专利名称：一种红掌苞片和花序总rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种植物总RNA提取方法，特别涉及一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法。
背景技术：
红掌(Anthurium andraeanum)是世界著名的盆栽、切花花丼,市场份额巨大,在我国有着广泛的种植区域。随着应用的扩大，红掌品种培育工作方兴未艾，但是由于资源的限制，新品种培育越来越困难，所以世界各地的育种专家都将新品种的培育寄托到生物技术上来。基于植物分子生物学发展壮大的生物技术育种，必须将研究深入到核酸水平，这期间，获得可靠、丰富的核酸信息是做好育种工作的前提，而RNA提取几乎是必不可少一个环节。红掌的观赏器官是其苞片，而不是花，但是常规杂交育种必须研究其花器官，所以红掌苞片和花序的总RNA提取在其分子生物学育种过程中显得十分必要，但是目前国外对红掌分子生物学的研究刚刚展开，国内更是没有可借鉴的经验。在对模式植物及大宗农作物的研究中，Trizol作为一种广谱、高效的RNA提取试剂被广泛的应用，但是不同的植物对该种试剂的适用度不同，对于红掌而言，这种最为普遍的试剂却不能够提取出理想的总 RNA。为了对红掌进行更为深入的研究，必须找到一种高效、快捷而又经济的总RNA提取方法，这样才能突破红掌的生物技术育种瓶颈。
发明内容
本发明目的是提供一种红掌的苞片和花序总RNA提取的方法，该方法高效、快捷、 经济。本发明采用的技术方案是一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法，其特征在于所述方法为(I)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨，获得研磨干粉；(2)将装有初始RNA提取液的离心管于 63 67°C水浴预热，加入所述的研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15 20s，63 67°C水浴静置5 8min，加入初始RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15 20s，室温下静置 5 8min，离心，获得上清液A ;所述初始RNA提取液由终浓度如下的组分构成0. 2g/L十六烷基三甲基溴化铵、O. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、O. 073g/L乙二胺四乙酸、I. 168g/L氯化钠、
O.121g/L Tris、体积浓度O. I %的焦炭酸二乙酯和体积浓度2%的β-巯基乙醇；(3)取上清液Α，加入所述上清液Α1/5体积的氯仿B剧烈摇晃15 20s后静置5 8min，离心，获得上清液B ； (4)取上清液B，加入上清液B1/2体积的8M LiCl溶液，混匀，_20°C放置5 Sh,离心，收集沉淀记为沉淀A，沉淀A用体积浓度75 %乙醇水溶液洗涤，离心收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干到乙醇刚挥发完全为止，获得所述红掌苞片和花序总RNA。本发明所述的红掌苞片和花序总RNA的提取方法，所述方法优选按如下步骤进行(I)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨，获得研磨干粉；(2)将装有初始RNA提取液的离心管于65°C水浴预热，加入研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15s，65°C水浴静置5min，加入初始RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15s，室温下静置5min， 13000rpm/min离心15min,获得上清液A ;所述初始RNA提取液由终浓度如下的组分构成
O.2g/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、0. 073g/L乙二胺四乙酸(EDTA)U. 168g/L氯化钠、O. 121g/L Tris、体积浓度O. I %的焦炭酸二乙酯(DEPC) 和体积浓度2%的β -巯基乙醇；(3)取上清液Α，加入上清液Α1/5体积的氯仿B剧烈摇晃 15s后静置5min, 13000rpm/min离心IOmin,获得上清液B ； (4)取上清液B,加入上清液B1/2 体积的8M LiCl溶液，混匀，_20°C放置5h，12000rpm/min离心lOmin，收集沉淀记为沉淀A， 并用体积浓度75%乙醇水溶液洗涤，离心收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇刚挥发完全为止，获得所述红掌苞片和花序总RNA。进一步，所述SM LiCl溶液按如下方法制得将LiCl溶于水，再加入焦炭酸二乙酯混合，室温下静置I 2天，然后lkg/cm2热压120°C蒸气灭菌20min，冷却获得SM LiCl溶液，所述水和焦炭酸二乙酯的体积比为I : O. 001，所述的LiCl的摩尔浓度为8M，这里所述的室温是指23°C ±2°C。步骤⑷所述沉淀B在室温下(23°C左右)自然晾干时间为lOmin。本发明所述RNA提取液提取RNA过程中，事先不能称量材料(红掌的苞片和花序) 的重量，因为在液氮研磨过程中会有相当多的材料凝固在研磨棒和研钵内壁上，损失非常多，应该研磨后用药匙往缓冲液中加入适量的研磨浆液进行提取，提取过程中加入异戊醇、 苯酚与否对结果无影响，只加入氯仿而不加异戊醇，既能简化试验流程，对结果无任何不良影响，又能减少对人体危害，优点明显。本发明加入氯仿后一定要剧烈摇晃，尽可能的将杂质与RNA分开，吸取上清的时候避免吸到中间层也是十分重要的。