专利名称：一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，涉及ー种编码碱性β -葡萄糖苷酶基因及其应用。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶(beta-glucosidase, EC3. 2. I. 21)又称 β -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，广泛存在于微生物到脊椎动物的各种生物中。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，如水杨苷(salicin)、纤维ニ糖(cellobiose)、纤维三糖(cellotriose)、纤维四糖(cellotetrose)和对硝基苯_β _D_葡萄糖苷(pNPG)等，在食品风味物质的释放和纤维素降解中具有重要作用(SesteloA. B. F，Poza M.，VillaΤ·し· β-blucosidase activity in a Lactobaciilusplantarum wine strain. World Journal of Microbiology&Biotechnology,2004, 20 :633 637)。能源短缺是本世纪面临的重大问题之一。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上含量最丰富的碳水化合物，也是数量最大的ー种可再生资源。对于纤维素的利用，是解决能源危机、粮食短缺和环境污染的重要途径。β -葡萄糖苷酶是纤维素酶复合酶系发挥协同作的关键酶，对纤维素酶系的整体水解活性有很强的促进作用，可以通过提高纤维素酶系中β_葡萄糖苷酶的活性来改善整个纤维素酶系的功用(Bhat Κ.Μ.，Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications.Biotechnol Adv，1997，15 :583 620)。因此，对β -葡萄糖苷酶进行深入研究是十分必要的，也越来越引起人们的关注。目前，已有上百个微生物葡萄糖苷酶基因得到克隆，许多微生物来源的葡萄糖苷酶基因已获得异源表达(韩笑、陈介南、王义强、何钢、刘海波、谭力，葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展。生物技木通报，2008，3:8 13)。目前，研究得较多的是酵母(yeast)和木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)等霉菌(Dan S.，Marton丄·，Dekel M. , Bravdo BA. ,He S. , Withers b. G. , Shoseyov 0. Cloning, expression,characterization, and nucleophile identmcation 01 family 3, Aspergillus nigerbeta-glucosidase. J. Biol. Chem.，2000，275 :4973 4980)。但是，由于木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，另是纤维素酶活力较低，尤其是β_葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维ニ糖在反应体系中积累而影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。大部分葡萄糖苷酶的最适pH都在3. 5 5. 5酸性范围，也有少数的β -葡萄糖苷酶其pH在碱性范围。葡萄糖苷酶除了在降解纤维素方面有着重要作用外，在其他领域应用也越来越广泛，尤其是在医药、食品、生物转化中具有重要的应用价值[Michael E. H. ,Mark F. R.，Charles E. ,Cellulase for commodity products from cellulosic biomass. Curr. 0pm.Biotechnol. , 1999,10(4) :358 364]。在水果、蔬菜、茶叶等食料和中草药中，许多风味前体物质和药理活性成分主要以糖苷形式存在，需要β-葡萄糖苷酶这种风味酶将其转化为苷元或其他形式的高生理活性物质发挥作用(金凤燮，庄子瑜，鱼红闪，等.特异的中草药配糖体苷酶微生物及其发酵与酶学特性.生物工程学报，2009，25 (12) :1863 1870)。同吋，β -葡萄糖苷酶还具有葡萄糖基转移活性(孟宪文、宋小红、陈历俊等，葡萄糖苷酶的研究进展。中国乳业，2009，10 :42 44)，可用于低聚龙胆糖的生产(刘玲玲、朱松、朱婷等，重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的エ艺条件优化。微生物学报，2009，49 (5) :597 602)和红景天苷等糖苷类活性物质的酶法合成(刘磷、梅乐和、柳行等，酶催化制备P-羟基苯こ基β-D-葡萄糖苷过程强化。高校化学工程学报，2009，23 (I) :87 91 ;王梦亮、李万丽，固定化β -葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究。生物技术，2009，19 (I) 68 70)。本发明人以葡萄糖苷酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共检出294项发明专利。