专利名称：简单快速的mRNA层析芯片检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种简单快速mRNA层析检测芯片的检测技术，具体地说指游离mRNA在层析迁移过程中被固定的cDNA探针俘获并被原位显色的检测方法，包括膜条探针阵列制作、RNA快速提取、层析杂交和信号分析等。该技术简单快速、可靠，可用于基因表达谱的实验室研究和临床诊断。
随着人类基因组计划的进展，全部DNA序列的排序已被基本破译。结构基因组学产生的巨量数据正在被有效的利用，功能基因组学面临一个富有挑战性的大发展阶段，基因组学还是蛋白组学都强调从器官组织的整体水平上对基因的活动规律进行研究，即对mRNA或蛋白产物进行规模化研究，通过基因活动的差别和其产物之间的相互作用了解某范围内的生命活动规律。从而加速了解码生命的进程。其中常用的方法有2-D电泳结合质谱分析的方法，另一种极有前途的方法就是DNA芯片，DNA芯片是一种集微型化，并行化，比较研究于一体的研究手段。
DNA芯片技术于1995年正式问世，是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将几个、几十、几千甚至几万个已知DNA寡核苷酸探针或全序列基因探针排列在玻片、硅片或膜质材料上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上可以做到一次实验检测细胞或组织内所有基因或可以表达的基因。因此这种技术对胚胎发育控制的研究、疾病发生发展的研究、以及生理病理的研究提供了最佳的研究手段。主要用途有1)基因表达差异的研究用数千甚至数万个cDNA/mRNA片段点样或固定于玻璃或硅芯片上，通过对特定条件下(发育，生长，外界因素等)组织中的mRNA进行随机性杂交，通过分析软件对结果进行分析，进而分析特定组织的基因表达谱。
2)基因药物的筛选通过分子设计或模拟将大量由组合化学法产生的随机药物分子和组织中的多基因进行随机作用筛选有特异结合作用的药物分子，为药物基因组学的一种新型有效方法。
3)临床诊断及预后检测用含多种病原微生物基因或致病基因的芯片可同时进行多样本检测，大大提高了检测效果。
4)环境生物学检测自然环境中的许多化学物质对人类及其它生物的生存造成影响。例如，用DNA芯片方法可同时检测人类各种复杂疾病(哮喘，糖尿病，高血压等)的遗传易感性因素。
5)蛋白质芯片以蛋白为探针固定在固体支撑物表面，形成蛋白质芯片，可用于检测蛋白之间的相互作用，而不会互相影响活性。
用于检测mRNA表达状态的DNA芯片一般以cDNA全部或部分序列作为探针固定于芯片表面，cDNA探针的数目依目的而定，一般可选择几十至几千，检测技术以核酸杂交为基本原理，检测时先抽提RNA或mRNA，纯化后的RNA再进行逆转录并同时标记荧光素，然后把标记的靶序列与芯片上的大量cDNA探针进行杂交，最终通过扫描获得最佳的杂交信号，由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。
但是这类高集成度cDNA芯片技术，还存在以下缺陷和不足1.需要专用的检测设备现有芯片技术都是采用高敏感性的荧光标记技术标记被检测的靶DNA分子，因此芯片的检测就需要昂贵的专用芯片激光扫描仪。
2.检测程序复杂，检测耗时太长现有DNA芯片检测技术只是将DNA探针集成固定进行逆向杂交而已，与传统的杂交技术相比，检测程序仍然复杂，需要经过培训的专业技术人员操作，一般至少需要2天的时间才能完成。而临床诊断项目的要求首先是快速和操作简便，一般性检查最好能在1～2小时内完成并出具报告。
3.检测成本高由于芯片的制作程序复杂，一般需要采用特殊修饰的玻片，需要特殊点样设备和检测设备，同时由于PCR及标记的试剂昂贵，增加的检测成本致使芯片的成本居高不下。并且同时检测几百几千个功能上并不相关的基因并不是临床所需要的，临床上需要的是具有特殊针对型并能解决实际问题的检测项目，比如，了解肿瘤基因的表达情况、了解地中海贫血的珠蛋白基因的所有可能突变位点的状况等等。
4.需要特定的无核酸酶环境在进行RNA操作时需要特殊的无核酸酶的环境，对操作人员要求较高，甚至要求专职的检测人员，因为RNA对环境中污染的核酸酶非常敏感，操作稍有不慎，便影响检测的结果。
