专利名称：一种利用基因芯片方法检测登革热的方法
技术领域：
本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用基因芯片方法来检测登革热病毒的方法。
背景技术：
登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。本病于1779年在埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城发现，并据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。1943年日本科学家首次发现登革热病毒，美国也相继发现这病毒。其病因学直至1944年才被了解，1952年登革热病毒首次被分离了出来，也依血清学方法定出一型登革热病毒(dengue I virus)及二型登革热病毒(dengue 2 virus) ; 1956年在马尼拉从患有出血性疾病的病人身上分别分离出三型登革热 病毒(dengue 3 virus)及四型登革热病毒(dengue 4 virus)。20世纪，登革热在世界各地发生过多次大流行，病例数百万计。在东南亚一直呈地方性流行。我国于1978年在广东流行，并分离出第IV型登革热病毒。此后，于1979、1980、1985年小流行中分离出I、II、III型病毒。登革热病毒属B组虫媒病毒，现在归入披盖病毒科(togaviridae)黄热病毒属(flavivirus)。病毒颗粒呈哑铃状(700 X 20—40nm)、棒状或球形(直径为20—50nm)。髓核为单股线状核糖核酸(RNA)。病毒颗粒与乙型脑炎病毒相似，最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原，用中和试验可鉴定其型别。登革病毒可分为4个血清型，与其他B组虫媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。其中II型病毒引起登革出血热，其他型病毒引起登革热。按世界卫生组织标准分为典型登革热、登革出血热和登革休克综合征3型。患者有肝、肾、心和脑的退行性变；心内膜、心包、胸膜、胃肠粘膜、肌肉、皮肤及中枢神经系统不同程度的出血；皮疹内小血管内皮肿胀，血管周围水肿及单核细胞浸润。重症患者可有肝小叶中央坏死及淤胆，小叶性肺炎，肺小脓肿形成等。登革出血热病理变化为全身微血管损害，导致血浆蛋白渗出及出血。消化道、心内膜下、皮下、肝包膜下、肺及软组织均有渗出和出血，内脏小血管及微血管周围水肿、出血和淋巴细胞浸润。脑型患者尸检可见蛛网膜下腔及脑实质灶性出血，脑水肿及脑软化。登革热现在还没有有效的治疗方法，因此快速检测和及时控制传染源对有效的控制该疾病有着重要的意义。
发明内容
针对登革热，本发明提供一种能够简单快速区分4种血清型登革热的检测方法。本发明是通过以下技术方案实现的(I)制备登革热检测基因芯片；(2)设计通用引物用于扩增4种不同血清型登革热特异性基因片段；
(3)将扩增产物与基因芯片进行杂交；(4)扩增完毕后将产物与芯片杂交，杂交后，进行免疫反应，通过芯片上的颜色变化判断检测结果。该方法包括应用该方法检测登革热病毒所需要的通用引物和与之配套的PCR反应条件。其中引物序列如下引物SEQ ID NO. I :5’ ACAGCMGGHTGGGACACAAGAATSEQ ID NO. 2 :5’ GGTTTRACRCARTCRTCYCCRCT。核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR缓冲液10倍5uL
MgCl22OmmoI/ L5 μ L
Taq DNA 聚合酶5u/ μ LO. 3 μ L
SEQ ID NO. I10umol/L2 μ L
SEQ ID NO. 210umol/L2 μ L
dNTPs 每种 2. 5mmol/LO. 3 μ L
DIG-dUTPlmmol/L0. 3 μ L
模板DNA2 μ L
双蒸水33. IuL 总体积50 μ L核酸扩增程序为(1)95°C IOmin(2) 95 °C 30s(3) 55°C 20s(4) 72°C 30s(5)回到第(2)步，重复35次(6) 72 0C 2min以及制备检测基因芯片所用的寡核苷酸探针登革I型探针SEQ ID NO. 3 :5’ CCAACCTAGCTGAGAGYGRTCTTGACT登革2型探针SEQ ID NO. 4 :5，TGGTAACYAACCACATGYAAGGATAACARAAGA登革3型探针SEQ ID NO. 5 :5’ AGGYGTGTTYTCYAAGYCAGACCTCGAGAACCC登革4型探针
SEQ ID NO. 6 :5’ AAGGGCTGAAAGAAAGAGTTGAGAAATGGCTGA。基因芯片的制备方法为将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上，点好样的尼龙膜在长波紫外灯下进行交联5_10min,同时将O. 2 μ L标记有地高辛基团的基因片段也点在每一张尼龙膜上，作为阳性对照，将双蒸水也点在每一张尼龙膜上，作为阴性对照。3、杂交和杂交斑点的酶联免疫显色，按照地高辛DNA标记与检测试剂盒的说明书进行。地高辛标记PCR产物和寡核苷酸探针杂交方法如下预杂交预杂交液先预热到50°C，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50°C预杂交30min。 PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95°C，IOmin,迅速插入冰浴。地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10 μ L，再加入ImL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50°C杂交lhr，温和摇动。杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。结果判读尼龙膜上的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列。该引物序列及探针序列参照GenBank EU677174. I Dengue virus I isolateDENV-1/VN/BID-V1550/2007, complete genome 中的序列中的 NS5 基因。本发明用特异性的芯片检测登革热病毒，反应后目测结果未发现假阳性和假阴性的结果。与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，基于基因芯片方法适用于高通量检测登革热病毒能够一次检出相关病毒属于哪种血清型。大大提高了效率节约了时间，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
图I基因芯片模式图，P系列为3个平行的阳性参照点，N系列为3个平行的阴性参照点，I系列点为3个平行的登革热I型探针点，2系列点为3个平行的登革热2型探针点，3系列点为3个平行的登革热3型探针点，4系列点为3个平行的登革热3型探针点。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。实施例I