其中有19项发明专利是描述编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用，而其他275项是与葡萄糖苷酶在各种领域上的应用有夫。在这19项与编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用相关的发明专利中只有一项是描述碱性β_葡萄糖苷酶，专利申请人南开大学；、专利号ZL200510116748.9 ;发明名称ー种嗜热碱性β _葡萄糖苷酶及其编码基因。该发明涉及ー种葡萄糖苷酶及其编码基因。该酶具有在高温、碱性条件下保持较高酶活性的特点，其最适反应温度约为70°C，最适反应pH值约为8. 0，该酶能催化水解β -葡萄糖苷键生成葡萄糖，在食品、医药、纺织、能源等方面具有重要的应用价值。这个碱性β_葡萄糖苷酶是从嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2 (CGMCC No. 1228)克隆到的，从专利的说明书附图的图3中可以看出该碱性β -葡萄糖苷酶在ρΗΙΟ. O时的酶活性只有最高时的25%。
发明内容
本发明的目的提供了ー种编码碱性葡萄糖苷酶基因及其应用，这个碱性β -葡萄糖苷酶在PH值10时，其酶活性仍保留有较高的酶活性。本发明是这样实现的一种碱性β -葡萄糖苷酶基因，其序列的保守区外源DNA是由2277个碱基组成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF), Pbgl基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAG，其碱基序列如SEQ ID NO. I所示。SEQ ID NO. I为Iatg agaaacc atacttcaga cacgatcaat aagacagtag aaaccgttcg atacgtaaaa60aatcccggcg gccccacgct gggctacagc gaggaatcgg gcgtgggcat catcgagcag 120gacggcttgt tcttcaagga tttaagccgt gacggcaagc tggacaaata cgaggactgg 180cggctgtcgc cggaggagcg ggcgaaagac ctggcctcga aaatgacggt cgagcagatt 240gccggtctga tgctgtacag ccgtcatcag tcgatccccg ccctcagtac cggctggttt 300gcaggcacgt acagcgggaa aacgtatgaa gagagcggag cgaagccttg ggaactgacc 360gatgagcaga tcgcattttt gaccaaggac catgtgcggc acgtgctcgt aaccacggtg 420gaaagtccgg aagttgcggc gcgctggaac aacaaaatcc aggcgtttgc cgaaggcacc 480gggcttggca ttccggcgaa caacagctcc gatccccgcc acgcttcgga ttcaagctcc 540gaattcaacg cgggtgcggg cggccatatc tccatgtggc ccgagacgct cggcctagca 600gctacttttg atcccgagat cacgaagaag ttcgggatga tcgcttcccg ggaatatcgc 660gcgttagggc ttgctaccgc cctgtctccg caaatcgata tcgccacgga gccgcgctgg 720ttccggttta acggcacgtt cggcgaagat tcgaagctcg ccgccgatct ggcccgcgct 780
tatgtcgacg gcttccagac ttccgaaggc gaacgggaaa tcgcggacgg ttggggttat 840gacagcgtca atgcgatggt gaagcattgg ccgggaggcg gatcgggcga agccggaagg 900gacgcccact acagctgcgg gaagtatgcg gtgtatccgg gcaacaactt tgacgaacat 960ctggtgcctt ttgttgacgg ggcattcaag ctggacggca aaacagggaa ggcgtcggcc 1020gtcatgccgt attacacgat ctccttcggc caggacaccg taaacggcga aaatgtcggc 1080aactcctata actcgtacct gattaaggat ttgctgcgcg ggaaatacgg gtatgacggc 1140gtcgtatgca cggactggat gatcacggcc gacgtttccg gcgccaagga ttcttttctg 1200agcggaaaac catggggcgt ggaggatttg accgtggccg agcgccatta caagctgctg 1260·
