专利名称：用于检测nlrp7基因的基因芯片、检测试剂和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片、其检测试剂和试剂盒，尤其涉及一种用于检测NLRP7基因的基因芯片、检测试剂和试剂盒。
背景技术：
葡萄胎(Hydatidiform Mole，HM)是最常见的妇科疾病，是一种异常的人类妊娠，以绒毛间质水肿、滋养细胞增生同时缺乏胚胎发育或者异常的胚胎发育为特征。葡萄胎最常见的是散发性，而非复发性，在南美葡萄胎的发生率为每1000-1500次妊娠I次，但在拉丁美洲，中东及远东有更高的发生率。我国和东亚地区是葡萄胎的高发区，发生率为北美和欧洲国家的7-10倍，中国以浙江省为最高，为每120-700次妊娠I次；葡萄胎患者妊娠结局令人担忧，在有一次葡萄胎经历的妇女中，根据不同的人群有1-6%会再患葡萄胎，有10-20%会罹患自然流产等不良妊娠生育结局；二次葡萄胎后则有20-30%的再患葡萄胎概率。因此葡萄胎不是独立的疾病，它同样适合任何形式的生育结局不良。复发性的生育结局不良对年轻夫妇的身心打击是巨大的；同时也造成消耗大量的卫生资源(在北美，由于反复就诊及大量的实验室检查，使得每对夫妇至少化费50，000美元，在中国同样费用高昂)；此外尚有15-20%的葡萄胎会恶变为妊娠滋养细胞肿瘤，甚至危及患者的生命。人们从未在动物身上发现过葡萄胎，因此通过建立动物模型获悉数据的可能性很小，先前有关葡萄胎发生的分子机制的研究集中在家族性复发性葡萄胎(FamilialRecurrent Mole, FRM), FRM是指在一个家系中两个或以上的家族成员反复发生葡萄胎，属孟德尔常染色体隐性遗传性疾病，其确切的发生率不明，但比较罕见。我们的合作者SLIM团队率先对FRM进行了遗传学研究，首次报道了 FRM染色体双亲来源的遗传背景，并确定了其遗传易感基因的侯选区域定位于染色体19ql3.3—19ql3.4区域(5) ；2006年，SLIM团队通过基因克隆与定位的方法发现了第一个与复发性葡萄胎及不良生育结局相关的致病基因NLRP7基因(其基因序列如 SEQ ID N0.1所示)，至今，多个研究机构报道了在不同人种的复发性葡萄胎患者中已发现62个不同的NLRP7基因突变位点(见INFEVERS，http://fmf.1gh.cnrs.fr/ISSAID/infevers/),在SLIM实验室,大约60%的复发性葡萄胎患者存在NLRP7基因突变。证明了 NLRP7基因是复发性葡萄胎重要的发病相关基因。这些变异包括终止子的改变，重排，小的缺失，插入，接合子改变及无义突变。NLRP7基因双位点突变导致二倍体双亲来源的葡萄胎。至今，来自不同实验室已报道了 39例NLRP7基因双位点突变所致葡萄胎均是二倍体双亲来源的葡萄胎。NLRP7基因单位点突变可致各种核型葡萄胎。NLRP7基因突变导致合子后分裂异常。NLRP7基因突变与各种类型的妊娠丢失相关。最近研究发现，大约13%的散发性葡萄胎患者存在NLRP7基因突变，大约8%的复发性流产患者存在NLRP7基因突变，同时在一些普通人群中偶见NLRP7基因非同义突变，这些人常为复发性妊娠丢失的易感人群。男性NLRP7基因突变不改变生育结局。、有关NLRP7基因功能研究:NLRP7是胞浆蛋白，包含了三个主要的功能区域，是NLRP7家族14个成员中的一员，属于CATERPILIER家族的亚家族，CATERPILIER被认为与主动免疫、凋亡和病原诱导的炎症的细胞内调节有关。至今NLRP7家族中已有5个基因发现与数种人类疾病密切相关，全都涉及多系统的感染；NLRP基因族被认为介导激活宿主先天免疫系统对所谓的抗原相关分子模式(PAMPs)诸如细菌来源的产物作出反应；NLRP蛋白募集其它衔接蛋白行成蛋白复合物形成炎症小体，炎症小体激活前CASPASE-1使其在在IL-1 β 116位天冬氨酸处切开才能使IL-1 β成为成熟形式并促使其分泌到细胞外；分泌的IL-1 β介导激活其它的细胞因子并募集淋巴细胞到感染部位对抗病原微生物及引起组织损伤。同样的，作为NLRP7家族成员之一，在唯一的一个体外研究中发现NLRP7基因抑制IL-1 β及CASPASE-1前体的加工，并且具有抑制Caspase-1依赖性的IL-1 β的分泌的作用；革兰氏阴性菌细胞壁成份脂多糖(LPS)与IL-1 β可以增加外周血单个核细胞的NLRP7基因表达，NLRP7基因表达增强可以反馈调节抑制了 IL-1 β的分泌，因此NLRP7可以抑制LPS诱导的IL-1 β的分泌。目前Slim团队体外研究发现NLRP7基因突变者外周血淋巴细胞对各种炎症刺激受损及分泌较低水平的IL-1和TNF，推测炎症反应受损后使得胚胎发育停止或异常，机体耐受绒毛水肿变性及葡萄胎的发生。