本发明的目的是提供一种检测程序较简单，可快速进行mRNA检测的芯片方法。
为了克服现有技术的不足和缺陷，本发明采取一种新的条形芯片设计和层析检测方法以达到本发明的目的，通过改进RNA抽提的方式、cDNA探针固定的载体以及杂交的方式，来达到快速、简便的基因表达谱的检测。
本发明涉及mRNA快速层析诊断的技术和方法，包括探针阵列制作、RNA提取、层析杂交和信号分析等。该方法简单快速、可靠，可用于实验室研究和临床诊断，该技术步骤包括a.将cDNA探针或含有互补序列的环状质粒或寡核苷酸探针阵列于微孔纤维膜上，制成膜条阵列芯片；b.将含有mRNA的细胞或样本用强烈变性剂溶解，释放RNA；c.调节变性剂溶液的离子浓度；d.在变性液中加入生物素标记的Poly(T)和亲和素包被的胶体金颗粒；e.将膜条的一端浸入变性剂溶液，一端与吸水纤维相连，层析杂交样本，显示信号；f.银还原信号加强，信号分析。
其中c、f为可选步骤。以下将详细描述RNA层析检测的实现过程。
1.使用cDNA探针作为探针的cDNA可以由相应的cDNA克隆扩增而来，也可以使用逆转录加PCR扩增的方法获取探针，然而要获取大规模cDNA探针，使用同一质粒载体的cDNA克隆库和相同的扩增引物要来得经济和方便。CDNA可以是全长的，也可以是部分片断，其cDNA片断大于200bp即可能获得正常固定效果和杂交检测效果。为了获得最佳效果的杂交效率，采取下列措施(1)增加杂交溶液的体积，由于DNA的复性与DNA的复杂性和DNA浓度与杂交的效率有密切关系，可以通过增加杂交液的体积来减少溶液中DNA的复性；(2)层析杂交，因为杂交溶液体积的增加，必需采用层析杂交技术，来增加目标DNA与固定探针的接触的机会。
(3)强烈变性剂抽提RNA，避免核酸酶对RNA的降解。
2.探针的网络立体固定硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等都是带有微孔的虑膜，其孔径一般在0.45μm～10μm左右，一般选择5μm的膜作为层析支撑膜，在显微镜下这种膜就是一个立体的纤维网络，液体可以在该纤维网络之中进行自由扩散，当在膜的一端给以液体扩散压力时，液体将沿一定方向扩散，例如沿条状膜条的单方向扩散。因此硝酸纤维膜及其他层析膜，既是立体的网络固定载体，又是层析的良好材料，同时又是cDNA探针固定的最佳支撑载体。
正常cDNA探针在膜上的固定技术涉及到cDNA探针的点样以及探针与膜的共价连接。可选用阳离子膜，如氨基修饰的尼龙膜、硝酸纤维膜等，可以雇佣固体芯片表面的立体探针固定技术固定探针，也可以采用喷线或喷点的方法将探针和对照探针喷在5mm左右宽度的硝酸纤维膜或尼龙膜上，形成线型阵列或点状阵列。干燥后经过紫外线照射，促使探针与膜的共价交联。
3.强烈变性剂抽提RNA与传统方法相比，本发明具有很多优势。本发明将细胞样本直接采用强力变性剂变性，使之释放核酸，同时抑制RNA酶对RNA的降解，并使操作更为简便。不需核酸的分离和纯化步骤。变性剂是一种能溶解生物样本中的RNA或DNA，使蛋白质从RNA和DNA分子上释放出来，从而使RNA和DNA分子充分暴露。这些变性剂通过干预生物样本中分子间微弱的van derWaal引力，破坏RNA、DNA和蛋白质的二级结构。这些变性剂几乎能溶解所有的生物分子如蛋白质和核酸。
变性剂的概念是能溶解所有的生物分子，产生一种清晰的透明溶液，1ml变性剂溶液至少可溶解1mg的细胞或组织，因此不是所有盐类均能成为变性剂。特殊的变性剂包括三氟醋酸盐、三氯醋酸盐、过氯酸盐、NaI、硫氰酸胍和硫氰酸钾等。变性剂的浓度依所溶解的样本有所不同。典型的浓度是5M。
