照及阳性对照。试剂盒的规格为阴性对照为I管，40iU/管，阳性对照为I管，40iU/管，DNA提取液为5ml/管(共I管)，PCR反应液为8管/条X 6条，20 iil/管。该阴性对照为不含有金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌基因的Tris-EDTA缓冲液(0. OlM pH8. 0);还包括金葡-溶链(即金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌)阳性对照，该阳性对照为使用金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和DNA提取制备的阳性模板对照品，使用Tris-EDTA缓冲液(0. OlM pH8. 0)稀释后冷冻保存该阴性和阳性对照用于检测时的自我检验，防止检出误差的出现，请参阅图I和图2，图I显示试剂盒中阳性对照的PCR扩增图谱，图2显示试剂盒中阴性对照的PCR扩增图谱。
具体地，该DNA提取液(用于提取DNA)具体成分为Tris_EDTA缓冲液(0. OlMpH8. 0)，含 0. 01% NP-40。具体地,该PCR反应液包括第一反应、第二反应液及石蜡,该第一反应液和第二反应液通过石蜡实现分隔，在PCR反应过程中，由于温度在95°C，石蜡融化，第一反应液和第ニ反应液混合，PCR反应得以进行，该石蜡的具体内容见专利(200910190112. 7)。该PCR反应液存放于普通离心管中，该第一反应液位于下端，石蜡位于中间，该第二反应液位于石蜡上面。具体地，该第一反应液包括缓冲液，氯化镁，dNTPs，金黄色葡萄球菌第一引物、第ニ引物及探针，溶血性链球菌第一引物、第二引物及探针，以及，灭菌超纯水，第一反应液的体积为18微升/管。该缓冲液为10 XBuffer，该缓冲液(宝生物工程(大连)有限公司)中不含有镁离子。该缓冲液的体积为2 4微升/管； 该该氯化镁的浓度为25mM，该氯化镁的体积为2 4微升/管；该dNTPs的浓度2. 5mM,体积为2 4微升/管；该金黄色葡萄球菌第一引物的浓度为50 u M，体积为0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，该金黄色葡萄球菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，具体为5，-CTGCGACATTAATTAAAGCGAT-3，-；该金黄色葡萄球菌第二引物的浓度为50 u M，体积为0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，该金黄色葡萄球菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，具体为5’ -AGGATGCTTTGTTTCAGGTG-3’ ；该金黄色葡萄球菌探针的浓度为50 u M，体积为0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，该金黄色葡萄球菌探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，具体为5’ -(FAM)ACCAATGACATTCAGACTATT(DABCYL)-3’ ；该溶血性链球菌第一引物的浓度为50 u M，体积为0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，该溶血性链球菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，具体为5， -TCGAGTTAACCTAGAGCGTTCATTG-3，；该溶血性链球菌第二引物的浓度为50iiM，体积为0. I 0.2微升/管，例如0. 15微升/管，该溶血性链球菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，具体为5’ -GTCATCATCTAGGCTGATA-3’ ；该溶血性链球菌探针的浓度为50 U M，体积为0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，该溶血性链球菌探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示,具体为5，-(HEX)GGCATTGTGGGTTCCGCGACACC (DABCYL)-3，；该灭菌超纯水的量为4. 8 11. 4微升/管，实现第一反应液的体积为18微升/管。具体地,该第二反应液包括Taq酶、显色剂及灭菌超纯水,该第二反应液的体积为
2微升/管。该Taq酶的体积为0. 15-0. 3微升/管，显色剂的体积为0. 01-0. 02微升/管，该显色剂例如溴酚兰。该灭菌超纯水的量为I. 68 I. 84微升/管，使第二反应液的体积满足2微升/管。
具体地，该石蜡的体积为20微升/管。本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒能同时检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测。本发明实施例进一步提供一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法，包括如下步骤步骤SOl，增菌培养和标本处理提供金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；步骤S02，实时荧光PCR
进行实时荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用上述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒。具体地，步骤SOl在无菌条件下操作。具体地，步骤SOl中，具体地，步骤SOl中，采集样本，该样本中可能含有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，也可能不含有，需要本发明实施例的检测方法进行检测确定。因此，本步骤的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品中可能含有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA，也可能不含有。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反复抽吸3次充分混匀标本。具体地，步骤S02中，取步骤SOl中所得到的上清液，进行荧光定量PCR分析，本步骤中所使用的荧光定量PCR设备没有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon2) >Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycIer>Corbett Rotor-Gene>杭州博日系列。步骤S02中PCR反应的条件为50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循环)。本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法中，每次检测都设置试剂盒中的阳性对照和阴性对照，以防止检测过程中污染的出现。以下结合具体实施例对上述金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法进行详细说明。实施例一本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法包括如下步骤I、采集金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，一些样本没有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；
