专利名称：大菱鲆t170g单核苷酸多态性标记的检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传标记研究技术，具体涉及一种检测大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism, SNP)的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)分子标记是基因组中最丰富的突变类型，因它数量多，覆盖密度大，位点丰富，几乎分布于整个基因组，具有片段短易于扩增、遗传稳定性强等特点； 易于高通量、自动化分析，易于遗传机制的研究等优势，所以它是遗传育种研究中的热门领域。有关大菱鲆SNP标记开发的研究，在本发明做出之前，国内外有部分相关的报道，国内湖北省林业科学研究院张新叶等(华中农业大学学报2009)发表的基于EST序列的杨树候选SNPs标记分析，曾报道了利用生物信息学方法对来自2个不同cDNA文库的2万余条杨树EST序列进行了候选SNPs标记筛选的方法，但是研究对象并非大菱鲆，而且后期的验证方法为重新测序法，该方法需要的成本高，而且重新测序的样品数量少，随机误差较大。 丰贵鹏等(生命的化学2010)发表的高分辨率熔解曲线法的非标记探针基因分型技术，曾报道了高分辨率熔解曲线技术的基本原理和实验中的注意事项，但只是综述，对发明探索有一定帮助，没有具体的实验方案和技术路线参考。殷豪等(园艺学报2011)发表的利用高分辨率熔解曲线(HRM)分析梨微卫星标记，曾报道了利用高分辨率熔解曲线(HRM)分析微卫星(即SSRs)序列多态性的方法，它是对已知位点进行多态性检测，对实验的精密度要求相对较低，而本发明不需要有已知突变位点这个前提，而且对实验的精密度要求较高; 西班牙 Manuel Vera 等(Aquaculture2011)发表的 Validation of single nucleotide polymorphism(SNP)markers from an immune Expressed Sequence Tag(EST) turbot, Scophthalmus maximus, database,曾报道基于EST序列开发大菱鲆SNP标记的方法，他运用基于四种可能核苷酸两步反应法对候选SNP荧光检测进行基因分型验证，共筛选出77个大菱鲆SNP标记。但是他们分析EST序列时，应用的软件是CAP3和QualitySNP，该软件的运行需要Iinux操作系统，操作相对繁琐。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记的检测方法，该方法费用低、特异性准确性高、重复性好、操作简便，可快速高通量地检测大菱鲆 T170GSNP 标记。本发明是按如下技术方案实现的一种大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记的检测方法，包括1)、基因组DNA提取； 2)、候选SNP筛选；3)、引物、探针设计；4)、不对称PCR扩增；5)、探针杂交；6)、数据采集； 7)、基因分型，具体步骤如下I)、基因组DNA提取提取大菱鲜基因组DNA,将其稀释为20ng/ul ；2)、候选 SNP 筛选米用 Vector NTI Advancell 综合软件包中的 Contig Express模块对大菱鲆EST序列进行聚类、拼接，再利用拼接后的EST重叠群通过人工判读的方式筛查出候选T170GSNP位点，候选T170GSNP位点所在的基因序列为CCTGAACACTGGAACCTTCAC ATTATAACACACTGAAGTCAAGAAAAGCAGACAATCCTCTGTAACAGCTTAGTTTTTAATAGATTTGACAAAATCCA TATTATTCATACCTGAAAGTGACGCATGAGACGTACAGGGTACCAATAACACAGTATGGTCCGAGTAGTGTT T TGT GTGTGTGTGTGTATGAAACAGGAACTACTTTCTAGAAAAAAAACAGTACAGTCACGTGAGTGCTAGGTGAGTTATTC TGTTTTCTGCTGT，其中加粗、加下划线的碱基即为候选T170GSNP位点；3)、引物、探针设计在候选T170GSNP位点两端设计特异性引物，目的片段长度小于350bp，引物设计用Primer5. 0，参数分析用01igo7. 0 ;根据候选T170GSNP位点设计3’端封闭非标记探针，探针的退火温度范围为60°C-80°C，探针3’端采用2 碱基错配封闭，探针序列为5 ’ -ACACACAAACACTACTCGGACTT-3 ’；特异性引物正链为 5’ -CCTGAACACTGGAACCTT-3’，负链为5’ -TACAGCAGAAAACAGAATAACT-3 ’，引物退火温度 54 0C ；4)、不对称PCR扩增使用候选T170GSNP对应引物对步骤I所提取的大菱鲆基因组DNA进行不对称PCR扩增；不对称PCR反应体系为15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因组 DNAlul，10XPCR buffer I. 5ul，2. 