4.层析杂交技术本发明主要根据游离DNA分子在层析迁移过程中被固定的DNA探针俘获的原理设计的。cDNA探针阵列固定于膜载体的中间部位。检测时，将生物素标记的poly(dT)片段和亲和素包被的胶体金试剂与RNA强烈变性剂溶剂等体积的6×SSC混合，并加到RNA变性剂溶液中，混合，其目的是调节杂交液的离子强度同时对强烈变性剂作稀释以减少对亲和素的损伤。当RNA抽提溶液与生物素-poly(dT)以及亲和素包被的胶体金等混合后，将膜的一端与该混合溶液接触，另一端与吸水纤维相连，由于层析效应，流动相带动样品沿膜载体展开，靶RNA-poly(dT)-生物素-亲和素-胶体金复合物会被相应固定探针俘获，并在相应的条带位置呈现阳性检测信号(红色胶体金)，达到快速分离鉴定的目的。具体方法如下1)采用可以让液体自由扩散的薄膜如硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜作为cDNA探针固定的层析载体膜，固定探针排列在载体膜的中央检测区域，形成探针阵列；2)强烈变性剂提取RNA，一倍6×SSC稀释(总体积～1ml)，75℃加热5分钟；3)将生物素标记的poly(dT)和亲和素包被的胶体金试剂混合，加到变性的RNA溶液中；4)将含有探针阵列的载体膜的一端浸于DNA/胶体金溶液，液体沿载体膜展开，膜的另一端与吸水纤维相连，以保证层析过程连续性。当标记有示踪物的靶物质与固定探针配对时，便被俘获固定，在相应的条带位置呈现阳性检测信号；5)信号的加强、检测及分析。本发明与现有的检测技术相比，具有以下优点本发明提供可用于样本准备和杂交的硫氰酸盐溶液，可使样本准备、检测等程序加快、操作简单、经济、多用途和自动化提供更先进的实验操作程序。
1.精确性在强烈变性剂溶液中进行杂交，其效率可达到100％，在探针过量的情况下，靶RNA的量与探针的杂交呈线性关系。在探针数量较低时，靶核酸与探针的杂交仍呈线性关系。
2.敏感性可以测到30fg的互补核酸，这种检测水平可以满足众多检测要求。
3.速度不管靶RNA数量多少，均可在15分钟内完成DNA-RNA杂交。更重要的是，在这么快速和敏感性的条件下，仍可获得这么高的检测速度。
4.简单本发明操作仅需三步1)将强烈变性剂溶液加到样本或组织，1分钟；2)将生物素标记的poly(dT)探针和亲和素包被的胶体金和相应的SSC稀释液加进去，并孵育5分钟；3)层析杂交分析。这一程序简单得足够让未受过任何培训的人员操作。
有核酸酶的环境对该操作程序也没有多少影响。
5.经济强烈变性剂抽提程序的费用比所有已知的程序都低。一个手工应用强烈变性剂抽提的方法建立的一个RNA检测，其消耗约为2元。自动化后更低。
6.多用途临床样本与研究室样本均可用该方法诊断，例如大便、血液、尿液等都是高度混杂的，该技术对这些样本都有效。而且不降低它的精确性、敏感性、速度和经济性等指标。
7.自动化优于操作的简单化使自动化比量检测成为可能本发明可应用于基因表达模型检测和分析。
基因表达模型(基因表达谱)是指细胞内相关基因的mRNA表达瞬间状况，反映了当时细胞活动的信息。分析细胞基因表达模型，即可获知细胞处于何种状态。本发明可以同时检测10～100个基因的基因表达谱检测方法，使检测十分简单、快速，可以在短于1小时的时间内完成全部检测过程。
基因表达谱条形芯片检测原理动物类细胞mRNA在3’端均带有Poly(A)序列，此序列可作为通用探针杂交的识别序列，通用探针为Poly(dT)，5’标记有胶体金或铁蛋白等有色物质，当与mRNA溶液混合时，便与mRNA的Poly(A)端多重结合。当此复合物在层析时可随着液体在薄膜上的扩散，mRNA向另一端移动。当mRNA-Poly(dT)杂交复合物在迁移过程中与固定在薄膜上的cDNA探针相遇时，便被固定的cDNA探针俘获，原位形成有色信号。不被俘获的mRNA分子继续前移，直到碰到可以俘获的分子为止。本发明主要的技术制作及操作本发明涉及mRNA快速层析诊断的技术和方法。该方法简单快速、可靠，可用于实验室研究和临床诊断。当用于mRNA表达检测时，该技术步骤包括1)将cDNA探针或含有互补序列的环状质粒或寡核苷酸探针阵列于微孔纤维膜上，制成膜条阵列芯片；2)将含有mRNA的细胞或样本用强烈变性剂溶解，释放RNA；3)调节变性剂溶液的离子浓度；4)在变性液中加入生物素标记的Poly(T)和亲和素包被的胶体金颗粒；5)将膜条的一端浸入变性剂溶液，一端与吸水纤维相连，层析杂交样本，显示信号；6)银还原信号加强，信号分析。以下将详细分步描述RNA层析检测的实现过程1. 将cDNA探针或含有互补序列的环状质粒或寡核苷酸探针阵列于微孔纤维膜上，制成膜条阵列芯片a.cDNA探针设计cDNA探针的种类和数量主要根据要求而定，由于膜的长度限制，选择的探针数量不宜超过200个。