2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为第一反应液
缓冲剂2微升/管
氯化镁2微升/管
dNTPs2微升/管
金黄色葡萄球菌第一引物0.1微升/管 金黄色葡萄球菌第二引物0.1微升/管
金黄色葡萄球菌探针0.1微升/管
溶血性链球菌第一引物0.1微升/管
溶血性链球菌第二引物0.1微升/管
溶血性链球菌探针0.1微升/管
灭菌超纯水11.4微升/管；
石蜡20微升/管第二反应液Taq 酶0. 15 微升 / 管显色剂0.01微升/管灭菌超纯水I. 84微升/管； 在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循环)。实施例ニ本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法包括如下步骤I、采集金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，一些样本没有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为第一反应液缓冲剂3微升/管
氯化镁3微升/管
dNTPs3微升/管
金黄色葡萄球菌第一引物0.15微升/管
金黄色葡萄球菌第二引物0.15微升/管
金黄色葡萄球菌探针0.15微升/管
溶血性链球菌第一引物0.15微升/管
溶血性链球菌第二引物0.15微升/管 溶血性链球菌探针0.15微升/管
灭菌超纯水8.1微升/管；
石蜡20微升/管第二反应液Taq 酶0. 2 微升 / 管显色剂0.015微升/管灭菌超纯水L 785微升/管；在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S,55-60°C 40-80S ； (40 循环)。实施例三本发明实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法包括如下步骤I、采集金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，一些样本没有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 u L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为第一反应液缓冲剂4微升/管
氯化镁4微升/管
dNTPs4微升/管
金黄色葡萄球菌第一引物0.2微升/管
金黄色葡萄球菌第二引物0.2微升/管
金黄色葡萄球菌探针0.2微升/管
溶血性链球菌第一引物0.2微升/管 溶血性链球菌第二引物0.2微升/管
溶血性链球菌探针0.2微升/管
灭菌超纯水4.8微升/管；
石蜡20微升/管第二反应液Taq 酶0. 3 微升/管显色剂0.02微升/管灭菌超纯水1.68微升/管；在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测50-55 0C 2-5min ；94-95 °C 2-3min ；94-95°C 5-10S,55-60°C :40_80S ； (40 循环)。对比例本对比例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法包括如下步骤I、采集金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的样本(对比例中的样本和实施例中的样本一致)，将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；2、按照前面背景技术所讲的国际通用方法进行检测。请參阅下表，下表显示应用实施例ー和对比例的方法检测20例样本的结果
权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQID NO: I所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ ID NO :3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示,溶血性链球菌探针序列如SEQ ID N0:6所示。
2.如权利要求I所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液还包括灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs。
3.如权利要求I所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液包括Taq酶、灭菌超纯水及显色剂。
4.如权利要求I所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液和第二反应液通过所述石蜡分隔开。
5.如权利要求3或4所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液各组分体积为缓冲剂2~4微升/管氯化镁2 ~ 4微升/管 dNTPs2~4微升/管金黄色葡萄球菌第一引物0.1~0.2微升/管金黄色葡萄球菌第二引物0.1~0.2微升/管金黄色葡萄球菌探针0.1 ~ 0.2微升/管溶血性链球菌第一引物0.1~0.2微升/管溶血性链球菌第二引物0.1 ~ 0.2微升/管溶血性链球菌探针0.1 ~ 0.2微升/管灭菌超纯水4.8 ~ 11.4微升/管。
6.如权利要求3、或4所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液各组分体积为 Taq酶O. 15 O. 3微升/管 显色剂O. 01 O. 02微升/管 灭菌超纯水1.68 I. 84微升/管。
7.一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法，包括如下步骤 提供金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品； 进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测步骤中使用如权利要求1-7任一项所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒。
8.如权利要求7所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S ；55-60 °C 40-80S ； 40循环。
全文摘要
本发明适用于微生物技术领域，提供了一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括DNA提取液、PCR反应液。本发明金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法能同时检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测。
文档编号C12R1/46GK102766680SQ20121006817
公开日2012年11月7日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者卢柳燕, 吴成贡, 汪再兴, 田仁鹏, 黄娟, 龚剑 申请人:深圳市生科源技术有限公司