专利名称：一种生物分子的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及生物分子的定量检测方法，具体是ー种基于核酸杂交链式反应的生物分子的定量检测方法。
背景技术：
对核酸、蛋白质等重要生命物质进行高灵敏度和高选择性检测对于深入掲示其生物功能以及疾病诊断等研究領域都具有十分重要的意义。以核酸分析为例，一些重要的核酸片段往往在人体内含量极低，若实现高灵敏度和特异性检测，通常要用到扩增技术。核酸扩增技术主要可分为两大类温度循环扩增和恒温扩增。聚合酶链式反应(PCR)是目前应用最为广泛的温度循环核酸扩增技术，反应指数进行，痕量的核酸分子能够被扩增到可以检测的水平。另ー种常用的热循环扩增技术是连接酶链式反应(LCR)，在温度循环过程中连 接反应的产物成为下ー个循环的反应物，因此反应的产物在温度循环过程中呈指数増加。然而，基于热循环的核酸扩增技术一般都需要较长的时间，反应过程受限于热稳定性的酶，需要精准的控温，有时特异性也较差。近年来，以滚环扩增(RCA)技术为代表的恒温扩增方法由于可摆脱精准控温和热循环的限制而得到了长足发展。但与热循环扩增类似，RCA等恒温扩增过程也必须在一种或多种酶的共同作用下才能完成，使得这些扩增技术都強烈地依赖于所用酶的活性和稳定性。杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction, HCR)给核酸扩增技术带来了新的突破，该技术无需任何酶的催化作用，是依靠杂交反应的热力学和动力学原理设计的恒温扩增方法。HCR反应体系需要两种亚稳态的茎-环结构核酸探针(简称为Hl和H2)，所谓亚稳态结构是指当没有靶标引发分子吋，Hl和H2単体能够各自稳定地共存于溶液中，并不发生反应。但当加入起始物靶标引发分子之后，Hl和H2単体分子会在靶分子作用下依次循环的打开从而聚合成带微缺ロ的长链双螺旋核酸结构，实现对靶标分子的恒温扩增。由于HCR可实现无酶催化恒温扩增，反应条件简单，摆脱了常规扩增技术对酶稳定性和精确控温等条件的依赖，在核酸研究領域展现出了独特的优势。但是，如何通过对HCR产物进行分析并进而给出起始靶标分子的定量信息，目前仍缺乏灵敏、有效的手段。目前已有报道的检测HCR产物的方法主要有凝胶电泳和荧光标记方法，凝胶电泳检测方法灵敏度低，无法满足痕量生物分子的分析要求；Tan等人(Angew. Chem. Int. Ed. ,2011,50,401-404)在Hl及H2探针的两个末端分别标记上Pyrene荧光分子，HCR反应后会形成Pyrene ニ聚体，其荧光发射波长和强度与Hl或H2単体相比有明显变化，因此可通过ニ聚体的荧光信息实现对起始引发分子的定量分析。但该技术需要在每条核酸探针的两个末端都进行荧光分子标记，步骤繁琐，成本较高。但是，若不采用荧光二聚体技术，而在每个Hl或H2単体上进行常规单荧光分子标记，则HCR反应前后体系的荧光信号不存在差异，无法实现对HCR产物的区分。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低、灵敏度高，且操作简单的生物分子的定量检测方法本发明的目的通过以下技术方案得以实现本发明所提供的生物分子的定量检测方法，包括以下步骤(a)依据靶标生物分子序列，设计荧光标记的Hl*和H2*探针；(b)将设定浓度的、标记有荧光基团的茎-环结构核酸探针Hl*和H2*溶液分别置于PCR仪上95°C条件下加热2分钟，然后在室温下避光放置I 2小吋，使茎环结构充分闭合；(c)将靶标生物分子用灭菌水或缓冲液配制成设定规格浓度的生物分子溶液；取数个离心管，分别在各个管中加入不同规格浓度的生物分子溶液，同时分别加入b步所制备的HI*、H2*溶液，混合均匀后在室温下进行HCR反应；(d)待HCR反应结束后，根据步骤(b)中Hl*和H2*的溶液浓度，每个离心管中加入适量的碳材料，使碳材料的用量刚好能够完全猝灭初始浓度Hl*和H2*単体的荧光信号，室温反应30分钟后，检测并记录体系的荧光信号；(e)通过荧光信号对靶标生物分子进行定量分析。本发明方法所涉的茎-环探针単体均采用常规单荧光分子标记(Hl*，H2*)，在靶标物质存在时发生HCR形成富集众多荧光基团的长链带微缺ロ的双螺旋核酸结构；在反应体系中加入碳材料用来区分HCR前后的荧光信号差异。所用碳材料能高效猝灭Hl*和H2*単体的荧光信号，但对HCR产物双螺旋核酸结构上面的荧光基团猝灭作用显著降低。