作为探针的cDNA可以由相应的cDNA克隆扩增而来，也可以使用逆转录加PCR扩增的方法获取探针，然而要获取大规模cDNA探针，使用同一质粒载体的cDNA克隆库和相同的扩增引物要来得经济和方便。CDNA可以是全长的，也可以是部分片断，其cDNA片断大于200bp即可能获得正常固定效果和杂交检测效果。为了获得最佳效果的杂交效率。
b.探针点样探针的排列方式有线样排列或点样阵列。线样排列类似于条型码，将变性的探针按次序排列在膜条表面。制作时采用喷线方法将探针(不多于50个)和对照探针喷在5mm-10mm宽的硝酸纤维膜或尼龙膜上。点样阵列的制作主要借助于三维机器人和特殊制作的样本针，将变性的cDNA探针点到膜的相应位置，密度不高于每平方厘米200点，密度主要根据所采用的膜材料，较致密的材料可以采用较高的密度。
c.探针固定喷线或点样后的膜条经室温干燥后，用紫外线(254nm)进行交联。交联能量一般为120,000μj/cm2照射20秒，也可以根据需要调整照射剂量。另一种方法是加热固定，80℃烘烤2小时也同样达到DNA交联的目的。
d.膜的选择固定探针的膜主要是硝酸纤维膜，如商品BA85(Schleicher and Schull)和HAWP(Millipore)，尼龙膜如Biodyne(trademark of Pall)、Gensscreen(New England Nuclear)，和Zetapore或Zetaprobe(AMF Curio)。膜的孔径一般在5～10μm。2. 将含有mRNA的细胞或样本用强烈变性剂溶解，释放RNA根据以下操作可以选择性的将来自全血细胞的mRNA加以抽提，其中强烈变性剂以加硫氰酸盐GuSCN抽提为例。其他操作主要以来于mRNA的特性，用以增加mRNA提取的效果。以下分别加以描述a.生物样本准备可采用多种常规方法过去细胞，进行mRNA提取是要特别小心，以防RNA降解。通常情况下，样本置于冰上，戴手套，应用环己酰胺加核酸酶抑制剂等。环己酰胺(cyclohexamide)通过维持mRNA在一种天然结构状态以减少降解，核酸酶抑制剂氧矾核糖核苷(vanadylribonucleosides)抑制RNA酶，不影响分子杂交，但是它抑制逆转录和翻译。加用0.5mM金精三羧酸(aurin tricarboxylic acid)(Sigma Chemicals)加1mM羟芪巴脒(hydroxystilbamidine isothamine)(Merrell)或者1U/ml RNAsin(Promega Biotech)对逆转录或翻译没有抑制作用，但是其抑制核酸酶的能力不如氧矾核糖核苷。
如果样本是单个核细胞或骨髓细胞，可以采用不连续Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离细胞，固体组织可以直接用硫氰酸盐溶液溶解。
b.加入去污剂和硫氰酸盐去污剂和硫氰酸盐的加入顺序并不严格，先或后加或一起加都无大碍。去污剂可以溶解细胞，并有助于抑制蛋白质和DNA在层析时的共沉淀现象。如果mRNA样本含有足够多的蛋白质或DNA，将以加入去污剂，适合的去污剂有布里杰(Brij)系列或吐温Tween系列。弱阴离子去污剂十二烷基肌氨酸钠(sodium lauryl sarcosinate)和去氧胆酸钠(sodiumdesoxycholate)效果也不错。例如，为了破碎细胞，可加入1/20体积的10％Brij 35(Sigma)与样本混合，然后加1/20体积的10％去氧胆酸钠，再次混合。
去污剂加入以后，加入1体积的超饱和的硫氰酸盐溶液(含2％β-巯基乙醇，10mM Tris-HClpH 7.0，1mM EDTA)，使细胞能得到饱和的硫氰酸盐。
强盐溶液很容易制备。例如NaI，超饱和NaI大约是2.5g NaI溶解于1ml 75℃热水中，室温储存，用前加热至75℃。使用时加入1体积超饱和NaI到样本中，形成饱和NaI抽提液，此时应看到样本溶液应该是澄清的。其他的变性剂盐的配制法与此相似。
c.硫氰酸盐变性剂的配制硫氰酸胍4M
Tris-HCl(pH 7.1)10mM柠檬酸钠(pH 7.1)25mMEDTA1mMβ-巯基乙醇 2％使用前加入3. 调节变性剂溶液的离子浓度加入稀释剂的目的主要是稀释变性剂的浓度，降低变性剂对亲和素—生物素结合的影响，同时调剂液体的离子强度，使之更适合于杂交。稀释剂成份为6×SSC，10mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，0.25％SDS。使用时将等体积的稀释剂加到变性剂抽提的RNA溶液中。