5mMdNTPs 各 I. 2ul，25mMMgCl2 I. 2ul,5U/ul Taq DNA polymeraseO. 075ul, IXLC Green Plusl. 5ul，10 y M 正链引物 I. 2ul，2 y M 负链引物 I. 2ul,加 ddH20 至 15ul ;设置 PCR 仪的程序为 95°C 变性 5min ；94°C 30sec，56°C 30sec, 72°C 30sec，60 个循环；72°C延伸 7min，4°C保存；5)、探针杂交将不对称PCR扩增产物与3’端封闭的非标记探针进行杂交，杂交体系为每个不对称PCR反应体系中加入10 ii M对应位点的3’端封闭的非标记探针I. 5ul，设置PCR仪的杂交程序变性温度95°C lOmin，之后自然降至室温，置4°C保存；6)、数据采集将杂交产物置于Light Scanner分析仪上进行高分辨率熔解曲线采集，采集曲线的温度范围为45°C至97°C，每摄氏度获得10个点，升温速度为0. I0C /s ；7)、基因分型数据的检索和分析运用Light Scanner分析软件,确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。本发明与现有技术相比的有益效果本发明不需要有已知突变位点，通过Vector NTI Advancell综合软件包中的 ContigExpress软件对大菱鲆EST序列进行聚类、拼接,从重叠群中筛选出候选SNP,在其两端设计特异性引物进行不对称PCR扩增，经过条件优化之后，该引物能够准确的扩增出 T170GSNP标记，在其位点前后(包含该位点)设计3’端封闭的非标记探针与扩增产物杂交，该探针能够较好地与SNP标记基因座杂交，杂交产物在大菱鲆群体检测中呈现较好多态性；本发明应用高分辨率熔解曲线分析快速检测大菱鲆每个个体在SNP位点的遗传变异情况，可快捷获得该引物对大菱鲆多态性图谱，所得结果可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型，以期找到与该SNP位点连锁的性状，为以后与传统方法结合进行育种工作
奠定基础。本发明运用的是Vector NTI Advance 11综合软件包中的ContigExpress Project软件，操作相对简便，而且运用高分辨率熔解曲线进行SNP基因分型实现了低成本、高精度、高通量的闭管操作，大大降低了实验过程中可能的污染造成的误差。
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明基于表达序列标签(EST)的检测大菱鲆T170GSNP遗传标记的方法。图I :T170GSNP引物对大菱鲆42个个体高分辨率熔解曲线图谱A T170GSNP引物对大菱鲆42个个体标准化的熔解曲线图；B T170GSNP引物对大菱鲆42个个体衍生的基因分型峰图；C :大菱鲆42个个体对应样品的位置图。编号A01-D06代表大菱鲆的42个个体，其中浅灰色样品(a)代表野生纯合基因型，深灰色样品(b)代表突变杂合基因型，黑色样品(c)代表突变纯合基因型。
具体实施例方式一种大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记的检测方法，包括I)、基因组DNA提取；
2)、候选SNP筛选；3)、引物、探针设计；4)、不对称PCR扩增；5)、探针杂交；6)、数据采集; 7)、基因分型，具体步骤如下I.基因组DNA提取本实验样品来源于烟台天源水产有限公司8个家系10个不同性状群体的42个个体，运用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN)法提取DNA。a、取新鲜样品的肌肉组织20mg，放入装有200 ii LGA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。b、加入20y L 蛋白酶K(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠，在56°C放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。C、加入200 缓冲液GB，充分颠倒混匀， 70°C放置lOmin，溶液变得清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。