发明人通过测序及比对分析对300例中国人种散发性葡萄胎与300例中国人种无不良生育史的妇女进行NLRP7基因突变筛查，发现20个突变位点，14个变异位点，NLRP7基因突变变异率为11.33%，NLRP7基因共有11个外显子，突变变异位点集中分布在外显子4,2,3,5,6,偶发在外显子9，14例NLRP7基因突变位于外显子4 (14/20)，5例NLRP7基因突变位于外显子2 (5/20)， I例NLRP7基因突变位于外显子6 (1/20)。同时对35例中国人种复发性妊娠丢失(其中至少一次是葡萄胎)患者进行NLRP7基因突变筛查，发现了 11位患者(31.4%)存在NLRP7基因突变，7例患者为双位点突变，4例患者为单位点突变，仅2例患者为纯合子突变；其中23例为复发性葡萄胎患者，11例患者(48%)发现至少一个位点的NLRP7基因突变。与已发表的数据相比，中国人种葡萄胎的发生具有以下三个特点:1.中国人种复发性葡萄胎NLRP7基因突变率48%明显低于另外两个亚洲种族。巴基斯坦RHM患者(11例)NLRP7基因突变率81%，而印度人种RHM患者(13例)NLRP7基因突变率为84% ;虽然缺乏NLRP7基因突变不能绝对排除NLRP7基因的突变，如发生在内含子的变异及促进子的变异，或者大的缺失，重排和复制有时不能用常规的DNA测序手段发现变异；2.中国人种复发性葡萄胎患者仅20%为纯合子突变，明显低于巴基斯坦RHM患者88%和印度RHM患者72%，中国人种存在着较低的同源率，可能与国家大，人口多，人群迁移机会多相关。葡萄胎发病具有种族与地域的差异，种族差异主要是遗传差异，这也证明遗传因素在葡萄胎发病中起重要作用，在不同群体中可能存在发病机制上的差异，提示在中国人中开展葡萄胎易感基因和发病机制的研究有着其他人种同类研究不可替代的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测NLRP7基因的基因芯片、检测试剂和试剂盒。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种用于检测NLRP7基因的基因芯片，它包括固相载体和合成在该载体上的寡核苷酸探针等，所述寡核苷酸探针是针对检测与葡萄胎相关的NLRP7基因的18个SNP位点所在的核苷酸序列；所述的18个SNP位点具有SEQ ID N0.182-199所示的核苷酸序列；所述寡核苷酸探针具有SEQ ID N0.2-145所示的核苷酸序列。一种用于检测样本中NLRP7基因的检测试剂，它包括上述的基因芯片和18对用于扩增样本中各SNPs的PCR引物等，所述PCR引物具有SEQ ID N0.146-181所示的核苷酸序列。一种用于检测样本中NLRP7基因的试剂盒，它包括上述的检测试剂、一阴性对照样本和一阳性对照样本等，所述阴性对照样本为无菌纯水，所述阳性对照样本为确认的由SEQ ID N0.1-18中某一 DNA片段突变的DNA片段。本发明的有益效果是:本发明检测NLRP7基因的SNP分型芯片、检测试剂和试剂盒可快速、准确检测临床样本中的NLRP7基因各个相关SNPs位点。该检测系统通量大、灵敏度高，对于葡萄胎的临床诊断和高危人群早期筛查、早期预防干预具有重要的意义，可广泛用于临床高效筛查葡萄胎高 危人群。
图1为基因芯片的一般制作流程 图2为PCR扩增流程图。
具体实施例方式芯片合成:采用原位合成检测探针的技术在芯片上合成与检测位点序列互补的探针，检测位点包含了 A，T，C，G四种碱基类型的探针。具体原理如下:在原位合成芯片上通过程序控制添加光敏基团保护的单核苷酸，依次平行合成所设计的寡核苷酸探针。所述的寡核苷酸探针包含与检测位点互补序列，和延伸臂。延伸臂将连接芯片基部与检测位点互补序列减少探针的空间位阻。然后对合成芯片进行质检，包括本底背景扫面以及将带有荧光信号的核酸物质与指控探针杂交检测来确定合成芯片质量。检测位点扩增、标记:根据待检测的位点在基因组序列上的位置，在所设计探针的两侧合适区域根据引物设计标准设计引物。以检测样本DNA位模板，进行标记PCR反应。纯化获得的荧光标记产物与合成芯片杂交、扫描和结果分析。其流程如图1所示。本发明的基因芯片包括固相载体和合成在该载体上的寡核苷酸探针，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质，寡核苷酸探针是针对检测与葡萄胎相关的NLRP7基因的18个SNP位点所在的核苷酸序列。上述的18 个 SNP 位点包括:c.[198G>C] ; [=]，c.[251G>A] ； c.[271G>A]；c.[316G>A] ；c.[376T>A] ； [=] , c.[614G>A] ； [=] , c.[728C>T] ；c.