专利名称：粘附性大肠杆菌检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种粘附性大肠杆菌检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
粘附性大肠杆菌(enteroadhesive E. Coli,EAEC)是近年来才熟知,具体致病的血清型尚未完全清楚。EAEC不侵入肠上皮细胞，不产生肠毒素LT、ST或志贺样毒素，因此不引起组织损伤。唯一特征为具有与Hep-2细胞粘附的能力。EAEC多侵犯小儿，流行中以小儿为主，成人亦可发病，易引起腹泻迁延慢性化。临床表现多无发热，腹泻3 5次/日，大便多为稀蛋花样或带奶瓣样，量多，严重者可出现肠麻痹和粘液血样大便。 国际上通用的粘附性大肠杆菌采用培养检测如下(I)增菌样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎Imin或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36± 1°C培养6h。挑取I环,接种于I管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42°C培养18h。(2)分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36土 1°C培养18 24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。(3)生化试验①自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼月旨(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、PH7. 2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36 °C培养过液。②TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性和尿素阴性的培养物为大肠杆菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠杆菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。(4)血清学试验用粘附性大肠杆菌多价O血清做玻片凝集试验，如呈现强凝集反应，即为试验阳性。(5)结果报告综合以上生化试验、血清学试验作出报告。根据上述通用方法，同时检测样品中粘附性大肠杆菌这三种细菌的周期长(至少48小时)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点已远远不能满足快速检测粘附性大肠杆菌的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种粘附性大肠杆菌检测试剂盒，解决现有技术中同时检测粘附性大肠杆菌灵敏的低，周期长等技术问题，以及粘附性大肠杆菌的检测方法。本发明是这样实现的，一种粘附性大肠杆菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括粘附性大肠杆菌第一引物、粘附性大肠杆菌第二引物、粘附性大肠杆菌探针，所述粘附性大肠杆菌第一引物序列如SEQ IDNO :1所示，粘附性大肠杆菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，粘附性大肠杆菌探针序列如 SEQ ID NO 3 所示。本发明进一步提供一种粘附性大肠杆菌检测方法，包括如下步骤提供粘附性大肠杆菌的DNA样品； 进行荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用前述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒。本发明粘附性大肠杆菌检测试剂盒及检测方法能同时检测粘附性大肠杆菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于粘附性大肠杆菌的检测。
图I是本发明实施例粘附性大肠杆菌检测试剂盒中阳性对照PCR扩增图；图2是本发明实施例粘附性大肠杆菌检测试剂盒阴性对照PCR扩增图；图3是本发明实施例一粘附性大肠杆菌检测试方法中阳性样本PCR扩增图；图4是本发明实施例一粘附性大肠杆菌检测试方法中阴性样本PCR扩增图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。本发明实施例提供一种粘附性大肠杆菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括粘附性大肠杆菌第一引物、粘附性大肠杆菌第二引物、粘附性大肠杆菌探针，所述粘附性大肠杆菌第一引物序列如SEQ ID NO :1所示，粘附性大肠杆菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，粘附性大肠杆菌探针序列如SEQ ID N0:3所示。具体地，本发明实施例粘附性大肠杆菌检测试剂盒，其中包括DNA提取液、PCR反应液，可以同时进行粘附性大肠杆菌的检测；该试剂盒中还包括粘附性大肠杆菌阴性对照，阳性对照。试剂盒的规格阴性对照的规格为I管，40μ I/管，阴性对照的规格为I管，40μ I/管，DNA提取液为5ml/管(I管)，PCR反应液为8管/条X6条，20 μ I/管。