专利名称：来源于野生大豆的一个sip基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物SIP基因及其所编码的蛋白质与应用，特别是涉及一个来源于野生大豆SIP基因及其所编码的蛋白质，以及其在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。 本发明属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
干旱、低温和高盐等逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子，也是影响作物产量的主要非生物胁迫因素。植物在适应这些胁迫过程中产生了一系列从细胞到生理水平的应答反应，这些反应往往是通过基因表达的变化实现的，通过分离和鉴定非生物胁迫诱导的基因，并对这些基因功能进行深入研究可逐渐建立一个比较详细的胁迫信号转导网络体系(Xiong et al, 2002 ；Nakashima et al,2006) 水通道蛋白(Aquaporin AQP)是近年发现的一类专一运输水分的质膜或液泡膜上26 30kD的膜上内在蛋白，与离子通道、甘油通道等功能通道蛋白同属MIP(Major Instrinsic Protein)蛋白家族。目前已经鉴定的植物Aquaporins有两大类,一类是位于质膜的PIP和TIP，质膜AQP (PIP)负责水分的吸收与外排，液泡AQP (TIP)负责调节膨压，因而细胞结构的完整性得以维持(Fotiadis, 2001);另两类是与大豆结瘤素_26Aquaporins 同源的和小碱性内部蛋白SIP(Johanson et al, 2001),这些蛋白在调节细胞间水分的运输过程中起重要的特定作用，它们在介导大部分土壤水分吸收的根部表达较丰富(Javot and Maurel, 2002) 0植物水通道蛋白中有些呈组成型表达，而大多数受环境因子的诱导表达(Forrest et al, 2007) 0在逆境条件下，如干旱、冷害、机械损伤、渗透胁迫、重金属和淹水缺氧等，在转录水平以及蛋白质水平上大多数AQP表达下降，导致AQP通道活性下降甚至消失，从而限制了植物体内水分流失，维持水分平衡，增加了植物对胁迫因子的耐受能力 (Kaldenhoff et al，2006)，而另有报道称AQP在水分胁迫或冷害胁迫下的表达要么上调， 要么下调(Aharon et al, 2003 ；Guerrero et al, 1990 ；Sakr et al, 2003) 在真菌菌根的根部，编码植物水通道蛋白的基因表达是上调的，并且主要在含有丛枝吸胞细胞的液泡内 (Roussel et al, 1997 ；Krajinski et al, 2000),几个编码水通道蛋白在外生菌根的杨树植株上也是上调表达，这与真菌菌根的杨树根部的水分运输能力的增加有关(Marjanovic et al，2005) ,Porcel等(2005)年也发现烟草中PIP基因的损害降低了两个灌木真菌菌根在干旱胁迫下的共生效率；KeSSarin等(2009)在橡胶树中克隆了两个水通道蛋白基因HbPIP2 ； I和HbTIPl ;1，发现乙烯能诱导HbPIP2 ；1在韧皮部和乳汁管组织上调表达，而HbTIPl ；1 在乙烯处理后的韧皮部组织是下调表达，在乳汁管组织中是上调表达，这表明该类蛋白在不同的组织中起着不同的调节水分的作用。盐和干旱胁迫下，水通道蛋白可能具有调节水分通过细胞膜速度的功能(Chrispeels et al, 1999) 0在玉米根部，盐胁迫降低了外皮层对水分的通透性，渗透压降低了 5倍，水分通透性的变化反映了根部水分吸收和运输能力的改变，这种变化可能是由于降低了水通道的开放程度或者开放数量造成的(Azaizeh et al，1991)。水分的跨膜运输还与水通道蛋白的活性有关，水通道蛋白上存在多个磷酸化位点，其开关受磷酸化和去磷酸化调节；在菠菜中，低水势能降低水通道蛋白PM28A的磷酸化程度，而磷酸化程度降低导致水分通透能力下降(Johansson et al, 1996);来自郁金香的两个水通道蛋白基因TgPIP2 ；1和TgPIP2 ;2在毕赤酵母中过表达时，蛋白激酶和蛋白磷酸酶影响它们在酵母细胞中的水通道活性，这表明水通道蛋白的活性受磷酸化调节(Abul et al，2009)。植物水通道蛋白具有促进水的长距离运输、细胞内外的跨膜水运输、调节细胞涨缩及运输小分子物质的功能(周宜君等，2006)。一些水通道蛋白与植物响应水分胁迫有关(Ahsron et al, 2000), Yamaguchi-Shinozaki等(1992)发现拟南芥质膜内在蛋白基因 rd28在干旱诱导下表达量增多；Yamada等(1997)发现烟草NeMip2和NeMip3都能被干旱诱导表达。水孔蛋白、HVATPase和Na+/H+反向运输蛋白在调节细胞水势和胞内盐离子分布中起信号作用。植物体可以通过调控水孔蛋白等膜蛋白以加强细胞与环境的信息交流和物质交换，改变膜对水分的通透性，实现渗透调节，以增强植物的抗旱、耐盐能力。这说明盐和干旱胁迫植物在分子水平上通过影响水通道蛋白的性质和丰度，改变了细胞对水分的吸收能力。这些研究结果都表明植物通过水孔蛋白调节细胞对水分的吸收能力而适应高盐和干旱等不利的环境条件。
发明内容