70℃加热变性5分钟，使RNA充分变性。4. 在变性液中加入生物素标记的Poly(T)和亲和素包被的胶体金颗粒向上述混合液体中加入50pmol生物素标记Oligo(dT)20-36，加入100μl的10OD亲和素包被的胶体金试剂混合，用于步骤5的层析杂交。
第二种标记方法是根据金与巯基能形成稳定连接的原理设计的。当应用胶体金作为示踪剂时，由于胶体金的特点，可以与巯基化合物形成稳定的复合物。应用巯基标记的Poly(dT)第二探针可以减少探针标记的成本，并且使操作更为简便。
由于金的金属特性，巯基基团可以与金表面形成稳定的吸附，不需要特殊的共价结合，因此使金颗粒的标记更为简单。标记后的纯化可以采用离心分离的方法，一般先以低速离心去除聚集的金颗粒的沉淀，然后再超速离心，标记的探针存在于沉淀之中，反复离心几次，最后将沉淀于少量10mM PBS缓冲液(pH7.0)中。5. 将膜条的一端浸入变性剂溶液，一端与吸水纤维相连，层析杂交样本，显示信号动物类细胞mRNA在3’端均带有Poly(A)序列，此序列可作为通用探针杂交的识别序列，通用探针为Poly(dT)，5’标记有胶体金或铁蛋白等有色物质，当与mRNA溶液混合时，便与mRNA的Poly(A)端多重结合。当此复合物在层析时可随着液体在薄膜上的扩散，mRNA向上移动。当mRNA-Poly(dT)杂交复合物在迁移过程中与固定在薄膜上的cDNA探针相遇时，便被固定探针俘获，原位形成有色信号。不被俘获的mRNA分子继续前移，直到碰到可以俘获的分子为止。
检测时，经变性后的mRNA或RNA溶液与poly(dT)和亲和素包被的胶体金溶液混合，离心沉淀不溶性物质，注意样品在孔中的均匀性。然后将膜条芯片的同一端浸于混合液中，另一端与吸水纤维相连，让液体沿尼龙膜向另一端层析扩散，同时驱动样本中的mRNA迁移，当mRNA到达相应的位置时，便被固定探针俘获，一般大约需要15分钟到30分钟，再经过15分钟的层析，洗去游离物质，然后通过肉眼观察条带的位置以及信号的有无。芯片杂交的质量可以通过内置的对照加以控制。
室温条件下，3～6.5M GuSCN同样有效，杂交可以进行5分钟，也可以长达数小时。操作程序超常简单。该技术也可结合蛋白酶、去污剂、有机溶剂、还原剂等使用，因为生物样本中核酸复杂，有的可能不能直接接触硫氰酸盐溶液。6. 银还原信号加强，信号分析。
可以肉眼直接观察对比，更适合的是标记胶体金颗粒加银还原加强法的信号可以被一般平板光学扫描仪扫描获取，一次扫描可以同时获取50份以上检测结果，通过扫描获取的图象再通过图象分析软件自动分析和报告及打印，有利于自动分析和临床大规模的使用。
mRNA杂交设置内参照可以提供定量参考。杂交时设置被测管和参照管，结果以两管的信号的比率决定。好的参照管是已知mRNA在各种条件下表达的量作为参照。另一个参照是总mRNA的poly(A)的量。生物素标记的poly(dT)检测poly(A)的量，作为其他mRNA的参照值。
平行的阴性和阳性对照对于定量mRNA或RNA都是必需的，这些对照拥有与被检测的标本相同的探针。
实施例1 造血干细胞部分结构蛋白基因表达谱条形芯片的制作与检测1.cDNA探针的选择与制作以造血干细胞部分结构蛋白和一些小蛋白的基因cDNA作为探针固定于载体膜表面，基因如表1所示。这些基因的cDNA均已被克隆出来，有些是全长基因，有些是Poly(A)端的部分基因序列。这些基因克隆在质粒内，可以用通用的引物将其扩增，本实例所使用的克隆来自国家人类基因组南方研究中心，美国I.M.A.G.E和InCyte公司也有供应。
表1 部分造血干细胞结构蛋白基因GeneBank No 表达的蛋白名称X63432 ACTB mRNA for mutant beta-actin(beta′-actin)U03269 actin capping protein alpha subunit(CapZ)U12026 actin-regulatory protein Cap-G(CAPG)K00558 alpha-tubulinX00351 beta-actinV00599 beta-tubulin.