该阴性对照为不含有粘附性大肠杆菌基因的Tris-EDTA缓冲液(O. OlM ρΗ8. O)；还包括粘附性大肠杆菌阳性对照，该阳性对照为使用粘附性大肠杆菌和DNA提取制备的阳性模板对照品，使用Tris-EDTA缓冲液(O. OlM ρΗ8. O)稀释后冷冻保存。该阴性和阳性对照用于检测时的自我检验，防止检出误差的出现。请参阅图I和图2，图I显示试剂盒中阳性对照的PCR扩增图谱，图2显示试剂盒中阴性对照的PCR扩增图谱。 具体地，该DNA提取液(用于提取DNA)具体成分为Tris_EDTA缓冲液(O. OlMpH8. O)，含 O. 01% NP-40。具体地,该PCR反应液包括第一反应、第二反应液及石蜡,该第一反应液和第二反应液通过石蜡实现分隔，在PCR反应过程中，由于温度在95°C，石蜡融化，第一反应液和第二反应液混合，PCR反应得以进行，该石蜡的具体内容见专利(200910190112. 7)。该PCR反应试剂存放于普通离心管中，该第一反应液位于下端，石蜡位于中间，该第二反应液位于石蜡上面。具体地，该第一反应液包括缓冲液，氯化镁，dNTPs，粘附性大肠杆菌第一引物、粘附性大肠杆菌第二引物、粘附性大肠杆菌探针，以及，灭菌超纯水，第一反应液的总体积为
18微升/管。该缓冲液为lOXBuffer，该缓冲液中不含有镁离子(宝生物工程(大连)有限公司)。该缓冲液的体积为2 4微升/管；该该氯化镁的浓度为25mM，该氯化镁的体积为2 4微升/管；该dNTPs的浓度为2. 5mM,体积为2 4微升/管；该粘附性大肠杆菌第一引物的浓度为50 μ Μ，体积为O. I O. 2微升/管，例如O. 15微升/管,该粘附性大肠杆菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所不，具体为5’ -CA TGTGAGAATG ATATGAAAT-3’ -；该粘附性大肠杆菌第二引物的浓度为50 μ Μ，体积为O. I O. 2微升/管，例如O. 15微升/管，该粘附性大肠杆菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，具体为5’ -TACAATTAGATGTATATAGTA-3’ ；该粘附性大肠杆菌探针的浓度为50 μ Μ，体积为O. I O. 2微升/管，例如O. 15微升/管，该粘附性大肠杆菌探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，具体为5’ -(FAM)ATTAACAAT ATCAGAATAC ATC (DABCYL)-3’ ；该灭菌超纯水的量为5. 4 11. 7微升/管，实现第一反应液的总体积为18微升/管。具体地,该第二反应液包括Taq酶、显色剂及灭菌超纯水,该第二反应液的总体积为2微升/管。该Taq酶的体积为O. 15-0. 3微升/管，显色剂的体积为O. 01-0. 02微升/管，该灭菌超纯水的量为I. 84 I. 68微升/管，该显色剂例如，溴酚兰。使第二反应液的体积满足2微升/管。具体地，该石蜡的体积为20微升/管。本发明实施例粘附性大肠杆菌检测试剂盒能检测粘附性大肠杆菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于粘附性大肠杆菌的检测。本发明实施例进一步提供一种粘附性大肠杆菌检测方法，包括如下步骤步骤SOl，增菌培养和标本处理 提供粘附性大肠杆菌的DNA样品；步骤S02，实时荧光PCR
进行实时荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用上述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒。具体地，步骤SOl在无菌条件下操作。具体地，步骤SOl中，采集样本，该样本中可能含有粘附性大肠杆菌，也可能不含有，需要本发明实施例的检测方法进行检测确定。因此，本步骤SOl中，粘附性大肠杆菌的DNA样品中可能含有粘附性大肠杆菌的DNA，也可能不含有。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反复抽吸3次充分混匀标本。具体地，步骤S02中，取步骤SOl中所得到的上清液，进行荧光定量PCR分析，本步骤中所使用的荧光定量PCR设备没有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon2) >Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycIer>Corbett Rotor-Gene>杭州博日系列。步骤S02中PCR反应的条件为50-550C 2-5min ；94-95 °C 2-3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循环)。本发明实施例粘附性大肠杆菌检测方法中，每次检测都设置试剂盒中的阳性对照和阴性对照，以防止检测过程中的污染出现。以下结合具体实施例对上述粘附性大肠杆菌检测方法进行详细说明。实施例一本发明实施例粘附性大肠杆菌检测方法包括如下步骤I、采集粘附性大肠杆菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有粘附性大肠杆菌，一些样本没有粘附性大肠杆菌。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到粘附性大肠杆菌的DNA样品；2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为第一反应液缓冲剂2微升/管
氯化镁2微升/管