atggcgggcg ttgaccaatt cggcggcaac aatgagatcg agccggtgtt ggaggcttac 1320aagatcgggg ttcgcgaaca cggcgaagcc tatatgcggg aacgcttcga gcaatcggcc 1380gtccggctgc tgaaaaatat gttccgcctc ggcttgtttg aaaatccgta cctcgatcca 1440caggaaagcg ccaagctggt cgggaacccc gaatttatgc gggaaggtta cgaagcacag 1500ctaaaatcga tcgtcatgct caaaaacaaa aacggggtgc tcccgcttcg cgcgaaaagc 1560aaagtttaca tccccaaacg ttttctcccg ccgggaaaag actggttcgg ccatccgacg 1620ccggagagct atgattatcc ggtcaacctg gaggtcgtct cgaaatattt cgaagtcacc 1680gaccaaccgg acgaagcgga tttcggcctt gtctttatcg catcaccgaa gtccggcacc 1740ggctacagcc aggaggacga ggagcagggc gggaacggtt atgtgccgat cagcctgcaa 1800tacaagccgt atacggcgga gcatgcccgg gaagtcagcc tggccggcga tgaacacggg 1860aacgaaccgc gaaaccgttc ttataaagga aaaaccgtca ttccgcacaa tacgacggat 1920ttaaacatgg tgctggagac gaaggaaaaa atgaaaggca aacccgtcat tgtctcgatg 1980ctattgagca atcccacggt cgtttcggag tttgaagcgg aagtggatgc catcctggcg 2040aacttcggcg ttcaggatca ggcgatcatg gatgtattga cgggggcggc ggagccgtcc 2100gggctgctgc cgatgcaaat gcccgcccat atgcgcaccg tcgaagagca gctggaagat 2160gtcgcgcacg atatggaatg ccatgtcgat tcggacaatc atgtatatga ctttgccttc 2220gggttgaact ggagcggcgt gatcgaggat gagcgaacca agaaataccg tagaagc: TAG 2280以上所述基因编码的碱性β -葡萄糖苷酶，由759个氨基酸組成，氨基酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。SEQ ID NO. 2 为Met Arg Asn His Thr Ser Asp Thr lie Asn Lys Thr Val Glu ThrI5 10 15Val Arg Tyr Val Lys Asn Pro Gly Gly Pro Thr Leu Gly Tyr Ser1620 25 30Glu Glu Ser Gly Val Gly lie lie Glu Gln Asp Gly Leu Phe Phe3135 40 45Lys Asp Leu Ser Arg Asp Gly Lys Leu Asp Lys Tyr Glu Asp Trp4650 55 60Arg Leu Ser Pro Glu Glu Arg Ala Lys Asp Leu Ala Ser Lys Met6165 70 75Thr Val Glu Gln lie Ala Gly Leu Met Leu Tyr Ser Arg His Gln7680 85 90
Serlie Pro Ala Leu Ser Thr GlyTrp Phe AlaGly Thr Tyr Ser91 95 100105GlyLys Thr Tyr Glu Glu Ser GlyAla Lys ProTrp Glu Leu Thr106 110 115120AspGlu Gin lie Ala Phe Leu ThrLys Asp HisVal Arg His Val121 125 130135LeuVal Thr Thr Val Glu Ser ProGlu Val AlaAla Arg Trp Asn136 140 145150AsnLys lie Gin Ala Phe Ala GluGly Thr GlyLeu Gly lie Pro151 155 160165AlaAsn Asn Ser Ser Asp Pro ArgHis Ala SerAsp Ser Ser Ser166 170 175180GluPhe Asn Ala Gly Ala Gly GlyHis lie SerMet Trp Pro Glu181 185 190195ThrLeu Gly Leu Ala Ala Thr PheAsp Pro Glulie Thr Lys Lys196 200 205210PheGly Met lie Ala Ser Arg GluTyr Arg AlaLeu Gly Leu Ala211 215 220225ThrAla Leu Ser Pro Gin lie Asplie Ala ThrGlu Pro Arg Trp226 230 235240PheArg Phe Asn Gly Thr Phe GlyGlu Asp SerLys Leu Ala Ala241 245 250255AspLeu Ala Arg Ala Tyr Val AspGly Phe GinThr Ser Glu Gly256 260 265270GluArg Glu lie Ala Asp Gly TrpGly Tyr AspSer Val Asn Ala271 275 280285MetVal Lys His Trp Pro Gly GlyGly Ser GlyGlu Ala Gly