M80563 CAPL proteinU03851 capping protein alphaU56637 capping protein alpha subunit isoform 1X84075 cardiac myosin binding protein-CV00478 cytoplasmic actinX04098 cytoskeletal gamma-actinX04588 cytoskeletal tropomyosin TM30(nm)X73882 E-MAP-115U62962 Int-6L25941 integral nuclear envelope inner membrane protein(LBR)M63483 maior nuclear matrix proteinM27937 male-enhanced antigen mRNA(Mea)U38291 microtubule-associated protein 1a(MAP1A)Y00764 mitochondrial hinge proteinM22382 mitochondrial matrix protein P1M69066 moesinM31211 myosin light chain 1 slow a(MLC1sa)M31212 myosin light chain 3 non-muscle(MLC3nm)U26162 myosin regulatory light chainX54304 myosin regulatory light chainJ00312 non-muscle(fibroblast)tropomyosin geneL22343 nuclear phosphoproteinM60858 nucleolinX75252 phosphatidylethanolamine binding proteinJ03191 profilinU61734 protein trafficking protein(S31iii125)L03785 regulatory myosin light chain(MYL5)Y00282 ribophorin IIU51586 siah binding protein 1(SiahBP1)S65762 SPTBN1＝beta-fodrinM25077 SS-A/Ro ribonucleoprotein autoantigen 60 kdU26648 syntaxin 5U77942 syntaxin 7M25246 vimentin2.cDNA探针扩增合成、纯化应用Qiagen或Promega公司的PCR试剂盒，根据操作说明书扩增所选cDNA克隆，反应过程中，使用质粒所附的通用PCR引物作为通用PCR合成引物，质粒cDNA克隆作为模板，延伸时间需2分钟或以上，30个循环，产物经电泳证明后，直接酒精(75％)沉淀即可。沉淀的DNA经20μl 3×SSC溶液溶解和高温变性(98℃5分钟，随后迅即冰水冷却)后可直接用于喷线或划线。
3.喷线或划线采用喷线方法(BioDot)将所选探针和对照cDNA探针(Actin和Microglubin以及植物DNA)喷在5mm～10mm宽的尼龙膜上形成条带阵列，或者用点样机(Cartesian)将cDNA探针点于膜的指定位置，形成点状阵列。喷样或点样后，室温干燥，在80℃真空炉内烘烤2小时以使cDNA探针与硝酸纤维膜或尼龙膜形成共价交联。或者，喷线或点样后的膜条经室温干燥后，用交联炉紫外线(254nm)进行交联。交联能量一般为120,000μj/cm2照射20秒，也可以根据需要调整照射剂量。
4.第二探针标记Poly(dT)第二探针的长度可以选择在15～36个碱基，本实例选择36个碱基长度。5’端应标记生物素，并在寡核苷酸和生物素之间带有6个炭原子的连接臂。并使用亲和素包被的胶体金颗粒(40nm)作为显色试剂。
5.压膜与切割将上述喷过固定探针的硝酸纤维膜或尼龙膜通过复合压膜机，复合在PVC塑料薄板上，以增加纤维膜的韧性和可加工性。采用切割机将复合好的膜片切成所需的规格和形状(一般为2.5mm～5mm宽，50mm～100mm长左右)，即成单份用检测试剂膜条。将单人分试剂膜条及干燥剂装入铝薄膜小袋并封闭。或将单人分检测膜条装配在小型塑料盒，配以相应的层析液小袋和吸水纤维，制成完整的检测装置，然后将检测装置放置在干燥袋内。
