专利名称：利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物学领域；更具体地，涉及利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法。
背景技术：
21世纪是一个海洋大开发的时代，越来越多的沿海国家把开发海洋资源的能力作为当前评估国家综合实力的砝码。独特的海洋环境造就了各种各样的生态系统，被誉为“海上森林”的红树林就是其中之一。红树林生长在热带、亚热带海岸的潮间带，其生活环境具有强还原性、强酸性、高含盐量和营养丰富等特点。红树林具有丰富的真菌资源，目前已分离鉴定的红树林真菌超过200种，海洋真菌可以产生众多种类的天然活性化合物。海洋红树林内生真菌No. 1403属于层出镰刀菌(Fusarium proliferatum),盐生坚座壳种(Halorosellinia sp.),由香港城市大学L. L. P. Vrijmoed教授从红树林树叶内部分离得到。红树林内生真菌No. 1403经液体或固体发酵可产生20多种代谢物，包括蒽醌类(Anthraquinone)、萘醌类(Naphthoquinone)和咕吨酮类(Xanthone)等天然物质。1403C 是其产生的一种蒽醌类次级代谢物，1403C也叫做SZ-685C，1403C纯品为红色颗粒状结晶， 1403C及其乙酰化产物具有显著的抗肿瘤活性，通过Akt/FOXO途径诱导癌细胞凋亡，是一种具有较好前景的抗癌候选药物。然而，1403C在初始环境下的得率相当低，目前已经成为制约1403C用于临床前研究的瓶颈。因此通过优化其培养环境、改善其发酵工艺已成为当务之急。培养基是微生物生长的基质，本领域迫切需要借助各种优化手段，寻求利用海洋红树林内生真菌No. 1403高效生产抗癌蒽醌类化合物1403C的培养基
发明内容
甘本发明的目的在于提供利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养O
本发明的另一目的在于提供利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的方法。
在本发明的第一方面，提供一种发酵培养基，所述培养基含有
(I)葡萄糖7-20g/L ；
⑵蛋白胨0.5-2g/L ；
⑶牛肉浸膏2-8g/L ；
(4) 一水硫酸锰0. 1-0. 5g/L ；
(1)-(4)的组分溶于10-60% (v/v)浓度的人工海水中。
在一个优选例中，所述培养基含有
(I)葡萄糖9-15g/L ；
⑵蛋白胨O. 9-1. 6g/L ；
⑶牛肉浸膏3-7g/L ；
(4) 一水硫酸锰O. 2-0. 4g/L。
在另一优选例中，所述的培养基含有
(I)葡萄糖ll-13g/L ；
⑵蛋白胨0. 95-1. 2g/L ；
⑶牛肉浸膏5. 5-6. 5g/L ；
(4) 一水硫酸锰0. 2~0. 3g/L。
在另一优选例中，所述的培养基含有
(I)葡萄糖12. 36g/L ；
⑵蛋白胨I. 05g/L ；
⑶牛肉浸膏6.08g/L ；
(4) 一水硫酸锰0.246g/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，(1)-(4)的组分溶于30-50%工海水中；更佳地，(1)-(4)的组分溶于40% (v/v)浓度的人工海水中。
在另一优选例中，所述的人工海水含有
(a)氯化钠15-25g/L ；
(b)无水硫酸钠3-7g/L ；
(C)无水氯化钙l-2g/L ；
(d)六水氯化镁4-8g/L ；
(e)硼酸0. 02-0. 04g/L ；
(f)溴化钾0. 06-0. lg/L ；
(g)碳酸氢钠0. 1-0. 2g/L ；
(a)-(g)的组分溶于水(较佳地为去离子水)中。
在另一优选例中，所述的人工海水含有
(a)氯化钠18-22g/L ；
(b)无水硫酸钠4-6g/L ；
(C)无水氯化钙I. 2-1. 5g/L ；
(d)六水氯化镁5. 5-6. 8g/L ；
(e)硼酸0.025-0. 035g/L ；
(f)溴化钾0. 07-0. 09g/L ；
(g)碳酸氢钠0.14-0. 18g/L。
在另一优选例中，所述的人工海水含有
(a)氯化钠19.624g/L ；
(b)无水硫酸钠4. 908g/L ；
(C)无水氯化钙I. 392g/L ；
(d)六水氯化镁6.240g/L ；
(e)硼酸0.032g/L ；
(f)溴化钾0.08lg/L ；
(g)碳酸氢钠O. 161g/L。在本发明的另一方面，提供一种制备所述的发酵培养基的方法，包括分别称取葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、一水硫酸锰，溶于所述10-60% (v/v)浓度的人工海水中，使得它们在培养基中的终浓度分别为7-20g/L、0. 5-2g/L、2-8g/L、0. 1-0. 5g/L。在本发明的另一方面，提供所述的发酵培养基的用途，用于培养海洋红树林内生真菌No. 1403，生产蒽醌类化合物1403C。在本发明的另一方面，提供一种培养海洋红树林内生真菌No. 1403、生产蒽醌类化合物1403C的方法，包括利用前面任一所述的发酵培养基培养。在另一优选例中，所述的方法包括按3-10% (v/v)的接种量将海洋红树林内生真菌No. 1403的新鲜种子液接入前面任一所述的发酵培养基，28±2°C、170±20r/min摇床发酵培养4_7天(如5天，6天)，获得发酵液。在另一优选例中，海洋红树林内生真菌No. 1403的新鲜种子液通过如下方式获得用接种铲从新鲜的海洋红树林内生真菌No. 1403的固体平板中挖取4块3X3mm琼脂块，接种至装有IOOml种子培养基的500ml挡板瓶中，28 ± 2°C、170 ± 20r/min摇床发酵培养