本发明用氯化锂沉淀前，上清液吸取的越多越能提高产量，但是也带来了杂质含量的提高，所以一般吸取上清液总体积的80%，这样可以保证RNA的质量较高；且沉淀时间太短会导致产量太低，太长则会导致杂质过多，所以在5 8h为好。本发明沉淀后不提倡使用过高的转数离心，那样会导致杂质含量升高，加入酒精后也不提倡用低于12000rpm/min的转数离心,那样会导致沉淀不易贴壁,倾倒酒精时会失手倒掉沉淀。沉淀不能晾太长时间，否则会增加溶解难度，通常为IOmin。本发明对提取的RNA进行凝胶电泳分析时，不采用甲醛变性胶，经比较，普通电泳效果与变性胶没有明显区别，而工作量和成本却远远低于变性胶。电泳电压和电流不宜太高，过高的电压电流会导致电泳液温度骤升，使凝胶变热、发黑，严重影响电泳效果；电泳时间也不易过长，时间太长既不能提高电泳质量，还会导致RNA降解。本发明所述氯仿A、氯仿B均为氯仿，所述上清液A、上清液B均为上清液，所述沉淀A、沉淀B均为沉淀，字母A和B均无意义，为便于区分不同步骤而命名。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在(I)最大限度地减少了有毒有害药品的使用，例如异戊醇、苯酚在本发明中不再使用，减轻了 RNA提取对人体的危害；(2) 可以获得足量、纯净、没有DNA污染的高质量RNA，省去了后续试验中必须解决的去除DNA 污染的人力和财力；(3)用常规方法达到了商品试剂达不到的效果本发明方法所用药品均为分子实验室常用药品，成本低廉，配制容易，配制同体积(IOOml)药品，可比选用美国 Invitrogen公司生产的RNA提取试剂盒(12322-012和15596-018)节省1000元以上，可以大大节省经费开支；(4)本发明方法操作简单，无论是大量提取还是微量提取红掌总RNA， 都可以在短时间内得到优质产物。
图I是实施例I提取红掌苞片和花序总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中I为 18sRNA,2 为 28sRNA ；图2是对比例I用RNA提取试剂盒提取红掌苞片和花序总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中 I 为 18sRNA，2 为 28sRNA，3 为 DNA ；图3是对比例2用RNA提取试剂盒提取红掌苞片和花序总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I一、试剂的配制I)初始RNA提取液的配制称取2g CTAB、2g PVP、0. 73g EDTAU I. 68g氯化钠于一个干净的250ml三角瓶中，加水定容到100ml，然后加入体积浓度O. 1%的DEPC (O. Iml)， 摇动混匀溶液，密闭状态下室温静置I 2d，然后lkg/cm2热压120°C蒸气灭菌20min，冷却后无菌条件下加入1.21g Tris，并用质量浓度100%浓盐酸调整pH值到8.0，密封备用，使用前加入体积浓度2%的β -巯基乙醇(2ml)。2)8M LiCl溶液的配制将24. 16g氯化锂溶于50ml蒸馏水中同时加入50 μ I DEPC,混勻后室温下静置I 2天,然后lkg/cm2热压120°C蒸气灭菌20min,冷却备用。3)0. 5mol/L EDTA (pH8. O)的配制将 18. 6g EDTANa2 · H2O 用蒸馏水溶解，定容至 100ml,用氢氧化钠颗粒调节pH值至8. O, lkg/cm2热压120°C蒸气灭菌20min后备用。4) DEPC处理的水广口瓶一个，量取IL双蒸水，加入lmlDEPC，密封，混匀后室温静置l-2d,然后lkg/cm2热压120°C蒸气灭菌20min,冷却备用。5) RNA 检测缓冲液(TBE)的配制将 3. 24g Tris、I. 65g 硼酸、I. 2ml0. 5mol/L 的 EDTA溶于300ml DEPC处理的水中，混匀备用(现用现配)。二、红掌苞片和花序总RNA的提取方法(I)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨(液氮在行使完使命后变成空气挥发了，剩下的是干粉，不是浆液，如果动作迟缓，干粉变成了浆液，实验就失败了)，获得研磨干粉；(2)将装有Iml初始RNA提取液的I. 5ml离心管于65°C水浴预热，用药匙加入IOOmg上述研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15s，65°C水浴静置5min，加入初始RNA提取液(Iml) 1/5体积的氯仿(200 μ I)，再次剧烈摇晃15s，室温(23°C )下静置5min，4°C下 13000rpm/min离心15min，获得上清液A ； (3)取上清液A (800 μ I)，加入上清液A1/5体积的氯仿(160 μ I)剧烈摇晃15s后静置5min,4°CT 13000rpm/min离心IOmin,获得上清液B ；(4)取上清液B (600 μ I)置于一个新的I. 5ml离心管中，加入上清液B1/2体积的8M LiCl 溶液(300μ 1)，混匀，-20°C放置5h，4°C下12000rpm/min离心lOmin，收集沉淀记为沉淀A， 并用体积浓度75%乙醇水溶液洗涤，每次用1ml，洗涤2次，4°C下12000rpm/min离心IOmin 收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇刚挥发完全为止(lOmin)，获得所述红掌苞片和花序总RNA20 μ go 三、红掌苞片和花序总RNA的电泳检测(I) RNA 溶解液将上述总RNA20 μ g溶于20 μ I上述DEPC处理的水中。