专利名称：一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测领域，具体为一种基于环媒恒温基因扩增法(LAMP)基本原理，具备速度快、特异性强等优点的基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin，简写AF)是一种真菌毒素，主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生，它影响机体的免疫系统、致突变、致畸、致癌，对动物体和人体健康造成严重威胁。 我国最新的饲料卫生标准对霉菌和毒素都做了严格要求。目前检测黄曲霉毒素的方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。但是，这些检测霉菌的方法其处理方法均局限于传统的真菌培养法以及生物学的聚合酶链式反应法(PCR)，前者操作十分麻烦，时间需要4 7天，后者对仪器以及反应条件比较高，检测成本也相应提升，难以做到较大规模推广。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，利用环媒恒温基因扩增(LAMP)法检测黄曲霉毒素真菌，可应用于饲料、食品等的样品检测。环媒恒温基因扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,简称LAMP)是日本学者Notomi等于2000年发明的一种新的高效的恒温基因扩增技术。该方法在恒温条件 (60 V 65 °C)通过4条引物B3、F3、BIP和FIP识别目的基因的6个特异性区域，在Bst DNA聚合酶的催化作用下扩增目的基因片段，反应包括链置换反应和环介导循环扩增两个密切相关的环节。本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现
一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，基于Ver-I基因建立LAMP法快速检测黄曲霉素真菌，并应用于饲料、食品的检测；应用ELISA法检测样品中AFBl毒素含量，并比较分析ELISA和LAMP检测结果，其具体包括以下制备步骤
1.制备PDA培养基称取去皮洗净的马铃薯100g，放入500 mL蒸馏水中，将水煮沸至100 °C并保持30分钟，过滤，加入10 g琼脂粉，补足水至1000 mL,调pH值至7. O,分装后高压灭菌，4 °C保温贮存备用；
2.培养菌种将黄曲霉接种于马铃薯固体培养基(PDA)上，28°C培养；
3.设置环媒恒温基因扩增(LAMP)引物；
4.提取真菌DNA模板；
5.将模板、引物、dNTP和缓冲液等反应试剂按比例配制加入PCR管，将反应体系至于 63 °C的温度条件下保温60 min，其后在80 °C下热浴3分钟灭活BstDNA聚合酶，反应终止， 产物于2. 0%琼脂糖凝胶中电泳；
6.参考株DNA提取液作模板，采用25μL反应体系。分别改变反应温度、反应时间、Mg2+的浓度、dNTP的浓度、Betaine的浓度，分别进行LAMP反应，用琼脂糖凝胶电泳判断LAMP结果，以选择最好的扩增条件；
7.用LAMP检测法扩增黄曲霉，凝胶电泳成像检查扩增产物，判断该试验的特异性；
8.以上制备的模板作IOn倍比稀释。分别取各稀释度Iμ L进行LAMP扩增。结合饲料中霉菌总数的测定方法(GB\T13092-2006)，以MPN法测定所挑取的菌液浓度；
9.按照上述方法建立黄曲霉素真菌检测试剂盒；
在本发明中，凝胶用溴化乙锭染色，用以方便紫外线透射观察。在本发明中，所述黄曲霉素真菌检测试剂盒可用SYBR Green I判断法和凝胶电泳成像法判断样品检测结果。有益效果本发明比传统的PCR技术更快、更准确。同时，LAMP法采用4条引物识别6个特异位点，保证了该方法高度特异性，同时，本发明还具备以下优点
1.本发明在检测结果的方法上，充分利用LAMP的特殊优势，运用了传统的凝胶成像检测的同时，还利用SYBR Green I实施可视化检测。SYBR Green I实施可视化检测避免了实际操作中EB带来的污染，而且检测的速度节约了 40分钟以上；
2.本发明检测饲料中毒素真菌稳定性高，可重复性好。用该方法检测了180饲料样品， 阳性率与ELISA方法吻合度高；
3.本发明中LAMP法检测饲料中黄曲霉毒素真菌检测成本不高，每个样品只需要约3.O 元。LAMP法所用到的Bst酶价格比传统的Taq酶要贵，但本实验中对该酶5倍稀释后，一方面试验结果稳定，另一方面成本明显降低，平均每个样品的Bst酶只需要O. 30元；
4.本发明所需要仪器比较简单，主要仪器只要普通水浴锅，不需要PCR仪，适用基层推
5.本发明检测样品速度非常快，扩增时间只要60分钟，检测结果判断只需要几分钟。
图I :LAMP所用的引物及用于外部引物(FIP和BIP)与内部引物(F3和B3)设计的部分 Aspergillus flavus ver_l 基因序列。图2 :三种不同裂菌方法的LAMP反应结果。图3 :不同裂菌时间的LAMP反应结果。图4 :不同dNTPs浓度对LAMP反应的影响。图5 =AMP法检测饲料产黄曲霉毒素真菌操作步骤。图6 SYBR Green I判断法检测结果。图7 :凝胶电泳成像法判断样品检测结果。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。实施例I :
基于Aspergillus flavus ver-1 gene基因序列作扩增模板,利用软件和目测在序列 25bp 221bp处设计一套特异性引物F3、B3、FIP和BIP。各引物序列。具体结果见图1，在图I中，F3和B3为外引物，也称短引物，FIP和BIP为内引物，也称长引物。其中BIP由 B2和BIC连接而成，而FIP由F2和FIC连接而成。四条引物识别目的基因6个位点。实施例2:
采用液氮提取法、微波热振法及简易提取法三种不同的裂菌方法都可以成功裂解细胞，相比而言简易提取法简单易行，并且效果稳定，为本试验采用三种方法破裂细胞制作模板LAMP扩增电泳结果如图2，在图2中，I表示液氮提取法的裂菌方法的LAMP反应结果，2 表示微波热振法裂菌方法的LAMP反应结果，3表示传统的反应法的LAMP反应结果，4表示无模板对照。实施例3:
真菌于溶菌液中 100°C分别水浴 I min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min 及 7 min, 10000 r/min离心I min后，取上清液，作为LAMP检测的模板。重复试验表明，5分钟裂菌效果稳定。具体结果见图3，在图中，f 7分别表示I分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6 分钟、7分钟时的反应显示，8表示无模板对照。实施例4:
以 O. 2 mmol / L, O. 4 mmol / L, O. 6 mmol / L, O. 8 mmol / L, I mmol / L, I. 2 mmol / L，1.4 mmol / L等几个不同的dNTPs浓度进行LAMP扩增。用以检测不同dNTPs 浓度对LAMP反应的影响，结果表明当反应体系中含dNTPs浓度小于6 mM时无特异性条带， 6 mM时出现较暗条带，当浓度在10 mM以上时条带非常明显。具体结果见图4，其中广7依次分另 1J表不 0. 2 mmol / L, 0. 4 mmol / L, 0. 6 mmol / L, 0. 8 mmol / L, I mmol / L, 1.2 mmol / L，1.4 mmol / L的dNTPs浓度对LAMP的影响，其中，8表示无模板对照组。实施例5
通过反复试验，LAMP检测饲料、食品中产黄曲霉毒素真菌的操作方法最终得以确定，并且尝试应用于实际。该方法总共包括三大步骤1.样品处理；2. LAMP扩增；3.检测结果判断。具体见图5。实施例6:
SYBR Green I判断法向LAMP产物中加入SYBR Green I，在肉眼下观察结果，阳性样品扩增产物为绿色，明亮，而阴性样品无扩增产物，颜色为橘黄色，暗淡。具体结果见图6，其中左边为阴性，右边为阳性。实施例7
凝胶电泳成像法判断样品检测结果用2%的琼脂糖凝胶，EB 2%,80 V电压下电泳45 分钟，用凝胶成像系统成像后观察，结果中有特异性条带的为阳性，反之为阴性。具体结果见图7。从湖南随机取样共180份饲料样品，其中饲料厂90份，养殖场90份，另外有从湖南各市场采集的食品样品200个。分别对这些进行ELISA检测AFBl和LAMP法检测其黄曲霉毒素真菌，并对结果进行比较分析。综合LAMP法和ELISA法检测结果，180个样品中两种检测结果均为阳性的有29份，两种检测结果均为阴性的有136，即共有165个样品两种检测检测结果吻合，吻合率为91. 67%。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
权利要求
1.一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，其特征在于，具体包括以下制备步骤1)制备PDA培养基称取去皮洗净的马铃薯100g，放入500 mL蒸馏水中，将水煮沸至 100 °C并保持30分钟，过滤，加入10 g琼脂粉，补足水至1000 mL,调pH值至7. 0，分装后高压灭菌，4 °C保温贮存备用；2)培养菌种将黄曲霉接种于马铃薯固体培养基(PDA)上，28°C培养；3)设置环媒恒温基因扩增(LAMP)引物；4)提取真菌DNA模板；5)将模板、引物、dNTP和缓冲液等反应试剂按比例配制加入PCR管，将反应体系至于63 °C的温度条件下保温60 min，其后在80 °C下热浴3分钟灭活BstDNA聚合酶，反应终止，产物于2. 0%琼脂糖凝胶中电泳；6)参考株DNA提取液作模板，采用25ii L反应体系，分别改变反应温度、反应时间、Mg2+ 的浓度、dNTP的浓度、Betaine的浓度，分别进行LAMP反应，用琼脂糖凝胶电泳判断LAMP结果，以选择最好的扩增条件；7)用LAMP检测法扩增黄曲霉，凝胶电泳成像检查扩增产物，判断该试验的特异性；8)以上制备的模板作IOn倍比稀释，分别取各稀释度IU L进行LAMP扩增，结合饲料中霉菌总数的测定方法(GB\T13092-2006)，以MPN法测定所挑取的菌液浓度；9)按照上述方法建立黄曲霉素真菌检测试剂盒。
2.根据权利要求I所述的一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，其特征在于，所述凝胶用溴化乙锭染色，用以方便紫外线透射观察。
3.根据权利要求I所述的一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，其特征在于，所述黄曲霉素真菌检测试剂盒可用SYBR Green I判断法和凝胶电泳成像法判断样品检测结果。
全文摘要
一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，基于环媒恒温基因扩增(LAMP)基本原理，具体步骤包括制备PDA培养基；培养菌种；设计环媒恒温基因扩增(LAMP)引物；提取真菌DNA模板；按比例配制加入PCR管，水浴保温反应，琼脂糖凝胶电泳等。并结合饲料中霉菌总数的测定方法(GB\T13092-2006)，以MPN法测定所挑取的菌液浓度；按照上述方法建立黄曲霉素真菌检测试剂盒。该试剂盒检测饲料、食品中黄曲霉毒素真菌特异性强、敏感性高，检测快速，成本低，而且可以同时检测多个样品，适合基层饲料卫生检测，值得广泛推广。
文档编号C12Q1/04GK102586455SQ20121006635
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者万俊松 申请人:万俊松