因此，体系中靶标生物分子含量越高，形成的HCR产物双链越多，加入碳材料后体系的荧光信号就越強，从而可实现靶标生物分子的定量检测。本发明中所述的荧光基团可采用有机荧光染料、半导体荧光量子点或稀土荧光材料中的ー种。缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPSE缓冲液中的任意ー种，其中缓冲液中NaCl的含量> 0. lmol/L。生物分子为DNA或RNA等各类核酸分子。所述的碳材料可选用氧化石墨烯、石墨烯、碳纳米管、碳纳米粒子中的任意ー种。本发明的检测原理如图I所示，Hl*和H2*均由ー个茎-环结构和一段粘性末端序列组成，粘性末端标记有荧光物质；无靶标分子吋，Hl*和H2*分别稳定独立共存于溶液中，并均可吸附在碳材料表面导致荧光信号猝灭；当加入靶标核酸分子(序列为1*_2*)后，靶标与Hl*的粘性末端及茎部序列(序列1-2)完全互补，杂交使Hl*打开，开环后释放出的单链序列(3-2*)与H2*的粘性末端和茎部序列(3*-2)完全互补，通过杂交反应又使H2*茎环结构打开释放出与靶标分子引发序列完全相同的核酸单链(1*_2*)，继续使Hl*开环，如此循环反复，即能引发HCR生成带有缺ロ的长双链，由于双螺旋本身固有的刚性立体结构，碳材料对双链荧光信号猝灭作用显著降低，因此产生了荧光信号的差別，从而达到检测的目的。本发明的有益效果I、本发明基于无酶催化核酸恒温扩增技木，故反应条件温和，可摆脱PCR等常规核酸扩增技术对酶及精确控温的依赖，降低了检测成本。2、本发明将HCR对荧光信号的富集放大作用与碳材料对HCR反应前、后体系荧光信号的选择性猝灭作用相结合，使核酸等生物分子的检测灵敏度大大提高。其与已有报道的利用GO等碳材料作为荧光猝灭剂的核酸检测方法相比(Adv. Funct. Mater.，2010，20，453-459)灵敏度提高了两个数量级。
图I为本发明的检测原理图。图2(a):为本发明用于不同浓度let_7a microRNA检测的荧光谱图。图2(b):为本发明用于不同浓度let_7a microRNA定量检测时，以520nm波长处荧光强度为纵坐标，let-7a浓度为横坐标绘制的标准曲线图。图3 :为本发明在检测let_7a microRNA时的特异性荧光谱图。 图4(a):为本发明所述方法用于不同浓度特定序列DNA片段检测的荧光谱图。图4(b):为本发明所述方法用于不同浓度特定序列DNA片段检测时，以520nm波长处荧光強度为纵坐标，DNA浓度为横坐标绘制的标准曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一歩的阐述。这些实施例仅用来阐述本发明的具体实施方式
，而不是限制本发明的范围。阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书中所限定的范围。本发明实施例中所用生物材料，其microRNA体系核酸序列信息如表I所示。表I :
名称序列信息(5’ _3’ )碱基数质谱检测分子量信息
let-7
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU227101. 2
a
AGTAGGTTGTATAGTTCAAAGTAACTATACAAHI*4414051.0
CCTACTACCTCA-FAM
FAM-ACTTTGAACTATACAACCTACTTGAGGTH2* 44 14112.3_[AGTAGGTTGTATAGTT ___实施例I :(a)以let_7a microRNA为靶标生物分子(从大连宝生物公司购得)，根据其序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)按照常规方法设计FAM荧光标记的Hl*和H2*探针，设计好的HI*、H2* 探针序列分别为H1* AGTAGGTTGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-FAM ；H2* FAM-ACTTTGAACTATACAACCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT。(b)将浓度为2 ii M的Hl*和H2*单体溶液分别置于PCR仪上95°C加热2分钟，然后在室温避光放置I小时，使茎环结构充分闭合；