2-3天，获得种子液。在另一优选例中，还包括从发酵液中分离获得蒽醌类化合物1403C。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I显示了各实施例中，海洋红树林内生真菌No. 1403在不同配方的培养基中进行发酵，得到的1403C产量。
具体实施例方式针对现有技术中难以利用海洋红树林内生真菌No. 1403高效生产抗癌蒽醌类化合物1403C(亦称SZ-685C)的现状，本发明人经过深入的研究，揭示了一种新型培养基，该培养基成分简单，制备操作方便，成本低廉，不需特殊设备，能显著提高海洋红树林内生真菌No. 1403发酵生产1403C的产量，从原来的600_800mg/L提高到2000mg/L以上。如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)” “基本上由......构成”、和“由......构成”。培养基本发明人优化了用于海洋红树林内生真菌No. 1403发酵的培养基，所述的培养基中包含葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏和一水硫酸锰。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表I所示。表I
含量优选量更优选量最优选量葡萄糖7-20g/L9-15g/L11-13g/L12.36g/L蛋白胨O.5-2g/LO. 9-1. 6g/LO. 95-1. 2g/LI.05g/L
权利要求
1.一种发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有)葡萄糖7-20g/L ；)蛋白胨O.5-2g/L ；)牛肉浸膏2-8g/L ；)一水硫酸锰O. 1-0. 5g/L ；)-(4)的组分溶于10.-60% (v/v)浓度的人工海水中。
2.如权利要求I所述的发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有)葡萄糖9-15g/L ；)蛋白胨O. 9-1. 6g/L ；)牛肉浸膏3-7g/L ；)一水硫酸锰O. 2-0. 4g/L。
3.如权利要求I所述的发酵培养基，其特征在于，所述的人工海水含有)氯化钠15-25g/L ；)无水硫酸钠3-7g/L ；)无水氯化钙l-2g/L ；)六水氯化镁4-8g/L ；)硼酸0.02-0. 04g/L ；)溴化钾0. 06-0. I g/L ；)碳酸氢钠0. 1-0. 2g/L ；-(g)的组分溶于水中。
4.如权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，所述的人工海水含有氯化钠18-22g/L ；无水硫酸钠 4-6 g/L ；无水氯化钙 I. 2-1. 5g/L ；六水氯化镁 5. 5-6. 8g/L ；硼酸O. 025-0. 035g/L ；溴化钾O. 07-0. 09g/L ；碳酸氢钠O. 14-0. 18g/L。
5.一种制备权利要求I任一所述的发酵培养基的方法，其特征在于，包括分别称取葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、一水硫酸锰，溶于所述10-60% (v/v)浓度的人工海水中，使得它们在培养基中的终浓度分别为7-20g/L、0. 5-2g/L、2-8g/L、0. 1-0. 5g/L。
6.权利要求1-4任一所述的发酵培养基的用途，用于培养海洋红树林内生真菌 No. 1403，生产蒽醌类化合物1403C。
7.—种培养海洋红树林内生真菌No. 1403、生产蒽醌类化合物1403C的方法，包括利用权利要求1-4任一所述的发酵培养基培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括按3-10% (v/v)的接种量将海洋红树林内生真菌No. 1403的新鲜种子液接入权利要求 1-4任一所述的发酵培养基，28±2°〇、170±201·/!^!!摇床发酵培养.4_7天(如5天，6天)，获得发酵液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，海洋红树林内生真菌No.1403的新鲜种子液通过如下方式获得用接种铲从新鲜的海洋红树林内生真菌No .1403的固体平板中挖取 4块3X 3mm琼脂块，接种至装有IOOml种子培养基的500ml挡板瓶中，28±2°C、170±20r/ min摇床发酵培养2-3天，获得种子液。
10.如权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，还包括从发酵液中分离获得蒽醌类化合物1403C。
全文摘要
本发明涉及利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法。揭示了一种新型培养基，该培养基成分简单，制备操作方便，成本低廉，不需特殊设备，能显著提高海洋红树林内生真菌No.1403发酵生产1403C的产量。
文档编号C12P15/00GK102586355SQ20121006701
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者周卫强, 周祥山, 张元兴, 蔡孟浩 申请人:华东理工大学