专利名称：转基因玉米事件ie034外源插入片段旁侧序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种转基因玉米IE034外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物，本发明还涉及利用该引物进行转基因玉米检测的方法和试剂盒。
背景技术：
虫害(尤其是玉米螟害)会造成玉米的严重减产，抗虫转基因玉米是世界上最早开展的研究性状之一。抗虫基因主要来源于苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，其作用机理是使昆虫胃肠产生穿孔，从而使昆虫代谢紊乱而死亡。美国孟山都公司是转基因抗虫玉米研发与应用的领跑者，其开发的抗虫转基因玉米M0N810和M0N863都已经进入商品化生产多年。在M0N810转基因玉米中表达的CrylAb蛋白能有效防治玉米螟，在M0N863中表达的 Cry3Bb对危害玉米根部的害虫有很好的防治效果。先正达公司也开发了表达CrylAb蛋白的转基因抗虫玉米BTll和BT176。先锋公司和陶氏公司共同开发了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害虫的转基因玉米。我国在上世纪90年代初期就开展了转基因抗虫玉米的研究工作，丁群星等(1993)首次报道了用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米；王国英等 (1995)用玉米悬浮细胞、愈伤组织和幼胚作受体，通过基因枪轰击法成功地将Bt毒蛋白基因转入玉米细胞，并获得了大量转基因植株；周逢勇等(1998)将Bt杀虫蛋白导入玉米自交系P9-10，外源基因能稳定遗传到转基因植株后代。张艳贞等(2002)对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。但相对于国外公司开发的抗虫玉米，我国科学家得到的抗虫玉米材料对玉米螟的抗性较低，需进一步得到大量转化体并从中筛选到抗性优良的事件。抗虫转基因玉米的商业化种植增加了玉米产量，降低了杀虫剂等农药的使用，带来巨大的社会和经济效益。但是，抗虫玉米的长时间种植有可能使昆虫对玉米螟产生抗性。 研究发现，种植Btl76玉米地里的玉米螟滞育和滞育后发育延长，这些将加快昆虫对Bt蛋白产生抗性(Christou等，2006)。延缓害虫对转Bt作物产生抗性的策略很多，比如高剂量/庇护所策略、新毒素策略、多基因策略等。最初高剂量/庇护所策略在农业生产中曾成功应用多年，但由于它需要大面积的庇护所，所以对于可用耕地相对匮乏的我国来说该策略还难以推广。因此寻找新型Bt基因对减缓害虫抗性产生具有重要意义。应对昆虫产生抗性好的策略是向玉米中导入不同类型的杀虫基因，或导入多个具有不同作用机制的同类基因。孟山都公司已经研制成功转基因抗虫玉米事件M0N89034，在玉米中表达两个相互补充的蛋白Cry2Ab和CrylA. 105，用于防治鳞翅目害虫(James，2010)。孟山都公司和陶氏公司联合开发出的具有更广谱抗性转基因玉米SmartStaxTM含有防治鳞翅目害虫的 CrylF, Cryla. 105 和 Cry2Ab2 基因，防治玉米根虫的 Cry34Abl, Cry35Abl 和 Cry3Bbl 基因 (Gatehous 等，2008)。CrylIe是中国农业科学院植物保护研究所发现一新型的Bt基因，能表达一种新型的Bt蛋白。我国科学家的研究结果表明通过多代筛选获得的抗CrylAc蛋白的亚洲玉米螟系对CrylAh和CrylAb有低水平的交互抗性，而对CrylIe没有交互抗性(韩海亮等， 2009)，在烟草中共表达人工改造的CrylAc和CrylIe基因对抗性棉铃虫有更好的杀虫活性 (练云等，2008)。这些结果表明在转基因玉米中共表达CrylAc和CrylIe将有可能延缓玉米螟产生抗性。我们将CrylIe基因通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件IE034并在进行环境释放阶段的安全评价，今后有可能进入商业化种植。对转基因玉米进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因玉米进行监督管理。而外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因玉米IE034的旁侧序列，并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因玉米事件IE034外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。本发明另一目的在于提供一种转基因玉米的PCR检测方法和试剂盒。本发明的抗虫转基因玉米事件IE034按如下方式获得根据玉米密码子偏好性原则设计CrylIe序列如SEQ ID NO. 2所示，由上海生物工程有限公司合成，连接到载体PUC57上构建载体pUC57Ie。用PstI酶切质粒pAHC17，回收2. Okb ubiquitin启动子片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。同时用SalI酶切质粒pUC57Ie,回收4. 9kb片段并补平。两个片段进行连接，构建载体pUbi-crylle,从而使 ubiquitin启动子连到CrylIe基因前面。BamHI酶切载体pUbi-crylle,回收6. 9kb片段并补平，然后用HindIII部分酶切，回收4. 2kb片段。同时，用BstEII酶切质粒p3301，回收 Ilkb片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。