Arg286 290 295300AspAla His Tyr Ser Cys Gly LysTyr Ala ValTyr Pro Gly Asn301 305 310315AsnPhe Asp Glu His Leu Val ProPhe Val AspGly Ala Phe Lys316 320 325330LeuAsp Gly Lys Thr Gly Lys AlaSer Ala ValMet Pro Tyr Tyr331 335 340345Thrlie Ser Phe Gly Gin Asp ThrVal Asn GlyGlu Asn Val Gly346 350 355360AsnSer Tyr Asn Ser Tyr Leu lieLys Asp LeuLeu Arg Gly Lys361 365 370375TyrGly Tyr Asp Gly Val Val CysThr Asp TrpMet lie Thr Ala
376 380385390Asp Val SerGly Ala Lys AspSer Phe LeuSer Gly Lys Pro Trp391 395400405Gly Val GluAsp Leu Thr ValAla Glu ArgHis Tyr Lys Leu Leu
406 410414420Met Ala GlyVal Asp Gln PheGly Gly AsnAsn Glu lie Glu Pro421 425430435Val Leu GluAla Tyr Lys lieGly Val ArgGlu His Gly Glu Ala436 440445450Tyr Met Arg Glu Arg Phe GluGln Ser AlaVal Arg Leu Leu Lys451 455460465Asn Met PheArg Leu Gly LeuPhe Glu AsnPro Tyr Leu Asp Pro466 470475480Gln Glu SerAla Lys Leu ValGly Asn ProGlu Phe Met Arg Glu481 485490495Gly Tyr GluAla Gln Leu LysSer lie ValMet Leu Lys Asn Lys496 500505510Asn Gly ValLeu Pro Leu ArgAla Lys SerLys Val Tyr lie Pro511 515520525Lys Arg PheLeu Pro Pro GlyLys Asp TrpPhe Gly His Pro Thr526 530535540Pro Glu SerTyr Asp Tyr ProVal Asn LeuGlu Val Val Ser Lys541 545550555Tyr Phe GluVal Thr Asp GlnPro Asp GluAla Asp Phe Gly Leu556 560565570Val Phe lieAla Ser Pro LysSer Gly ThrGly Tyr Ser Gln Glu571 575580585Asp Glu GluGln Gly Gly AsnGly Tyr ValPro lie Ser Leu Gln586 590595600Tyr Lys ProTyr Thr Ala GluHis Ala ArgGlu Val Ser Leu Ala601 605610615Gly Asp GluHis Gly Asn GluPro Arg AsnArg Ser Tyr Lys Gly616 620625630Lys Thr Vallie Pro His AsnThr Thr AspLeu Asn Met Val Leu631 635640645Glu Thr LysGlu Lys Met LysGly Lys ProVal lie Val Ser Met646 650655660Leu Leu SerAsn Pro Thr ValVal Ser GluPhe Glu Ala Glu Val661 665670675
Asp Ala He Leu Ala Asn Phe Gly Val Gln Asp Gln Ala He Met676680685690Asp Val Leu Thr Gly Ala Ala Glu Pro Ser Gly Leu Leu Pro Met
691695700705Gln Met Pro Ala His Met Arg Thr Val Glu Glu Gln Leu Glu Asp706710715720Val Ala His Asp Met Glu Cys His Val Asp Ser Asp Asn His Val721725730735Tyr Asp Phe Ala Phe Gly Leu Asn Trp Ser Gly Val He Glu Asp736740745750Glu Arg Thr Lys Lys Tyr Arg Arg Ser751755759以上所述的碱性β -葡萄糖苷酶同源性最高的是乳酸类芽孢杆菌154 (Paenibacillus lactisl54)的糖基水解酶家族3的功能域蛋白质(glycosidehydrolase family 3 domain protein)，两者的相似性=731/759 (96 % );同源性=746/759(98% )。以上所述的碱性β -葡萄糖苷酶基因Pbgl表达载体及用于转化基因Pbgl的宿主。以上所述的碱性β -葡萄糖苷酶基因Pbgl，是从广西南宁筛选到的克氏类芽孢杆菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)的基因组文库中克隆得到的碱性葡萄糖苷酶基因 Pbgl。