d、加入200 y L无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。e、将所得溶液和絮状沉淀均加入吸附柱CB3中，(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。f、向吸附柱CB3中加入500 u L缓冲液⑶，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。g、向吸附柱CB3中加入700 u L漂洗液PW， 12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。h、向吸附柱CB3中加入500ul 漂洗液PW, 12000rpm离心30s,倒掉废液。i、将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心 2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。j、 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60 y L洗脱缓冲液 TE，室温放置4min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将其定量稀释成20ng/ul 备用。2、候选SNP筛选米用Vector NTI Advancell综合软件包中的ContigExpress模块对大菱鲆EST序列进行聚类、拼接，再利用拼接后的EST重叠群通过人工判读的方式筛查出候选T170GSNP 位点，候选 T170GSNP 位点所在的基因序列为CCTGAACACTGGAACCTTCACATTATAACACACTGAAG TCAAGAAAAGCAGACAATCCTCTGTAACAGCTTAGTTTTTAATAGATTTGACAAAATCCATATTATTCATACCTGAA AGTGACGCATGAGACGTACAGGGTACCAATAACACAGTATGGTCCGAGTAGTGT T TGTGTGTGTGTGTGTATGAAA CAGGAACTACTTTCTAGAAAAAAAACAGTACAGTCACGTGAGTGCTAGGTGAGTTATTCTGTTTTCTGCTGT，其中
5加粗、加下划线的碱基即为候选T170GSNP位点；3.引物、探针设计在候选T170GSNP位点两端设计特异性引物，目的片段长度小于350bp，引物设计用Primer5. 0，参数分析用01igo7. 0 ;根据候选T170GSNP位点设计3’端封闭非标记探针，要求探针的退火温度范围为60°C -80°C，探针3’端采用2碱基错配封闭， 探针序列为5 ’ -ACACACAAACACTACTCGGACTT-3，;由于SNP突变率相对较高，在杂交的过程中造成单碱基错配的变化，这是检测单核苷酸多态性的根源；特异性引物正链为 5’ -CCTGAACACTGGAACCTT-3’，负链为5’ -TACAGCAGAAAACAGAATAACT-3 ’，引物退火温度 54 0C ；4.不对称PCR扩增使用候选T170GSNP对应引物对步骤I所提取的大菱鲆基因组DNA进行不对称PCR扩增；不对称PCR反应体系为15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因组DNAlul， 10XPCR bufferl. 5ul，2. 5mMdNTPs 各 I. 2ul，25mMMgCl2l. 2ul，5U/ul Taq DNA polymerase (Takara) 0. 075ul, I XLC Green Plusl. 5ul, 10 u M 正链引物 I. 2ul,2iiM 负链引物 I. 2ul，加 ddH20 至 15ul ;设置 PCR 仪的程序为 95°C变性 5min ；94°C 30sec，56°C 30sec, 72°C 30sec，60 个循环；72°C延伸 7min，4°C保存；5.探针杂交将不对称PCR扩增产物与3’端封闭的非标记探针进行杂交，杂交体系为每个不对称PCR反应体系中加入10 ii M对应位点的探针I. 5ul，设置PCR仪的杂交程序变性温度 950C lOmin，之后自然降至室温，置4°C保存；6.数据采集将杂交产物置于Light Scanner分析仪(Idaho, LightScanner96)上进行高分辨率熔解曲线采集，采集曲线的温度范围为45°C至97 V，每摄氏度获得10个点，升温速度为 0. rc /s ；7.基因分型数据的检索和分析动用Light Scanner分析软件,确定每个个体的基因型,并获得大菱鲆的遗传多态性图谱(如图I中的A、B、C所示)。
权利要求
