专利名称：一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法
技术领域：
本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用基因芯片方法来检测黄病毒的方法。
背景技术：
黄病毒属(Flavircls)是一大群具有包膜的单正链RNA病毒。该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染。过去曾归类为虫媒病毒。在我国主要流行的黄病毒有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和登革病毒。这类病毒结构相似，大多数是20面体立体对称的有包膜的RNA病毒。它们能在节肢动物(如蚊、蜱、白蛉等)体内增殖，对节肢动物不致病，但可以通过昆虫呵咬传染给脊椎动物或人，引起自然疫源性疾病。大多数的病毒引起人畜共患的、自然疫源性疾病，呈多种多样的临床表现，主要包括脑炎或脑脊髓炎以及全身性感染等。由于节肢动物既是储存宿主又是传播媒介，其分布受地理与气候的影响，故所致疾病具有明显的季节性和地域性。黄病毒科(Flaviviridae)包括3个病毒属，即黄病毒属(flavivirus)、痕病毒属(pestivirus)和丙型肝炎病毒属(hepacivirus),共有60多种病毒。
发明内容
针对黄病毒，本发明提供一种能够简单快速区分4种黄病毒的检测方法。本发明是通过以下技术方案实现的(I)制备黄病毒检测基因芯片；(2)设计通用引物用于扩增多种黄病毒特异性基因片段；(3)将扩增产物与基因芯片进行杂交；(4)扩增完毕后将产物与芯片杂交，杂交后，进行免疫反应，通过芯片上的颜色变化判断检测结果。该方法包括应用该方法检测黄病毒所需要的通用引物和与之配套的PCR反应条件。其中引物序列如下引物SEQ ID NO. I :5’ AACATGATGGGNAAYAGAGAGAASEQ ID NO. 2 :5’ GTGTCCCANCCNGCMGTYTCYGC。核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量
PCR缓冲液10倍5wL
MgCl22OmmoI/ L5 μ L
Taq DNΛ 聚合酶5u/ μ LO. 3 μ L
SEQ ID NO. I10umol/L2 μ L
SEQ ID NO. 210umol/L2 μ L
dNTPs 每种 2. 5_ol/LO. 3 μ L
DIG-dlJTPlmmol/L0. 3 u L
模板DNA2 μ L
双蒸水33. I μ L
总体积50 μ L核酸扩增程序为(1)95°C IOmin(2) 95 °C 30s(3) 55°C 20s(4) 72°C 30s(5)回到第(2)步，重复35次(6) 72 0C 2min以及制备检测基因芯片所用的寡核苷酸探针黄热病病毒探针SEQ ID NO. 3 5’ TGTAATCAAGGACCTATCCACCAAAGAAGGGGGAGGAT西尼罗病毒探针SEQ ID NO. 4 5， AAACTGGGTTAACATCCTGCGTGAAGTTGGCACCCGGCCT日本脑炎病毒探针SEQ ID NO. 5 5’ TTCAGGCGTCCAAAAGTTGGGATACATTCTCCGTGACATA森林脑炎病毒探针SEQ ID NO. 6 5， CTGGCACCTAAAAAATTGTCAACATTGGAAGGAGGCCTCTo 基因芯片的制备方法为将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上，点好样的尼龙膜在长波紫外灯下进行交联5_10min,同时将0. 2 μL标记有地高辛基团的基因片段也点在每一张尼龙膜上，作为阳性对照，将双蒸水也点在每一张尼龙膜上，作为阴性对照。3、杂交和杂交斑点的酶联免疫显色，按照地高辛DNA标记与检测试剂盒的说明书进行。地高辛标记PCR产物和寡核苷酸探针杂交方法如下预杂交预杂交液先预热到53°C，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于53°C预杂交30min。PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95°C，IOmin,迅速插入冰浴。 地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10 μ L，再加入ImL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。53°C杂交lhr，温和摇动。杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。结果判读尼龙膜上的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列。该引物序列及探针序列参照GenBank中多种黄病毒序列中的NS5基因。本发明用特异性的芯片检测黄病毒，反应后目测结果未发现假阳性和假阴性的结
果O与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，基于基因芯片方法适用于高通量检测黄病毒能够一次检出多种黄病毒。大大提高了效率节约了时间，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
图I基因芯片模式图，P系列为3个平行的阳性参照点，N系列为3个平行的阴性参照点，I系列点为3个平行的黄热病病毒探针点，2系列点为3个平行的西尼罗病毒探针点，3系列点为3个平行的日本脑炎病毒探针点,4系列点为3个平行的森林脑炎病毒探针点。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。实施例I样本某待测样品。I.样品处理将样品混匀处理。2.核酸抽提取样品在PBS中重悬，使用RNA抽提试剂盒根据说明书要求进行RNA抽提。3. cDNA 的制备
将总RNA使用RNA逆转录试剂盒，根据说明书要求逆转录RNA为cDNA。4. PCR 扩增等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR缓冲液 10倍5uL
MgCl2 2OmmoI/ L5 μ L
Taq DNA 聚合酶 5u/ μ LO. 3 μ L
SEQ ID NO.I 10 μ mol/L2 μ L
SEQ ID NO. 2 10umol/L2 μ L
dNTPs 每种 2. 5mmol/LO. 3 μ L
DIG-dUTP lmmol/L0. 3 μ L
模板DNA2 μ L
双蒸水33. I u L