[924C>A]；[=],c.[1071C>G] ；[=],c.[1137G>C] ；[=],c.[1441G>A] ； [=],c.[1460G>A] ；c.[1538C>T]；[=],c.[1757T>C] ；c.[1879G>C] ； [=], c.[2165A>G] ；c.[2201C>T]和 c.[2809C>T]。它们具有SEQ ID N0.182-199所示的核苷酸序列。根据所述18个SNP位点和侧翼序列设计SNP检测探针，针对每个SNP位点，设计4组探针，每组探针具有正、反两条核苷酸序列，故本发明针对检测与葡萄胎相关的NLRP7基因的18个SNP位点所在的核苷酸序列的寡核苷酸探针具有SEQ ID N0.2-145所示的核苷酸序列。
本发明用于检测样本中NLRP7基因各相关性SNPs的检测试剂包括上述基因芯片和18对用于扩增样本中各SNPs的PCR引物。所述PCR引物具有SEQ ID N0.146-181所示的核苷酸序列。在使用时，抽提待检测样品的基因组DNA，以每个待检测SNP位点设计上下游引物并进行PCR扩增，在扩增过程中引入荧光标记。荧光标记的核酸靶标分子通过碱基互补配对原则与芯片上的探针杂交，通过芯片扫描获得每个位点的荧光信号。上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。本发明的试剂盒中还包括相应的阴性对照样本和阳性对照样本。阴性对照样本为无菌纯水，阳性对照样本为确认的由SEQ ID N0.1-18中某一 DNA片段突变的DNA片段。如:由SEQ ID N0.1突变的DNA片段，具有SEQ ID N0.200-202所示的核苷酸序列。下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。实施例1:NLRP7基因各相关SNPs检测芯片的制备 1.芯片制备过程:
(O将设计的探针序列保存，通过计算机程序优化芯片合成时添加碱基的顺序，在基片上通过化学反应合成含有相应探针序列的芯片。(2)芯片质检:
I)合成完成后，经清洗的芯片在GenePiX4100B扫描仪上，在PMT=750强度下对芯片进行扫面，检测芯片合成后的背景荧光信号。
2)将标记的外源核酸与芯片上的指控探针进行杂交，检测探针合成的质量。5)通过质检的芯片在4°C下保存。经如上处理的芯片即可用于杂交。实施例2:NLRP7基因各相关SNPs检测试剂盒样本检测
临床验证结果表明，本发明的检测系统通量大、灵敏度高，基因芯片技术的引入使得该方法具有与荧光定量PCR相当的灵敏度。具体试剂、检测方法如下:
1.试剂盒组成
权利要求
1.一种用于检测NLRP7基因的基因芯片，其特征在于，它包括固相载体和合成在该载体上的寡核苷酸探针等，所述寡核苷酸探针是针对检测与葡萄胎相关的NLRP7基因的18个SNP位点所在的核苷酸序列；所述的18个SNP位点具有SEQ ID N0.182-199所示的核苷酸序列；所述寡核苷酸探针具有SEQ ID N0.2-145所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测样本中NLRP7基因的检测试剂，其特征在于，它包括权利要求1所述的基因芯片和18对用于扩增样本中各SNPs的PCR引物等，所述PCR引物具有SEQ IDN0.146-181所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测样本中NLRP7基因的试剂盒，其特征在于，它包括权利要求2所述的检测试剂、一阴性对照样本和一阳性对照样本等，所述阴性对照样本为无菌纯水，所述阳性对照样本为确认的由SEQ ID N0.1-18中某一 DNA片段突变的DNA片段。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测与葡萄胎相关的NLRP7基因SNP分型芯片、检测试剂和试剂盒，构建了筛查与葡萄胎相关的NLRP7基因多态性高危人群的基因芯片检测系统，基因芯片包括固相载体和合成在该载体上的寡核苷酸探针，检测试剂包括基因芯片和18对用于扩增样本中各SNPs的PCR引物，试剂盒包括检测试剂、一阴性对照样本和一阳性对照样本；本发明可快速、准确检测临床样本中的NLRP7基因各个相关SNPs位点。该检测系统通量大、灵敏度高，对于葡萄胎的临床诊断和高危人群早期筛查、早期预防干预具有重要的意义，可广泛用于临床高效筛查葡萄胎高危人群。
文档编号C40B40/06GK103103271SQ20131002771
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者钱建华 申请人:杭州市第一人民医院