以上所述的碱性β -葡萄糖苷酶基因Pbgl，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产β -葡萄糖苷酶，其酶活性最佳pH值8. 0，pH值6或pH值10时酶活性均达到最高酶活性的58%。以上所述的克隆表达采用的引物是上游引物5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAGAAACCATACTTCAGACACG-3，；下游引物5 ’ -GACAAGCTTTCAGCTTCTACGGTATTTCTTG-3，。以上所述的碱性β -葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达的重组产物Pbgl能够分解纤维ニ糖，应用于纤维寡糖为原料降解成葡萄糖。本发明的优点和积极效果本碱性葡萄糖苷酶基因Pbgl，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产葡萄糖苷酶Pbgl，其酶活性适应酸碱范围pH值5-10，最佳pH值8.0，pH值10时酶活性仍保留有最高酶活性的58%，优于已有的碱性β_葡萄糖苷酶的活性，提高了其应用价值。
图I :是筛选含有β -葡萄糖苷酶基因Pbgl重组菌株的七叶苷选择平板图。图2 :是β -葡萄糖苷酶纯化物的SDS-PAGE图。图3 :是β -葡萄糖苷酶活性与pH值关系图。图4 :是β -葡萄糖苷酶水解纤维ニ糖的HPLC图。
图中说明图I中是含有β_葡萄糖苷酶基因Pbbgl重组的菌株能够在七叶苷选择平板上形成黒色圏；图2中β_葡萄糖苷酶纯化物的分子量为84kDa;图3中β -葡萄糖苷酶的最适pH为8. O ;图4中的A和B分别是葡萄糖和纤维ニ糖的标样，C是β -葡萄糖苷酶能将纤维ニ糖水解成葡萄糖。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系XLl-blue、载体pUC19 (购自大连TaKaRa公司);表达载体pSE380购自Stratagene公司，购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述 I、克氏类芽孢杆菌GX-4基因组文库的构建克氏类芽孢杆菌GX-4 (Paenibaci I Ius cookii GX-4)的基因组DNA是按照BioFlux 公司的细菌基因组 DNA 提取试剂盒 Biospin Bacteria Genomic DNAExtractionKit(目录号BSC12S1)的使用说明来提取的。克氏类芽孢杆菌GX-4 (Paenibacillus cookii GX-4)的基因组文库构建是按照Epicentre 公司的文库制备试剂盒 CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号CCF0S110)的使用说明书来进行的。构建好的克氏类芽孢杆菌GX-4 (Paenibacilluscookii GX-4)的基因组文库涂布到在含氯霉素12. 5μ g/mL，LA培养基每IOOml含蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCl O. 5g，琼脂粉I. 5g的LA平板上。结果共获得约4231个转化子。2、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl序列的测定将在含氯霉素12. 5 μ g/mL的LA平板上得到的转化子分别点菌落到含有氯霉素 12. 5 μ g/mL,蛋白胨 lg/1 OOmL,酵母粉 O. 5g/100mL, NaCl O. 5g/100mL,七叶苷O. 12g/100mL，柠檬酸铁铵O. 5g/100mL，琼脂粉I. 5g/100mL培养基的LA选择平板上，将平板倒置于37°C培养箱培养12小吋。结果筛选到八个能产黒色透明圈的克隆，本发明只涉及其中一个克隆，进ー步提取该克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI酶切后，将获得的DNA片段与经BamHI酶切的去磷酸化的pUC19质粒进行连接。再CaCl2转化方法将连接产物转化到大肠杆菌XLl-blue中，在含氨苄青霉素100 μ g/mL、七叶苷O. 12g/100mL和柠檬酸铁铵O. 5g/100mL的LA选择平板上筛选亚克隆转化子。结果共获得约50个产生黑色圈的亚克隆转化子。进ー步提取其中6个亚克隆转化子的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全酶切后，进行O. 7%琼脂糖凝胶电泳分析，结果这6个亚克隆转化子都能酶切下ー个2. 7kb的载体片段外，还给出另外一条DNA片段，大小为5.8kb。于是，对其中ー个亚克隆子进行测序，并命名为pUC-Pbgl。pUC-Pbgl送交华大基因公司測定DNA核苷酸序列。3、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的核苷酸序列分析米用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi. nlm. nih. gov)上的软件如 ORF f inder (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf.html), Blast (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)对 DNA 序列进行分析。