本发明提供了一个来源于野生大豆的SIP类基因及其所编码的蛋白质，名称为 Glycine soja Small Instrinsic Protein (简称 Gs SIP),来源于野生黑大豆(Glycine soja)。其特征在于a)序列表中SEQ ID NO. I的DNA序列；b)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO. I限定的DNA序列杂交的核苷酸序列 (所述高严谨条件为在0. I X SSPE (或0. I X SSC), 0. 1% SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜；列表中的SEQ ID NO. I由747个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5’端第I位至 747位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID NQ. 2的氨基酸残基序列的蛋白质)；c)编码与序列表中SEQ ID NO. I相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。—个由上述脱氧核苷酸序列所编码的蛋白质，其特征在于a)序列表中的 SEQ ID NO. 2 ；b)将序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的氨基酸残基序列。其中，序列表中的SEQ ID NO. 2由248个氨基酸残基组成,通过http://www. ncbi. nlm. nih. rov/BLASTp结果表明该蛋白自氨基端(N端)第130位左右至第230位左右的氨基酸残基为保守的MIP超家族蛋白特异保守结构域(图I)。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增Gs SIP任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明还提供一种将本发明中的Gs SIP在调控植物抗逆中的应用实例。本发明所提供的调控植物抗逆性的应用实例，是将所述野生大豆Gs SIP类基因导入植物组织或细胞，植物抗逆性得到提高。所述的Gs SIP基因可通过含有Gs SIP的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双兀农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pCXSN或其他衍生植物表达载体；使用本发明的Gs SIP构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子； 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记(卡那霉素、潮霉素等)或抗化学试剂标记基因(如抗除草剂bar 基因等)及可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或蛋白等(GUS基因、GFP基因等)。携带有Gs SIP的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接 DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。上述通过转基因调控植物抗逆性的方法对所有植物均适用， 既可适用于单子叶植物(小麦、水稻、玉米等)，也可以适用双子叶植物(大豆、烟草、棉花
本发明提供的Gs SIP基因来自野生大豆，多重序列比对发现和其他植物的SIP类基因具有较高的保守性(图2);半定量PCR检测结果表明在Gs SIP大豆的根、茎、叶、花、 豆荚中均有表达，叶片中表达稍弱(图3);半定量PCR分析比发现该基因在盐处理后表达略微上升，表明该基因受盐胁迫的诱导(图4);在转基因组合植株的干旱和盐胁迫处理下， 与对照相比较，转Gs SIP基因的过表达组合植株抗旱和耐盐性明显提高(图6)，表明该基因Gs SIP可作为目的基因导入植物(包括单子叶和双子叶植物)，提高植物抗逆性，具有较高的实际应用价值。
图I为Gs SIP蛋白的保守结构域。图2为Gs SIP与其他植物的SIP蛋白氨基酸的多重序列比对。图3为Gs SIP基因在不同组织器官中表达丰度的实半定量PCR检测结果。图4为Gs SIP基因在栽培大豆与野生大豆分别在盐处理不同时间点的表达分析。 其中，图4(a)为栽培大豆，图4(b)为野生大豆图5为PCXSN植物过表达载体物理图谱。图6为PCXSN::SIP转基因组合植株抗旱、耐盐性鉴定和PCR验证照片。其中，图 6(a)为植株抗旱验证照片，图6(b)为植株抗旱验证照片。
具体实施例方式本发明涉及的引物均委托上海英俊生物技术有限责任公司合成。实施例中涉及的操作方法未作交代的均为公知操作方法。实施例I材料、菌株、试剂大豆材料为野生黑大豆、大肠杆菌菌株DH5ci为本实验室保存。pGEM_T Easy Vector T 克隆试剂盒、Taq DNA 聚合酶、DNA marker、Real-time-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司，Trizol reagent, T4DNA连接酶来自Fermentas公司，反转录试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司，引物由上海英俊生物技术有限责任公司合成，DNA纯化回收试剂盒购于 Promega公司，其它生物学试剂购自上海暗嘉科技发展有限公司。