6.生物样本准备和RNA抽提如果样本是血细胞或骨髓细胞，可以采用不连续Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离细胞。进行mRNA提取是要特别小心，以防RNA降解。通常情况下，样本置于冰上，戴手套，应用环己酰胺加核酸酶抑制剂等。环己酰胺(cyclohexamide)通过维持mRNA在一种天然结构状态以减少降解，核酸酶抑制剂氧矾核糖核苷(vanadyl ribonucleosides)抑制RNA酶。所有的溶液均需经过DEPC处理。如果是培养的悬浮细胞，可直接离心取细胞沉淀。为了更好地破碎细胞，可加入1/20体积的10％Brij 35(Sigma)与样本混合。然后加入硫氰酸胍溶液(硫氰酸胍，4M；Tris-HCl(pH 7.1)，10mM；柠檬酸钠(pH 7.1)，25mM；EDTA，1mM；β-巯基乙醇，2％使用前加入)直接抽提RNA。一般情况下，＜107细胞，可以加入1ml硫氰酸胍变性剂溶液，抽提后的硫氰酸胍溶液经过离子调整后可以直接用于层析杂交检测。
7.加入检测试剂加入稀释剂的目的主要是稀释变性剂的浓度，降低变性剂对亲和素一生物素结合的影响，同时调剂液体的离子强度，使之更适合于杂交。稀释剂成份为6×SSC，10mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，0.25％SDS。使用时将等体积的稀释剂加到变性剂抽提的RNA溶液中。
70℃加热变性5分钟，使RNA充分变性。
向上述混合液体中加入50pmol生物素标记Oligo(dT)36，加入100μl的10OD亲和素包被的胶体金试剂混合，用于层析杂交。
8.层析杂交检测检测时，将膜条芯片的一端(末端2mm)浸于层析液(5×SSC溶液)中，另一端与吸水纤维相连，让液体沿尼龙膜向另一端层析扩散，同时驱动样本中的mRNA迁移，当mRNA到达相应的位置时，便被固定探针俘获，一般大约需要15分钟到30分钟，再经过15分钟的层析，洗去游离物质，然后通过肉眼观察条带的位置以及信号的有无。芯片杂交的质量可以通过内置的对照加以控制。
9.信号获取与分析可以肉眼直接观察对比，更适合的是标记胶体金颗粒加银还原加强法的信号可以被一般平板光学扫描仪扫描获取，一次扫描可以同时获取50份以上检测结果，通过扫描获取的图象再通过图象分析软件自动分析和报告及打印，有利于自动分析和临床大规模的使用。
mRNA杂交设置内参照可以提供定量参考。杂交时设置被测管和参照管，结果以两管的信号的比率决定。好的参照管是已知mRNA在各种条件下表达的量作为参照。另一个参照是总mRNA的poly(A)的量。生物素标记的poly(dT)检测poly(A)的量，作为其他mRNA的参照值。
平行的阴性和阳性对照对于定量mRNA或RNA都是必需的，这些对照拥有与被检测的标本相同的探针。实施例2.白血病细胞CD抗原mRNA的定量层析检测CD抗原也称白细胞分化抗原，是白细胞表达在细胞表面的一种特定标志物，其中很多可以反映白细胞分化的进程、反映白细胞激活或失活的状态。白细胞表面分子通常用抗白细胞的抗体进行检测。应用不同组合的CD抗原抗体就可以鉴别出白细胞的亚型，如B细胞、辅助T细胞，细胞毒T细胞和自然杀伤细胞等，这些细胞对药物的反应和抗性都不相同。
白血病是一种骨髓造血细胞克隆性增值，细胞常停留在细胞分化的某一阶段而不发育成熟，因而可以带有某种特殊的标志。白血病可以发生于造血细胞任何一个系列，其本身也带有这个系列的特殊标志。对于急性白血病，白细胞的免疫分型可以鉴定白血病细胞发生的系列和成熟的程度。然而到目前为止，还没有发现对于任何一种白血病都特异的标志物，因此白血病细胞的鉴定通常就是不同CD抗原表达的组合鉴定。
1.探针选择到目前为止，已发现的以CD系列命名的抗血液细胞的抗原已达到编号166，加上各种亚型，实际上已经接近190个。这些CD抗原物质都是识别血液细胞的某一特定分子，绝大多数是蛋白质或糖蛋白，少数是粘多糖(5-6种)。为了达到临床诊断的实用性，该诊断膜条所使用的CD探针为38个，全部来源于cDNA克隆(质粒)，经通用PCR引物扩增所得。这些探针可函盖所有白血病类型的诊断，这些探针选择如表2。
表2.所选探针的CD编号名称
2.cDNA探针扩增合成、纯化应用Qiagen或Promega公司的PCR试剂盒，根据操作说明书扩增所选cDNA克隆，反应过程中，使用质粒所附的通用PCR引物作为通用PCR合成引物，质粒cDNA克隆作为模板，延伸时间需2分钟或以上，30个循环，产物经电泳证明后，直接酒精(75％)沉淀即可。沉淀的DNA经20μl 3×SSC溶液溶解和高温变性(98℃5分钟，随后迅即冰水冷却)后可直接用于喷线或划线。
3.喷线或划线 参见实例一第三步。
4.第二探针标记Poly(dT)第二探针的长度可以选择在15～36个碱基，本实例选择36个碱基长度。5’端应标记生物素，并在寡核苷酸和生物素之间带有6个炭原子的连接臂。并使用亲和素包被的胶体金颗粒(40nm)作为显色试剂。
5.压膜与切割参见实例一第四步。