然后用HindIII酶切这Ilkb片段，回收9kb 片段。将4. 2kb片段和9kb片段进行连接，构建成农杆菌转化载体p3301UbiIe，其T-DNA结构图如图I所示。将载体p3301UbiIe通过冻融法转入农杆菌EHA105中。剥取授粉12天大小为 1-1. 5mm左右的玉米自交系综31的幼胚，用农杆菌进行侵染。然后再共培养3天，恢复7天后分别用含I. 5mg/L, 3mg/Lbialaphos的培养基上筛选四轮。筛选得到的愈伤分化成苗，转入土中使转基因植株生长并进行授粉结实。对转基因植株进行PCR鉴定得到抗虫转基因玉米IE034。对转基因玉米进行温室及田间喷施草铵膦以选择阳性苗。经Southern blot杂交实验及转基因后代基因分离鉴定实验，鉴定所得该转基因阳性植株IE034为一个拷贝。Southern blot杂交结果如图2。对转基因玉米进行温室及田间接玉米螟，表明获得的转基因玉米具有很好的玉米螟抗性。该抗虫转基因玉米事件IE034 已于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为玉米，Zea mays，保藏号为 CGMCCNo. 5578。本发明提供了抗虫转基因玉米事件IE034(Zea mays)插入位点的外源插入片段的 5’端旁侧序列，其具有SEQ ID NO. I所示的序列或其特异性片段。本发明提供了 SEQ ID NO. I所示的旁侧序列在检测转基因玉米中的应用。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增， 检测特异条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’ 旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。本发明还提供了用于扩增SEQ ID NO. I所示序列的特异性引物。在本发明的一个实施例中，提取抗虫转基因玉米IE034叶片基因组DNA，利用特异性引物和随机引物进行TAIL-PCR反应，获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界 982bp长的序列，包括第1-776共776bp的玉米基因组序列和第777-982共206bp的载体序列，如SEQID No. I所示。分析外源片段整合位点的左边界序列，根据玉米基因组序列信息分别设计特异性上游引物 IE034F :5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’ (SEQ ID No. 4)，根据载体 p3301UbiIe 中 T-DNA 区 5’端 CaMV35S polyA 序列设计下游鉴定引物 IE034R :5，-TCGCT CATGTGTTGAGCATATAA-3’ (SEQ ID No. 5) 通过普通PCR扩增可得到312bp特异性片段，包括第1-111共Illbp的玉米基因组序列和第112-312共201bp的载体序列(SEQ ID No. 3)。本发明提供了上述引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。本发明提供了一种检测转基因玉米事件IE034的方法，其是以样品总DNA为模板， 利用本发明提供的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。上述检测转基因玉米事件IE034的方法，20 μ L PCR反应体系为=IOXPCR缓冲液
2μ L，IOmmoI/L dNTP O. 4 μ L，5U/ μ I 的 taq 酶 O. 4 μ L,玉米总 DNA 模板 I. O μ L, 10 μ mol/ L 上游引物 O. 4 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 O. 4 μ L，ddH2015. 4 μ L ;PCR 反应条件为95 °C 5min ；94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C lmin,共 35 个循环； 72 °C 7min。PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳进行分离，EB染色后鉴定是否存在特异性条带。如存在特异性扩增产物312bp特异性片段，表明样品中含有IE034来源的成分。本发明还提供了一种检测转基因玉米事件IE034的检测试剂盒，该试剂盒含有下列引物IE034F : 5 ’ -AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3，，IE034R : 5 ’ -TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3，。本发明提供了上述引物或检测试剂盒在检测转基因玉米中的应用。本发明通过TAIL-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件IE034的5’旁侧序列，根据这两个旁侧序列的序列信息，设计两对新的PCR引物并建立针对IE034事件的鉴定方法， 通过普通PCR扩增得到了新的即包含载体片段又包含玉米基因组信息的序列。本发明提供的旁侧序列和引物适用于对转基因玉米IE034(包括亲本、杂种Fl和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。