1. 一种大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记的检测方法，其特征在于它的方法包括1)、 基因组DNA提取；2)、候选SNP筛选；3)、引物、探针设计；4)、不对称PCR扩增；5)、探针杂交；6)、数据采集；7)、基因分型，具体步骤如下1)、基因组DNA提取提取大菱鲆基因组DNA，将其稀释为20ng/ul；2)、候选SNP筛选米用VectorNTI Advancell综合软件包中的Contig Express模块对大菱鲆EST序列进行聚类、拼接，再利用拼接后的EST重叠群通过人工判读的方式筛查出候选T170GSNP位点，候选T170GSNP位点所在的基因序列为CCTGAACACTGGAACCTTCACATTA TAACACACTGAAGTCAAGAAAAGCAGACAATCCTCTGTAACAGCTTAGTTTTTAATAGATTTGACAAAATCCATATT ATTCATACCTGAAAGTGACGCATGAGACGTACAGGGTACCAATAACACAGTATGGTCCGAGTAGTGT T TGTGTGTG TGTGTGTATGAAACAGGAACTACTTTCTAGAAAAAAAACAGTACAGTCACGTGAGTGCTAGGTGAGTTATTCTGTTT TCTGCTGT，其中加粗、加下划线的碱基即为候选T170GSNP位点；3)、引物、探针设计在候选T170GSNP位点两端设计特异性引物，目的片段长度小于 350bp，引物设计用Primer5. O,参数分析用01igo7. O ;根据候选T170GSNP位点设计3’端封闭非标记探针，探针的退火温度范围为60°C -80°C，探针3’端采用2碱基错配封闭，探针序列为 5’ -ACACACAAACACTACTCGGACTT-3’;特异性引物正链为5’ -CCTGAACACTGGAACCTT-3’， 负链为5’ -TACAGCAGAAAACAGAATAACT-3’，引物退火温度 54°C ；4)、不对称PCR扩增使用候选T170GSNP对应引物对步骤I所提取的大菱鲆基因组DNA进行不对称PCR扩增；不对称PCR反应体系为15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因组 DNAlul, IOXPCR buffer I. 5ul,2. 5mMdNTPs 各 I. 2ul，25mMMgC121. 2ul，5U/ul Taq DNA polymeraseO. 075ul，IXLC Green Plusl. 5ul，ΙΟμΜ 正链引物 I. 2ul，2yM 负链引物1.2ul,加 ddH20 至 15ul ;设置 PCR 仪的程序为 95°C变性 5min ；94°C 30sec，56°C 30sec, 72°C 30sec，60 个循环;72°C延伸 7min，4°C保存；5)、探针杂交将不对称PCR扩增产物与3’端封闭的非标记探针进行杂交，杂交体系为每个不对称PCR反应体系中加入10 μ M对应位点的3’端封闭的非标记探针I. 5ul ;设置 PCR仪的杂交程序变性温度95°C lOmin，之后自然降至室温，置4°C保存；6)、数据采集将杂交产物置于LightScanner分析仪上进行高分辨率熔解曲线采集， 采集曲线的温度范围为45°C至97°C，每摄氏度获得10个点，升温速度为0. I0C /s ；7)、基因分型数据的检索和分析运用LightScanner分析软件,确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。
全文摘要
一种大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记的检测方法，首先提取大菱鲆基因组DNA并稀释备用；再分析EST的序列筛选包含候选SNP位点的序列，在其两端设计特异性引物，在其位点前后(包含该位点)设计3’端封闭的非标记探针；然后使用该引物对大菱鲆群体基因组DNA进行不对称PCR扩增；将扩增产物与3’端封闭的非标记探针杂交；将杂交产物置于LightScanner上检测熔解曲线并分析，获得大菱鲆的遗传多态性图谱。本发明适用于大菱鲆群体遗传标记、系谱认证、遗传连锁图谱构建等检测技术；本发明可快捷地获得大菱鲆T170GSNP标记的遗传变异图谱，方便、快捷、准确，可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型。
文档编号C12Q1/68GK102586454SQ201210066268
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者刘庆明, 王新安, 马爱军, 黄智慧 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所