(c)取10个RNase-free的离心管，分别在各管中加入不同浓度的靶标let_7amicroRNA,使各管 let_7a 终浓度依次为 OpM，0. 5pM, IOpM, IOOpM, 500pM, InM, 2nM, 3nM, 4nM,5nM，然后每个离心管中分别加入终浓度为50nM的Hl*和H2*，一定体积的缓冲溶液和水，使各管中的最终反应介质为200 u L体积的SSP缓冲(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl，pH7. 4)，混合均匀后，避光在室温下静置或在摇床上摇晃4小时进行HCR反应；(d)在步骤(C)中的每个反应管中各加入适量氧化石墨烯(GO)水溶液，使GO在每个反应管中的终浓度均为2 5 u g/mL (该用量刚好能够完全猝灭初始浓度Hl*和H2*単体的突光信号)，混合均勻并室温反应30分钟后,在突光分光光度计上检测各管中溶液的突光信号，荧光强度随let_7a浓度的増加而逐渐增强。检测结果如图2(a)所示。(e)以荧光光谱图中520nm波长处的強度值为纵坐标，Let_7a浓度为横坐标绘制标准曲线，如图2(b)所示，二者成良好的线性关系。(f)在(e)步骤中绘制标准曲线的基础上，另取I支RNase-free的离心管，加入200ng从HeLa细胞提取出的总RNA实际样品，终浓度为50nM的Hl*和H2*，一定体积的缓冲溶液和水，使最终反应介质为200 u L体积的SSP缓冲(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl，pH7. 4)，混合均匀后，避光在室温下静置或在摇床上摇晃4小时进行HCR反应；之后加入终浓度为25 ii g/mL的氧化石墨烯(GO)水溶液，混合均匀并室温反应30分钟后，在荧光分光光度计上检测溶液的荧光信号并记录520nm处荧光信号強度，对照(e)中建立的标准曲线，计算出在200 u L终反应体积中let-7a的浓度约为133pM，表明该方法可用于实际样品中microRNA的定量分析。实施例2 (a)以I et_7a mi croRNA为目标检测分子，根据其序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)设计FAM荧光标记的Hl*和H2*探针，序列分别为H1* AGTAGGTTGTATAGTTCAAAGTAACTATAC AACCTACTACCTCA-FAM ;H2* FAM-ACTTTGAACTATACAACCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT ；(b)将浓度为2 ii M的HI*和H2*单体溶液分别置于PCR仪上95°C加热2分钟，然后在室温避光放置I小时，使茎环结构充分闭合；(c)取4个RNase-free的离心管，分别在各管中加入相同浓度(3nM)的let_7a，let-7b, let-7g, let_7i，另取ー离心管同时做空白对照；然后每个离心管中分别加入终浓度为50nM的Hl*和H2*，一定体积的缓冲溶液和水，使各管中的最终反应介质为200 y L体积的SSP缓冲(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl，pH7. 4)，混合均匀后，避光在室温下静置或在摇床上摇晃4小时进行HCR反应；(d)在步骤(C)中的每个离心管中各加入适量氧化石墨烯(GO)水溶液，使GO在每个离心管中的终浓度均为25ii g/mL，混合均匀并室温反应30分钟后，在荧光分光光度计上检测各管中溶液的荧光信号。检测结果如图3所示；从图3可以看出，只有let_7a目标分子能够产生強烈的荧光信号，而与之同族的let-7b,let-7g, let-7i的响应信号非常微弱，均不干扰let_7a的測定，表明该检测方法具有良好的特异性。实施例4 (a)以一段随机选定的序列 DNA片段(选自 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2004，15275-15278)为目标检测分子，根据其序列(AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA)设计FAM标记的Hl*和H2*探针，序列分别为H1* FAM-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG ;H2* AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-FAM ；(b)将浓度为2 ii M的HI*和H2*单体溶液分别置于PCR仪上95°C加热2分钟，然后在室温避光放置I小时，使茎环结构充分闭合； (c)取10支离心管，分别在各管中加入不同浓度的靶标DNA分子，使其终浓度依次为0，0. 