(2)琼脂糖凝胶电泳称取2g琼脂糖，溶于20ml上述TBE缓冲液中，全自动微波炉内煮胶，加入3 μ I EB (溴化乙锭)溶液后混匀，做电泳胶；电泳胶凝固好后取3 μ I上述RNA溶解液点样并电泳，电泳条件80伏特，70毫安；30min后凝胶成像系统下检测结果，结果见图I。对比例I用RNA提取试剂盒(12322-012，美国Invitrogen公司)提取红掌苞片和花序总 RNA，琼脂糖凝胶电泳同实施例1，结果见图2，结果表明本发明方法提取出纯净、无DNA污染、条带清晰的目标产物，而对比方法虽然也能提取出所需要的RNA，但是DNA污染严重，给后续试验带来很大麻烦，去除其DNA污染需要大量人力和财力。图中I指示18sRNA，2指示 28sRNA, 3指示基因组DNA污染。对比例2用RNA提取试剂盒(15596-018，美国Invitrogen公司)提取红掌苞片和花序总 RNA,琼脂糖凝胶电泳同实施例I，结果见图3，结果表明对比方法无法提出任何RNA产物，此试剂不适合红掌苞片和花序的总RNA提取。
权利要求
1.一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法，其特征在于所述方法为(I)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨，获得研磨干粉；(2)将装有初始RNA提取液的离心管于 63 67°C水浴预热，加入所述的研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15 20s，63 67°C水浴静置5 8min，加入初始RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15 20s，室温下静置 5 8min，离心，获得上清液A ;所述初始RNA提取液由终浓度如下的组分构成0. 2g/L十六烷基三甲基溴化铵、O. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、O. 073g/L乙二胺四乙酸、I. 168g/L氯化钠、O.121g/L Tris、体积浓度O. I %的焦炭酸二乙酯和体积浓度2%的β-巯基乙醇；(3)取上清液Α，加入所述上清液Α1/5体积的氯仿B剧烈摇晃15 20s后静置5 8min，离心，获得上清液B ； (4)取上清液B，加入上清液B1/2体积的8M LiCl溶液，混匀，_20°C放置5 Sh,离心，收集沉淀记为沉淀A，沉淀A用体积浓度75 %乙醇水溶液洗涤，离心收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇刚挥发完全为止，获得所述红掌苞片和花序总RNA。
2.如权利要求I所述的红掌苞片和花序总RNA的提取方法，其特征在于所述方法为(1)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨，获得研磨干粉；(2)将装有初始RNA 提取液的离心管于65°C水浴预热，加入所述的研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15s，65°C 水浴静置5min，加入初始RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15s，室温下静置 5min, 13000rpm/min离心15min,获得上清液A ;所述初始RNA提取液由终浓度如下的组分构成0. 2g/L十六烷基三甲基溴化铵、O. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、O. 073g/L乙二胺四乙酸、I. 168g/L氯化钠、O. 121g/L Tris、体积浓度O. I %的焦炭酸二乙酯和体积浓度2 %的 β -巯基乙醇；(3)取上清液Α，加入上清液Α1/5体积的氯仿B剧烈摇晃15s后静置5min， 13000rpm/min离心IOmin,获得上清液B ； (4)取上清液B,加入上清液B1/2体积的8M LiCl 溶液，混匀，_20°C放置5h，12000rpm/min离心lOmin，收集沉淀记为沉淀A，并用体积浓度 75%乙醇水溶液洗涤，离心收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇刚挥发完全为止， 获得所述红掌苞片和花序总RNA。
3.如权利要求I或2所述的红掌苞片和花序总RNA的提取方法，其特征在于步骤(4) 所述SM LiCl溶液按如下方法制得将LiCl溶于水，再加入焦炭酸二乙酯混合，室温下静置 I 2d，然后lkg/cm2热压120°C蒸气灭菌20min，冷却获得8M LiCl溶液，所述水和焦炭酸二乙酯的体积比为I : O. 001，所述的LiCl的摩尔浓度为8M。
4.如权利要求I或2所述的红掌苞片和花序总RNA的提取方法，其特征在于步骤(4) 所述沉淀B在室温自然晾干时间为lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法将幼嫩红掌苞片和花序经液氮研磨、RNA提取液63～67℃水浴静置5～8min，加入RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15～20s，室温下静置5～8min，离心，获得上清液，取上清液经氯仿、8M LiCl溶液处理后，离心，获得所述红掌苞片和花序总RNA；本发明最大限度地减少了有毒有害药品的使用，减轻了RNA提取对人体的危害；可以获得足量、纯净、没有DNA污染的高质量RNA；本发明方法操作简单，在短时间内得到优质产物。
文档编号C12N15/10GK102586235SQ20121006569
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者刘慧春, 周江华, 朱开元, 邹清成, 马广莹 申请人:浙江省农业科学院花卉研究开发中心