β-葡萄糖苷酶基因序列的保守区外源DNA是由2277个碱基组成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF), Pbgl基因的起始密码为ATG,终止密码子为TAG，其碱基序列如SEQ ID NO. I所示。4、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl编码的产物Pbgl的氨基酸序列分析β -葡萄糖苷酶基因Pbgl编码ー个含759个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列如SEQID NO. 2所示，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为84206. 29道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModular Architecture Research Tool,SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析 β _ 葡萄糖苷酶 Pbgl 的组件结构，结果是自N端的第157-403位和542-746位氨基酸为家族3糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。5、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的克隆和表达 使用上游引物5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAGAAACCATACTTCAGACACG-3，和下游引物5’ -GACAAGCTTTCAGCTTCTACGGTATTTCTTG-3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增葡萄糖苷酶基因Pbgl，用限制性内切酶Pag I和HindIII酶切β -葡萄糖苷酶基因Pbgl后，与经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XLl-blue中(转化方法为CaCl2法)，涂布到含氨苄青霉素100 μ g/mL的LA平板上。挑取转化得到的单菌落到含氨苄青霉素100 μ g/mL、七叶苷0. 12g/100mL和柠檬酸铁铵
0.5g/100mL的LA选择培养基平板上，将平板置于37°C恒温箱培养6小吋，然后进行氯仿熏蒸破胞，把平板置于37°C恒温箱使表达的Pbgl酶与七叶苷和柠檬酸铁铵反应2 3小吋。观察选择平板。然后进一步提取能形成黑色圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pSE-Pbgl，用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切pSE-Pbgl后，进行0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-Pbgl除有ー个5. 3kb的DNA片段外，还有一条大小约为I. Ikb的DNA片段。将含有质粒pSE-Pbgl重组大肠杆菌XLl-blue菌株接种到600mL含氨苄青霉素100 μ g/mL的LB培养基中，37°C振荡培养，待0D_为0. 4时，加入IPTG使其终浓度为
0.5mmol/L, 37°C诱导 10 小时。IlOOOrpm 离心 3min，收集菌体，用 4mL pH7. 0100mmol/L 的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min,取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入ImL 50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。在柱子里加入含有50mmoI/LNaH2P04，300mmol/LNaCl, 20mmol/L咪唑，pH 8. O的冲洗缓冲液lmL，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入含有50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8. 0 的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。6、β -葡萄糖苷酶的最适pH的测定β -葡萄糖苷酶以对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物进行最适pH测定反应取10 μ I稀释10倍的纯酶液，分别在116 μ I的50mmol/L磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液，pH 4. 6 8. O ;50mmol/L Tris-盐酸缓冲液,pH 8. O 9. O ;50mmol/L甘氛酸-氧氧化钠缓冲液，pH 9. O 10. O中与10 μ I 25mmol/L pNPG 50°C作用15分钟，反应时间到后用70 μ I lmol/L碳酸氢钠终止反应。在410nm波长中检测生成物的量。测定的结果是β -葡萄糖苷酶的最适pH是8. O,并且在pH6. 4或pH10. O时还有最闻时的58%以上的酶活力。