5pM, IOpM, IOOpM, 500pM, InM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM,然后每个离心管中分别加入终浓度为50nM的Hl*和H2*，一定体积的缓冲溶液和水，使各管中的最终反应介质为200 u L体积的SSP缓冲(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl, pH7. 4)，混合均匀后，避光在室温下静置或在摇床上摇晃4小时进行HCR反应；(d)在步骤⑶中的每个反应管中各加入适量氧化石墨烯(GO)水溶液，使GO在每个反应管中的终浓度均为25 ii g/ml,混合均匀并室温反应30分钟后,在荧光分光光度计上检测各管中溶液的荧光信号，荧光强度随DNA浓度的増加而逐渐增强。检测结果如图4(a)所示。(e)以荧光光谱图中520nm波长处的强度值为纵坐标，DNA浓度为横坐标绘制曲线，如图4(b)所示，二者成良好的线性关系。因此可利用标准曲线法对该DNA序列进行定量分析。
权利要求
1.ー种生物分子的定量检测方法，其特征在于它包括以下步骤 Ca)依据靶标生物分子序列，设计荧光标记的Hl*和H2*探针； (b)将设定浓度的、标记有荧光基团的茎-环结构核酸探针Hl*和H2*溶液分别置于PCR仪上95 ° C条件下加热2分钟，然后在室温下避光放置f 2小吋，使茎环结构充分闭合； (c)将靶标生物分子用灭菌水或缓冲溶液配制成设定规格浓度的生物分子溶液；取数个离心管，分别在各个管中加入不同规格浓度的生物分子溶液，同时分别加入b步所制备的HI*、H2*溶液 ，混合均匀后在室温下进行HCR反应； Cd)待HCR反应结束后，根据步骤(b)中Hl*和H2*的浓度，每个离心管中加入适量的碳材料，使碳材料的用量刚好能够完全猝灭初始浓度Hl*和H2*単体的荧光信号，室温反应30分钟后，检测并记录体系的荧光信号； Ce)通过荧光信号对靶标生物分子进行定量分析。
2.根据权利要求I所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于步骤b中所述的荧光 基团为有机荧光染料、半导体荧光量子点或稀土荧光材料中的ー种。
3.根据权利要求I或2所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPSE缓冲液中的任意ー种，其中缓冲液中NaCl的含量彡0. I mol/L0
4.根据权利要求I或2所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于所述的生物分子为 DNA 或 RNA。
5.根据权利要求I或2所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于所述的碳材料为氧化石墨烯、石墨烯、碳纳米管、碳纳米粒子中的任意ー种。
全文摘要
本发明公开了一种生物分子的定量检测方法，它包括以下步骤(a)依据靶标生物分子序列，设计荧光标记的H1*和H2*探针；(b)将设定浓度的、标记有荧光基团的茎-环结构核酸探针H1*和H2*溶液分别置于PCR仪上95oC条件下加热2分钟，然后在室温下避光放置1~2小时，使茎环结构充分闭合；(c)将靶标生物分子配制成设定规格浓度的溶液；取数个离心管，分别加入不同规格浓度的生物分子溶液，同时分别加入H1*、H2*溶液，混合均匀后在室温下进行HCR反应；(d)待HCR反应结束后，根据步骤(b)中H1*和H2*的浓度，加入适量的碳材料，室温反应30分钟后，检测并记录体系的荧光信号；(e)通过荧光信号对靶标生物分子进行定量分析。本发明方法成本低、灵敏度高，且操作简单。
文档编号C12Q1/68GK102653789SQ20121006711
公开日2012年9月5日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者刘成辉, 李正平, 杨朗 申请人:河北大学