总RNA提取和cDNA合成样品在液氮中研磨后用Trizol (Invitrogen)提取，经DNasel消化去除DNA,并经I. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和完整性。cDNA合成采用上海捷瑞生物工程有限公司反转录试剂盒。基因克隆设计cDNA序列引物对正向引物SEQ ID NQ. 3 :5' -ATGGTTGGTGCTATAAAAGCAGCGA-3'；反向引物SEQ ID NQ. 4 :5' -TCATGCTTTCTTCTGTTTTACTTC-3'。利用RT-PCR方法从野生大豆幼苗根部组织mRNA中用正向引物SEQ ID NO. 3 和反向引物为SEQ ID NQ. 4扩增全长cDNA，同时利用基因组为模板用正向引物SEQ ID ND.3和反向引物为SEQ ID NO. 4扩增基因全长DNA序列，扩增体系为cDNA稀释样，适量；10 X PCRBuffer, 2. 5 μ I ；dNTP (IOmM), O. 5 μ I ；MgCl2 (25mM)，I. 5μ I ；Primer F(IOmM)，
Iμ I ；Primer R(IOmM)，I μ I ；Taq DNA 聚合酶(5U · πιΓ1)，0· 2μ I ;ddH20 补足至 25 μ I。反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性45S，55°C复性45S，72°C延伸lmin，35个循环；72°C 延伸lOmin。PCR产物连入pGEM_T Easy Vector T克隆试剂盒载体中，送给南京金思瑞生物科技有限公司测序，重复3次，获得基因序列SEQ ID NO. I。序列分析采用BLAST X和BLAST P搜索NCBI的核苷酸和蛋白质数据库进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测；用Clustal X进行氨基酸序列比对及功能结构域查找与相似序列分析。结果表明，该蛋白氨基酸残基序列SEQ ID NQ. 2与蓖麻(Ricinus communis)、葡萄 (Vitis vinifera)、松树(Populus trichocarpa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)玉米 (Zea mays)等的水通道SIP基因均有较高的相似性，都在氨基酸130 230之间具有一个保守的MIP家族结构域(如图1，2所示)。基因表达分析设计内参引物对Tubulin-F SEQ ID NO. 5 ；5' -AACCTCCTCCTCATCGTACT-3'；Tubulinn-R SEQ ID NO. 6 5' -GACAGCATCAGCCATGTTCA-3'。GmActionF SEQ ID NO. 7 5’ -CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3 ；GmActionR SEQ ID NO. 8 5' -GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3'。采用半定量RT-PCR分析法，利用提取的幼苗根、茎、叶组织和花以及豆荚的cDNA 为模板，以正向引物SEQ ID NQ. 3和反向引物SEQ ID NQ. 4来进行基因的组织表达分析；利用大豆看家基因Gmtubulin为内参对照，所用引物为，Tubulin-F SEQ ID即.5和Tubulin-R SEQID NQ. 6。结果见图3。利用200mM氯化钠处理不同时间点的cDNA为模板来进行基因的诱导表达分析，所用引物为正向引物SEQ ID N0.3和反向引物SEQ ID NQ. 4，利用大豆看家基因GmAction为内参对照，所用引物为GmActionF SEQ ID NO. 7和GmActionR SEQ ID NO. 8，对栽培大豆与野生大豆分别在盐处理不同时间点的表达分析，结果见图4，其中， 图4a为栽培大豆，图4b为野生大豆半定量RT-PCR分析法中的扩增体系为cDNA稀释样，适量；IOXPCR Buffer,
2.5 μ I ；dNTP (IOmM)，0· 5 μ I ；MgCl2(25mM)，I. 5 μ I ；Primer F(IOmM)，I μ I ；Primer R (10mM),lu I ；Taq DNA 聚合酶(5U .ι Γ1)，0· 2 μ I ;(1(1!120补足至25 4 I。反应程序为94°C 预变性 3min ;94°C变性 45S，55°C复性 45S，72°C延伸 lmin，29 个循环；72°C延伸 IOmin0载体构建设计引物对设计35sF 正向引物 SEQ ID NO. 9 5' -ACTCGCCGTAAAGACTGG-3'。利用Xcml酶单切载体PCXSN形成T/A克隆位点，利用PCR扩增基因全长0RF，所用引物为SEQ ID NQ :3和SEQ ID NQ :4。使用T4连接酶把扩增产物连入酶切后的空载体内，用35sF正向引物SEQ ID NQ :9和cDNA序列反向引物SEQ ID NQ :4扩增获得方向正确的阳性克隆，通过冻融法转入发根农杆菌K599和根癌农杆菌EHA105中，以备后续转化所用 (如图5所示)。