7、β -葡萄糖苷酶水解纤维ニ糖的測定β -葡萄糖苷酶以纤维ニ糖为底物、在ρΗ8. O的50mmol/L磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液和50°C下作用30分钟。反应时间到后，在100°C加热10分钟终止反应。Pbgl的产物用高效液相色谱法(HPLC)进行检測。HPLC条件仪器AgilentllOO色谱仪；色谱柱氨基柱；流动相こ腈水=70 30;流速LOmL/min ;检测器RID折光检测器。HPLC检测的结果显示Pbgl能够将纤维ニ糖水解葡萄糖。以纤维ニ糖为底物的Pbgl 的酶活是 92. 4U/mg。序列表〈110〉广西大学〈120〉ー个编码碱性葡萄糖苷酶的基因及其应用
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<160>2<170>PatentIn Version 3. 3<210>1<211>2280<212>DNA〈213〉克氏类芽抱杆菌 GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)〈220〉<221>gene〈222>(1). · · (2080)〈223〉〈400〉Iatgagaaacc atacttcaga cacgatcaat aagacagtag aaaccgttcg atacgtaaaa d0aatcccggcg gccccacgct gggctacagc gaggaatcgg gcgtgggcat catcgagcag 120gacggcttgt tcttcaagga tttaagccgt gacggcaagc tggacaaata cgaggactgg 180cggctgtcgc cggaggagcg ggcgaaagac ctggcctcga aaatgacggt cgagcagatt 240gccggtctga tgctgtacag ccgtcatcag tcgatccccg ccctcagtac cggctggttt 300gcaggcacgt acagcgggaa aacgtatgaa gagagcggag cgaagccttg ggaactgacc 360gatgagcaga tcgcattttt gaccaaggac catgtgcggc acgtgctcgt aaccacggtg 420gaaagtccgg aagttgcggc gcgctggaac aacaaaatcc aggcgtttgc cgaaggcacc 480gggcttggca ttccggcgaa caacagctcc gatccccgcc acgcttcgga ttcaagctcc 540gaattcaacg cgggtgcggg cggccatatc tccatgtggc ccgagacgct cggcctagca 600gctacttttg atcccgagat cacgaagaag ttcgggatga tcgcttcccg ggaatatcgc 660gcgttagggc ttgctaccgc cctgtctccg caaatcgata tcgccacgga gccgcgctgg 720ttccggttta acggcacgtt cggcgaagat tcgaagctcg ccgccgatct ggcccgcgct 780tatgtcgacg gcttccagac ttccgaaggc gaacgggaaa tcgcggacgg ttggggttat 840gacagcgtca atgcgatggt gaagcattgg ccgggaggcg gatcgggcga agccggaagg 900gacgcccact acagctgcgg gaagtatgcg gtgtatccgg gcaacaactt tgacgaacat 960ctggtgcctt ttgttgacgg ggcattcaag ctggacggca aaacagggaa ggcgtcggcc 1020
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权利要求
1.ー个编码碱性β-葡萄糖苷酶基因，其特征在干具有序列表中SEQ ID NO. I核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的碱性葡萄糖苷酶基因编码的蛋白质，其特征在干葡萄糖苷酶的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—种表达载体,其特征在于它含有权利要求I所述的基因
4.ー种宿主细胞，其特征在于它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.一种碱性葡萄糖苷酶适合在降解纤维寡糖的应用。
全文摘要
本发明公开了一个编码碱性β-葡萄糖苷酶基因和应用，本碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，并提供了所述基因编码碱性β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示。本碱性β-葡萄糖苷酶的活性适应酸碱范围pH值5-10，最佳pH值8.0，当pH值10时酶活性仍保留有最高酶活性的58％，优于已有的碱性β-葡萄糖苷酶的活性，提高了其应用价值，适合在分解纤维寡糖中的应用。
文档编号C12R1/01GK102719458SQ20121006751
公开日2012年10月10日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者庞浩, 杜丽琴, 王子龙, 霍云龙, 韦宇拓, 黄日波 申请人:广西大学