样本某待测样品。I.样品处理将样品混匀处理。2.核酸抽提取样品在PBS中重悬，使用RNA抽提试剂盒根据说明书要求进行RNA抽提。3. cDNA 的制备将总RNA使用RNA逆转录试剂盒，根据说明书要求逆转录RNA为cDNA。4. PCR 扩增
等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR缓冲液10倍5uL
MgCl22OmmoI/ L5 μ L
Taq DNA 聚合酶5u/μ LO. 3 μ L
SEQ ID NO. IΙΟμηιοΙ/L2 μ L
SEQ ID NO. 210umol/L2 μ L
dNTPs每种 2. 5mm。I/LO. 3 μ L
DIG-dlJTPlmmol/L0. 3 μ L
模板DNA2 μ L
双蒸水33. I μ L
总体积50 μ L核酸扩增程序为(I) 95°C IOmin(2) 95 °C 30s(3) 55°C 20s(4) 72°C 30s(5)回到第(2)步，重复35次(6) 72 0C 2min5.预杂交预杂交液先预热到50°C，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50°C预杂交30min。PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95°C，IOmin,迅速插入冰浴。地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10 μ L，再加入ImL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50°C杂交lhr，温和摇动。杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。结果判读尼龙膜上阳性参照和登革I型探针呈现的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列，样品含有登革I型核酸。实施例2样本某待测样品。 I.样品处理将样品混匀处理。2.核酸抽提取样品在PBS中重悬，使用RNA抽提试剂盒根据说明书要求进行RNA抽提。3. cDNA 的制备将总RNA使用RNA逆转录试剂盒，根据说明书要求逆转录RNA为cDNA。4. PCR 扩增等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR缓冲液10倍5μ
MgCl22OmmoI/ L5 μ L
Taq DNA 聚合酶5u/ μ LO. 3 μ L
SEQ ID NO. IΙΟμιηοΙ/L2 μ L
SEQ ID NO. 210umol/L2 μ L
dNTPs每种 2.5mmol/LO. 3 μ L
DIG-dllTPlmmol/L0. 3 μ L
模板DNA2 μ L
双蒸水33. I μ L
总体积50 μ L核酸扩增程序为(1)95°C IOmin(2) 95 °C 30s(3) 55°C 20s(4) 72°C 30s(5)回到第(2)步，重复35次
(6) 72 °C 2min5.预杂交预杂交液先预热到50°C，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50°C预杂交30min。PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95°C，IOmin,迅速插入冰浴。地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10 μ L，再加入ImL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50°C杂交lhr，温和摇动。 杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。结果判读尼龙膜上阳性参照和登革I型探针呈现的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列，样品含有登革I型核酸。
权利要求
1.一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，包括以下两个引物SEQ ID NO. I :5’ ACAGCMGGHTGGGACACAAGAATSEQ ID NO. 2 :5’ GGTTTRACRCARTCRTCYCCRCT。
2.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，包括以下四个探针 登革I型探针SEQ ID NO. 3 :5’ CCAACCTAGCTGAGAGYGRTCTTGACT登革2型探针SEQ ID NO. 4:5’ TGGTAACYAACCACATGYAAGGATAACARAAGA登革3型探针SEQ ID NO. 5 :5’ AGGYGTGTTYTCYAAGYCAGACCTCGAGAACCC登革4型探针SEQ ID NO. 6 :5’AAGGGCTGAAAGAAAGAGTTGAGAAATGGCTGA。
3.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量 PCR缓冲液10倍5uLMgCl22OmmoI/ L5 n LTaq DNA 聚合酶5u/ y L0. 3 Ii LSEQ ID NO. I10umol/L2 u LSEQ ID NO. 210umol/L2 u LdNTPs 每种 2. 5mmol/L0. 3 u LDIG-dUTPImmo I/L0.3ul 模板DNA2 u L双蒸水33. IuL总体积50 u L。
4.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，核酸扩增程序为(1)95°CIOmin(2)95 °C 30s(3)55°C 20s (4)72。。30s (5)回到第⑵步，重复35次(6)72 0C 2min。
5.根据权利要求I所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，标记的PCR产物与芯片的杂交温度为50°C。
全文摘要
本发明公开了一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，设计了通用引物组序列，5’ACAGCMGGIITGGGACACAAGAAT；5’GGTTTRACRCARTCRTCYCCRCT；和用于检测4个不同登革热病毒型的特异性探针5’CCAACCTAGCTGAGAGYGRTCTTGACT；5’TGGTAACYAACCACATGYAAGGATAACARAAGA；5’AGGYGTGTTYTCYAAGYCAGACCTCGAGAACCC；5’AAGGGCTGAAAGAAAGAGTTGAGAAATGGCTGA。针对登革热，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速高通量能够分型检测登革热的检测方法。
文档编号C12Q1/70GK102808041SQ20121006587
公开日2012年12月5日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者杨春江, 祁军, 柴洪森, 詹曦菁, 刘寅, 窦勇鹰, 周君野 申请人:中华人民共和国天津出入境检验检疫局