6.血液样本处理收集15ml外周血，肝素抗凝(50U/ml)，用加有50μg/ml环己酰胺和10mM核酸酶抑制剂氧矾核糖核苷的Hanks液2倍稀释，将细胞悬液Ficoll-Hypaque之上12000g密度梯度离心20分钟，收集Ficoll表面的单个核细胞层，用上述Hanks液洗细胞2次，并细胞计数。细胞浓度调节到107/ml，加10％Brij-35到最终浓度0.5％，混合，然后加等量超饱和变性剂硫氰酸胍溶液，使细胞溶解，溶液澄清透明。最后加等体积的6×SSC以稀释变性剂，同时调节液体的离子强度，使之适合于杂交，同时降低变性剂对亲和素—生物素结合的影响。稀释剂成份为6×SSC，10mM Tris-HCl(pH 7.4)，1mM EDTA，0.25％SDS。使用时将等体积的稀释剂加到变性剂抽提的RNA溶液中。
7.RNA变性将稀释后的RNA溶液70℃加热变性5分钟，使RNA充分变性。
5’生物素标记的Poly(T)30由服务商合成提供，用蒸馏水稀释至100μM。向上述混合液体中加入50pmol生物素标记Oligo(dT)36，加入100μl的10OD亲和素包被的胶体金试剂混合，用于层析杂交。
亲和素包被胶体金，可以直接购买商用亲和素包被的胶体金溶液(华美公司)，也可以自制。
8.层析杂交检测检测时，将膜条芯片的一端(末端2mm)浸于层析液(5×SSC溶液)中，另一端与吸水纤维相连，让液体沿尼龙膜向另一端层析扩散，同时驱动样本中的mRNA迁移，当mRNA到达相应的位置时，便被固定探针俘获，一般大约需要15分钟到30分钟，再经过15分钟的层析，洗去游离物质，然后通过肉眼观察条带的位置以及信号的有无。芯片杂交的质量可以通过内置的对照加以控制。
9.信号获取与分析 参见实例一第九步。
权利要求
1.本发明涉及mRNA快速层析芯片的技术和方法，可用于基因表达谱的研究和基因活动状态的鉴别，该技术步骤包括a)将cDNA探针或寡核苷酸探针阵列于微孔纤维膜上，制成膜条阵列芯片；b)将含有mRNA的细胞或样本用强烈变性剂溶解，释放RNA；c)稀释并调节变性剂溶液的离子浓度，75℃加温变性RNA；d)加入生物素标记的Poly(T)和亲和素包被的胶体金颗粒溶液；e)将膜条芯片的一端浸入变性剂溶液，另一端与吸水纤维相连，层析杂交样本，显示信号；f)银还原信号加强，信号分析。
2.根据权利要求1所描述的膜条阵列芯片，其特征在于将cDNA探针或合成的寡核苷酸探针通过画线或点样的方式排列并固定在可层析的微孔膜上；膜的材料为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜和以这些膜为基础发展而来的带有阳离子或阴离子的膜。
3.根据权利要求1所描述的膜条阵列芯片，其特征在于芯片呈条形，cDNA探针或寡核苷酸探针阵列固定于膜条的中间区域，阵列可以为条形码样排列或点阵阵列。
4.根据权利要求1所描述的强烈变性剂释放RNA，其特征在于直接采用强力变性剂变性处理细胞或组织样本，使之释放核酸，同时抑制RNA酶对RNA的降解，变性剂包括硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钾、三氟醋酸盐、三氯醋酸盐、过氯酸盐、碘化钠等，变性剂的浓度依所溶解的样本有所不同，典型的浓度是3～6M。
5.根据权利要求1所描述的RNA变性剂稀释和RNA变性，其特征在于，检测时将生物素标记的poly(dT)片段和亲和素包被的胶体金试剂与RNA强烈变性剂溶剂等体积的6×SSC混合，并加到RNA变性剂溶液中，混合，其目的是调节杂交液的离子强度同时对强烈变性剂作稀释以减少对亲和素的损伤。
6.根据权利要求1所描述的层析杂交技术，其特征在于当RNA抽提溶液与生物素-poly(dT)以及亲和素包被的胶体金等混合后，将膜的一端浸入混合溶液，另一端与吸水纤维相连，由于层析效应，流动相带动样品沿膜载体展开，靶RNA-poly(dT)-生物素-亲和素-胶体金复合物会被相应的固定探针俘获，并在相应的条带位置呈现阳性的红色胶体金检测信号。
7.根据权利要求1所描述的银还原信号加强法，其特征是先进行胶体金层析显色，再通过银显影液(乳酸银显影液、硝酸银显影液)复染，使其在胶体金部位的银被还原形成黑色颗粒，使信号加强10～100倍。
全文摘要
本发明涉及一种直接快速的mRNA层析杂交芯片检测技术。该检测技术包括cDNA探针在层析膜上的阵列和固定、被检样本用强力变性剂溶解释放RNA、调节离子强度、加入生物素标记第二探针寡核苷酸(dT)和亲和素包被的胶体金颗粒溶液、层析杂交检测和信号分析等步骤。该技术可用于基因表达谱的分析研究和根据基因表达模型进行的临床诊断。该技术操作非常简便,不需要RNA的分离和纯化,不需要特制的RNA操作环境,没有PCR扩增标记或其他标记操作。整个层析杂交检测时间少于1小时。此外,该技术检测成本低廉,操作人员不需特别培训,非常适合于医院、基层单位使用。
文档编号C12Q1/68GK1381589SQ01105979
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月13日 优先权日2001年4月13日
发明者缪金明 申请人:缪金明