dNTPs2微升/管 粘附性大肠杆菌第一引物 0.1微升/管 粘附性大肠杆菌第二引物 0.1微升/管 粘附性大肠杆菌探针 0.1微升/管
灭菌超纯水11.4微升/管；
石蜡20微升/管第二反应液Taq 酶O. 15 微升 / 管显色剂 O. 01微升/管灭菌超纯水I. 84微升/管；在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C 5-10S, 55-60。。:40_80S ； (40 循环)。实施例二本发明实施例粘附性大肠杆菌检测方法包括如下步骤I、采集粘附性大肠杆菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有粘附性大肠杆菌，一些样本没有粘附性大肠杆菌。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到粘附性大肠杆菌的DNA样品；2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为第一反应液缓冲剂3微升/管
氯化镁3微升/管
dNTPs3微升/管
粘附性大肠杆菌第一引物0.15微升/管
粘附性大肠杆菌第二引物0.15微升/管
粘附性大肠杆菌探针0.15微升/管
灭菌超纯水8.55微升/管；
石蜡20微升/管第二反应液Taq 酶O. 2 微升 / 管显色剂O. 015微升/管灭菌超纯水 I. 785微升/管；在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循环)。实施例三本发明实施例粘附性大肠杆菌检测方法包括如下步骤I、采集粘附性大肠杆菌的样本，该样本数为20个，其中一些样本中含有粘附性大肠杆菌，一些样本没有粘附性大肠杆菌。将采集后的标本放置37°C恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反复抽吸3次充分混匀标本，得到粘附性大肠杆菌的DNA样品；2、取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为第一反应液缓冲剂4微升/管
氯化镁4微升/管
dNTPs4微升/管
粘附性大肠杆菌第一引物0.2微升/管
粘附性大肠杆菌第二引物0.2微升/
权利要求
1.一种粘附性大肠杆菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括粘附性大肠杆菌第一引物、粘附性大肠杆菌第二引物、粘附性大肠杆菌探针，所述粘附性大肠杆菌第一引物序列如SEQ ID NO :1所示，粘附性大肠杆菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，粘附性大肠杆菌探针序列如SEQ ID NO 3所示。
2.如权利要求I所述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液和第二反应液通过所述石蜡分隔开。
3.如权利要求2所述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液还包括灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs。
4.如权利要求2所述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液包括Taq酶、灭菌超纯水及显色剂。
5.如权利要求3或4所述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液各组分体积为缓冲剂2~4微升/管氯化镁2 ~ 4微升/管dNTPs2~4微升/管粘附性大肠杆菌第一引物0.1 ~ 0.2微升/管粘附性大肠杆菌第二引物0.1 ~ 0.2微升/管粘附性大肠杆菌探针0.1 ~ 0.2微升/管灭菌超纯水5.4 ~ 11.7微升/管。
6.如权利要求3或4所述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液各组分体积为 Taq酶O. 15 O. 3微升/管 显色剂O. 01 O. 02微升/管 灭菌超纯水 I. 84 I. 68微升/管。
7.一种粘附性大肠杆菌检测方法，包括如下步骤 提供粘附性大肠杆菌的DNA样品； 进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测步骤中使用如权利要求1-7任一项所述的粘附性大肠杆菌检测试剂盒。
8.如权利要求7所述的粘附性大肠杆菌检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为 50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S ；55-60 °C 40-80S ； 40循环。
全文摘要
本发明适用于微生物技术领域，提供了一种粘附性大肠杆菌检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括DNA提取液、PCR反应液。本发明粘附性大肠杆菌检测试剂盒及检测方法能同时检测粘附性大肠杆菌，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于粘附性大肠杆菌的检测。
文档编号C12Q1/10GK102758004SQ201210068098
公开日2012年10月31日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者卢柳燕, 吴成贡, 汪再兴, 田仁鹏, 董绍旺, 黄娟, 龚剑 申请人:深圳市生科源技术有限公司