图I是转化载体p3301UbiIe示意图。图2是转基因玉米IE034基因组DNA Southern blot图片；1，非转基因玉米基因组 DNA用EcoRI酶切；2，非转基因玉米基因组DNA用HindIII酶切；3，转基因玉米IE034基因组DNA用EcoRI酶切；4，转基因玉米IE034基因组DNA用HindIII酶切；5，质粒p3301UbiIe 用HindIII酶切。图3 是 IE034 T3 代植株的 PCR 检测，其中 M, DL2000 plus DNA marker ;1_18，转基因植株；19，水;20，非转基因植株;21，质粒p3301Ubile。图4是转基因玉米IE034 T2代植株Western鉴定图，WT :非转基因玉米；1_3 :转基因玉米。图5是转基因玉米IE034 5，端旁侧序列TAIL-PCR扩增电泳图，M，DL2000 plus DNA marker ; 1_2，简并引物LADl-I与35S-0第一轮TAIL-PCR扩增的产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-1进行第二轮Tail-PCR产物；I为非转基因玉米，2为转基因玉米。 3-4，分别以泳道I和2对应的PCR产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-2进行第三轮Tail-PCR产物；3为非转基因玉米，4为转基因玉米。5，泳道为空白。6_7，简并引物 LADI-2与35S-0第一轮TAIL-PCR扩增的产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-1 进行第二轮Tail-PCR产物；6为非转基因玉米，7为转基因玉米。8_9，分别以泳道6和7对应的PCR产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-2进行第三轮Tail-PCR产物，箭头所指为982bp的条带；8为非转基因玉米，9为转基因玉米。图6是转基因玉米IE034后代植株定性PCR扩增图，M DL2000 pIusDNA marker ； 1，水；2，质粒p3301UbiIe ;3，非转基因玉米综31 (实验室保存)；4_5为IE034植株Tl代亲本叶片基因组DNA ;6，IE034植株亲本T2代叶片基因组DNA ;7，IE034植株亲本T3代叶片基因组DNA ;8，IE034植株亲本T2代种子DNA ;9，IE034植株亲本T3代种子DNA ；10, IE034 植株杂种Fl代基因组DNA。图7是转基因玉米IE034 PCR检测的敏感性检测结构图，M，DL2000plus DNA marker ;1，水；2，质粒 p3301UbiIe ;3，非转基因玉米综 31 ;4，I μ g IE034 基因组 DNA ;5， 50ng IE034基因组DNA ;6，10ngIE034基因组DNA ;7，Ing IE034基因组DNA ;8，O. Ing IE034 基因组 DNA ;9，O. Olng IE034 基因组 DNA。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I抗虫转基因玉米IE034的获得I、转化载体p3301UbiIe的构建根据玉米密码子偏好性原则设计CrylIe序列如SEQ ID NO. 2所示，由上海生物工程有限公司合成，连接到载体PUC57上构建载体pUC57Ie。用PstI酶切质粒pAHC17，回收2. Okb ubiquitin启动子片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。同时用SalI酶切质粒pUC57Ie,回收4. 9kb片段并补平。两个片段进行连接，构建载体pUbi-crylle,从而使 ubiquitin启动子连到CrylIe基因前面。BamHI酶切载体pUbi-crylle,回收6. 9kb片段并补平，然后用HindIII部分酶切，回收4. 2kb片段。同时，用BstE II酶切质粒p3301，回收Ilkb片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。然后用HindIII酶切这Ilkb片段，回收9kb片段。将4. 2kb片段和9kb片段进行连接，构建成农杆菌转化载体p3301UbiIe，其结构图如图I所示。2、农杆菌转化玉米幼胚获得转基因植株将载体p3301UbiIe通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的Imm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到D-inf溶液中一个小时后，用D-inf洗一次， 再浸入添加100 μ M乙酰丁香酮的D-inf的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在26 °C黑暗条件下共培养3天，并设对照。幼胚洗涤去菌后，放至含I. 5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含3mg/L Bialaphos 筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次，筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好， 为抗性愈伤。将以上实验选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28°C，每日3000Lux光强，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗移植到罐头瓶中，并在室内培养。