实施例2运用Hairy Root实验体系，包括离体和在体两类，一类是豆瓣体外菌液注射发根验证；另一类是在体注射菌液发根然后再生苗，获得转基因组合植株后，对它们进行抗旱或耐旱鉴定；植物过表达载体通过冻融法转入发根农杆菌K599，通过注射的方法获得转基因组合植株(根为转基因，其它为非转基因)，结果发现与空对照和过表达该基因的植株相比，该基因的抑制表达植株对PEG (20% m/v)溶液和200 μ MNaCl的胁迫具有较强的耐受性， 表明该基因在植物的抗旱耐盐胁迫过程中起着重要作用(如图6所示)。功能初步鉴定植物材料植物材料为大豆幼苗，将大豆种子点播于蛭石沙子(体积比3 I)的基质中， 浇水并在光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)中培养，培养条件为25V 28°C，光照时间12h · cT1，光照度为20001x，待苗长至4 5cm时备用。菌液培养与注射从平板上挑取单菌落K599 (含GsSIP基因表达载体)置于加有Iml液体LB (附加 Kan50mg *L_1)的15ml管中，28°C摇床上200rpm摇I 2d,然后吸取2ml离心，沉淀用IOmM 硫酸镁溶液重旋，再离心I次，用IOmM硫酸镁稀释至OD6tltl约O. 8 I. O ;用O. 025ml量程微型注射器吸取菌液，在大豆子叶节部位注射，注射大约3 4个孔，然后放置在加有水的小烧杯内，用塑料膜封口，在光照培养箱中(12h光照/12h黑暗)28°C培养。组合苗生长管理大致培养5 7d时，注射的孔部长出根之后，随后揭掉塑料膜，剪掉原有的根系， 在Hoagland营养液中培养至根部足够健壮时为后续研究所用。组合苗阳性植株鉴定
DNA采用CTAB法提取，O. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。PCR反应总体积为 20 μ 1，模板 DNA(20ng · μ Γ1) I μ 1，正反向引物(10 μ Μ)各 O. 4 μ I, IOXPCRBuffer
2μ I，MgCl2 (25mM) I. 6 μ I，dNTP (IOmM) I. 6 μ I，rTaq DNA 聚合酶(5U · μ Γ1) O. 2 μ I，ddH20 12. 8 μ I。反应程序94°C预变性4min，35个循环94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 50s，72°C终延伸lOmin。所用引物为正向引物SEQ ID NQ. 9和cDNA序列反向引物SEQ ID ND. 4组合扩增来进行验证(注大豆基因组背景无启动子35s序列，可以避免假阳性出现)。结果表明上述植株与对应转基因载体互相对应，即转基因植株可以成功扩增出目的条带，而阴性对照则没有(如图6所示)。实施例3将该基因通过农杆菌介导的方法转入栽培大豆，对转基因植株耐旱的生理生化指标进行测定，并研究其耐旱、盐的分子机理，同样获得了相同的效果。综上所述，本发明提供的Gs SIP基因是首次在大豆中分离出的新基因，其功能为参与大豆的耐旱和耐盐等逆境胁迫的应答。本发明的Gs SIP基因来自野生大豆，具有适合于双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物水稻、玉米、小麦外，更加适合于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等。
权利要求
1.来源于野生大豆的一个SIP基因，具有下述核苷酸序列a)序列表中的SEQID N2. I的DNA序列；b)与序列表中SEQID N2. I限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；c)编码与序列表中SEQID N2. I相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的植物的一个SIP基因所编码的蛋白，其特征在于a)所述蛋白质具有序列表中SEQID Ne. 2的氣基酸残基序列；b)将序列表中SEQID N2. 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有转录激活功能的提高植物抗逆性的氨基酸残基序列。
3.含有权利要求I所述编码基因的表达载体。
4.含有权利要求I所述编码基因的细胞系。
5.含有权利要求I所述编码基因的宿主菌。
6.一种如权利要求I或2所述的荆州黑麦的一个SIP基因的应用，其特征在于^fSIP 基因导入植物组织或细胞，提高植物的抗逆性。
7.根据权利要求6所述的荆州黑麦的一个SIP基因的应用，其特征在于所述的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述的提高植物的抗逆性为提高植物的耐干旱和耐盐性。
全文摘要
来源于野生大豆的一个SIP基因与应用，本发明涉及植物的一个SIP基因，是具有下述核苷酸序列之一的蛋白质a)序列表中的SEQIDNO.1的DNA序列；b)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；c)编码与序列表中SEQIDNO.1相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。本发明的基因及其编码的蛋白能够增强植物抗逆性，尤其是对大豆抗旱、耐盐抗性。
文档编号C12N1/21GK102604965SQ201210065700
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者何晓兰, 刘晓庆, 张大勇, 徐照龙, 易金鑫, 许玲, 黄益红 申请人:江苏省农业科学院