总体积50 μ L核酸扩增程序为(I) 95°C IOmin(2) 95 °C 30s(3) 55°C 20s(4) 72°C 30s(5)回到第(2)步，重复35次(6) 72 0C 2min5.预杂交预杂交液先预热到53°C，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于53°C预杂交30min。
PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95°C，IOmin,迅速插入冰浴。地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10 μ L，再加入ImL杂交液(Rochc公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。53°C杂交lhr，温和摇动。杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。结果判读尼龙膜上阳性参照和黄病毒探针呈现的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列，样品含有黄病毒核酸。实施例2样本某待测样品。I.样品处理将样品混匀处理。2.核酸抽提取样品在PBS中重悬，使用RNA抽提试剂盒根据说明书要求进行RNA抽提。3. cDNA 的制备将总RNA使用RNA逆转录试剂盒，根据说明书要求逆转录RNA为cDNA。4. PCR 扩增 等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR缓冲液10倍5uL
MgCl 220mmol/ L5 μ L
Taq DNA 聚合酶5u/ μ LO. 3 μ L
SEQ ID NO. I10 μ mol/L2 μ L
SEQ ID NO. 210μ mol/L2 μ L
dNTPs每种 2. 5mmol/LO. 3 μ L
DIG-dUTPlmmol/LO. 3 μ L
模板DNA2 μ L
双蒸水33. I μ L
总体积50 μ L核酸扩增程序为(I) 95°C IOmin(2) 95 °C 30s(3) 55°C 20s(4) 72°C 30s(5)回到第(2)步，重复35次(6) 72 °C 2min5.预杂交预杂交液先预热到53°C，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于53°C预杂交30min。PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95°C，IOmin,迅速插入冰浴。
地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10 μ L，再加入ImL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。53°C杂交lhr，温和摇动。杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。结果判读
尼龙膜上阳性参照和日本脑炎病毒探针呈现的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列，样品含有日本脑炎病毒核酸。
权利要求
1.一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法，其特征在于，包括以下两个引物SEQ ID NO. I :5’ AACATGATGGGNAAYAGAGAGAASEQ ID NO. 2 :5’ GTGTCCCANCCNGCMGTYTCYGC。
2.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法，其特征在于，包括以下四个探针 黄热病病毒探针SEQ ID NO. 3 :5’ TGTAATCAAGGACCTATCCACCAAAGAAGGGGGAGGAT 西尼罗病毒探针SEQ ID NO. 4 :5’ AAACTGGGTTAACATCCTGCGTGAAGTTGGCACCCGGCCT日本脑炎病毒探针SEQ ID NO. 5 :5’ TTCAGGCGTCCAAAAGTTGGGATACATTCTCCGTGACATA森林脑炎病毒探针SEQ ID NO. 6 5C TGGCACCTAAAAAATTGTCAACATTGGAAGGAGGCCTCT。
3.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量 PCR缓冲液10倍5uLMgC122OmmoI/ L5 u LTaq DNA 聚合酶5u/ u L0. 3 n LSEQ ID NO. IIOu mol/L2 u LSEQ ID NO. 2IOu mol/L2 u LdNTPs每种 2. 5mmol/L0. 3 u LDIG-dUTPImmo I/L0. 3 y L 模板DNA2u L双蒸水33. IuL总体积50 u L。
4.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法，其特征在于，核酸扩增程序为(1)95°CIOmin(2)95 °C 30s(3)55°C 20s (4)72。。30s (5)回到第⑵步，重复35次(6)72 0C 2min。
5.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法，其特征在于，标记的PCR产物与芯片的杂交温度为53°C。
全文摘要
本发明公开了一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法，设计了通用引物组序列，5’AACATGATGGGNAAYAGAGAGAA；5’GTGTCCCANCCNGCMGTYTCYGC；和用于检测4种不同黄病毒的特异性探针5，TGTAATCAAGGACCTATCCACCAAAGAAGGGGG；5’GTTAACATCCTGCGTGAAGTTGGCACCCGGCCT；5’GCGTCCAAAAGTTGGGATACATTCTCCGTGACATA；5’GCACCTAAAAAATTGTCAACATTGGAAGGAGGCC。针对黄病毒，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速高通量能够分型检测黄病毒的检测方法。
文档编号C12R1/93GK102808042SQ201210065898
公开日2012年12月5日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者祁军, 杨春江, 李智慧, 王奉新, 刘寅, 李毅, 王世魁 申请人:中华人民共和国天津出入境检验检疫局