待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(I 3)的小花盆中。当玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，自交获得种子。3、转基因植株的PCR鉴定3. I植物总DNA的提取，采用CTAB法快速提取玉米叶片总DNA，具体步骤如下(I)取 30-50ml 离心管，加入 7. 5ml CTAB提取缓冲液(TrislOOmM，NaCl I. 4M, 20mM EDTA,2% CTAB，0· I %巯基乙醇)，在60°C恒温水浴中预热30min ；(2)取适量玉米叶片置于2ml离心管中，在液氮速冻下利用2000GEN0/GRINDER组织磨碎仪将叶片磨成粉末状；(3)打开离心管，加入 700 μ I CTAB 提取缓冲液(Tris IOOmM, NaCl I. 4M, 20mM EDTA,2% CTAB, O. I %巯基乙醇)。60°C水浴中保温30min，其间轻摇几次；(4)取出离心管，每管中加入Iml饱和酚，摇动均匀后再加700 μ I氯仿/异戊醇 (24 I)轻微而彻底地混合，放置IOmin以上，待蛋白质变性后离心；室温下以12000r/min 离心IOmin ；(5)将上清液转移到新的离心管中，加三分之二体积的异丙醇，混匀，使核酸沉淀成絮状，12000r/min离心5min,弃上清。(6)在沉淀中加入lml70%乙醇，用手指轻弹几下，放置20min以上；(7) 12000r/min 离心 2min,弃上清；(8)在超净台上吹干沉淀，溶于适量无菌水(100-200 μ I)中。(9)将提取的DNA于_20°C下冷藏备用。3. 2鉴定引物设计根据CrylIe人工改造基因序列信息，设计扩增引物如下上游引物5’ -AACAGCCAGATCAGCACCTT-3’ (SEQ ID No. 6)下游引物5’ -CTGTACACCAGGGCCTTCAC-3’ (SEQ ID No. 7)扩增片段长度为830bp。3. 3PCR扩增体系及反应程序PCR反应体系
权利要求
1.抗虫转基因玉米事件(Zeamays) IE034插入位点的外源插入片段的5’端旁侧序列， 其具有SEQ ID NO. I所示的序列或其特异性片段。
2.权利要求I所述的序列在检测转基因玉米中的应用。
3.用于检测权利要求I所述序列的特异性引物。
4.如权利要求3所述的引物，其核苷酸序列为IE034F :5’ -AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’，IE034R :5’ -TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’。
5.权利要求3或4所述的引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。
6.一种检测转基因玉米事件IE034的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求书3或4所述的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，20μ LPCR反应体系为10XPCR缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP O. 4 μ L，5U/ μ I 的 taq 酶 O. 4 μ L,玉米总 DNA 模板 I. O μ L, 10 μ mol/ L 上游引物 O. 4 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 O. 4 μ L，ddH2015. 4 μ L。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，PCR反应条件为95°C5min ；94°C 30s， 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环；72°C 7min。
9.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求3或4所述的引物。
10.权利要求3或4所述引物或权利要求9所述的试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
全文摘要
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因抗虫玉米事件IE034外源插入片段旁侧序列及其应用。本发明提供的抗虫转基因玉米事件IE034经Southern blot鉴定有一个插入位点，这个插入位点的外源插入片段的5’端旁侧序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了用于检测该旁侧序列的引物，如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明的转基因抗虫玉米IE034外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于对抗虫转基因玉米IE034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。
文档编号C12Q1/68GK102604940SQ201210065919
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者刘允军, 刘艳, 张煜文, 王国英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所