一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪瘟病毒Erns?IgM抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术和动物传染病诊断研究领域。该ELISA试剂盒包含有：包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原（猪瘟病毒Erns蛋白）、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液。本发明采用捕获法检测IgM抗体，夹心法检测特异的猪瘟病毒Erns?IgM抗体，所制成的试剂盒特异性达100%，灵敏度1:800，可用于对猪瘟病毒感染的诊断及猪瘟疫苗的免疫效果评价。
【专利说明】—种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和动物传染病诊断研究领域，具体涉及一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪痕是由猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病，对养猪业危害严重，是世界粮农组织和各国政府严密监控和检疫的主要传染病
之一 O
[0003]CSFV属黄病毒科瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约
12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、C、Erns (EO)、EUE2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除 C、Erns、El 和 E2 为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。
[0004]猪感染CSFV后主要产生针对结构糖蛋白E0、E2和非结构蛋白NS3的抗体。糖蛋白EO和E2是病毒诱导机体产生中和抗体的两个主要保护性抗原，同时也是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白。
[0005]Erns是病毒的一种囊膜糖蛋白，也称gp44/48,旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu268_Ala494组成。在感染细胞中Erns在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱，易从囊膜上游离下来。Erns可诱导产生猪瘟的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码Erns的核酸序列在属内比编码E2的序列保守程度高，因此Erns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。
[0006]猪瘟病毒的快速检测对于猪瘟的诊断具有特别重要的意义。目前猪瘟病毒检测方法主要有应用病毒分离鉴定、免疫组织化学法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Elisa检测等。其中Elisa检测法以其快速、方便、敏感等优点，在众多方法中脱颖而出。但市场中的Elisa试剂盒多为检测抗E2抗体的试剂盒，而无对Erns IgM抗体的方面的研究。
【发明内容】
[0007]本发明的首要目的在于提供一种检测猪瘟病毒(CSFV) Erns IgM抗体的ELISA试剂盒。
[0008]本发明的目的还在于提供上述检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的使用方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用的以下技术方案:
[0010]一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，包含有:包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液。
[0011]所述的检测用抗原为重组猪瘟病毒Erns(CSFV-Erns)蛋白，以样品稀释液溶解稀释至5-10 μ g/mL ;优选的，所述的重组猪瘟病毒Erns蛋白通过包含如下步骤的方法制备得到:提取猪瘟病毒的RNA为模板通过反转录PCR扩增Erns蛋白目的基因，将目的基因与连接到pET30a载体上再转入含有PGr07重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21 (DE3)进行原核表达、纯化得到纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白；其中扩增引物为:
[0012]CSFV-Erns 基因上游引物:5 ’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3 ’，
[0013]CSFV-Erns 基因下游引物:5 ’ -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3 ’。
[0014]所述的包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板，所包被的抗猪IgM单克隆抗体的量优选为0.1-0.5 μ g。所述的抗猪IgM单克隆抗体可商购，或按照包含如下步骤的方法制备:以纯化的猪IgM免疫Balb/c小鼠，取免疫成功的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经克隆与ELISA筛选，最终分别筛选出可识别猪IgM的杂交瘤细胞株，以此杂交瘤细胞株注射至小鼠腹腔生产腹水并用辛酸硫酸铵沉淀法纯化腹水得到抗猪IgM单克隆抗体。包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板优选通过包含如下步骤的方法得到:通过将抗猪IgM单克隆抗体用包被缓冲液(0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释成1_5 μ g/mL，往酶标板上每孔加入100yL，4°C包被过夜;每孔再加入150 μ L封闭液(5_BSA，以0.01mol/L,ρΗ7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制)，37°C温育Ih0
[0015]所述的样品稀释液优选为含1% BSA、0.1%深海鱼明胶、0.02%叠氮化钠(NaN3)的PBS，其中所述的PBS优选为0.01mol/L, pH值为7.2-7.4的PBS0
[0016]所述的阳性对照为用样品稀释液100倍稀释的含猪瘟病毒Erns IgM抗体的的猪阳性血清，此血清为以猪瘟兔化弱毒苗免疫获得；所述的阴性对照为用样品稀释液100倍稀释的未感染过猪瘟病毒且未以猪瘟疫苗免疫过的健康猪阴性血清。
[0017]所述的浓缩洗涤液(IOX)优选为含0.5% Tween20的0.lmol/L、ρΗ7.2-7.4的PBS，使用前用去离子水做10倍稀释。
[0018]所述的酶结合物优选为辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体，其工作浓度为10-20 μ g/mL，优选通过包含如下步骤的方法制备:
[0019]I)制备抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体:用纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白免疫Balb/c小鼠，三免后，取Elisa效价达到1:10000的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以HAT培养基选择性培养后，进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔进行亚克隆；再取亚克隆孔进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔转入24孔板进行第二次亚克隆；对二亚细胞株进行间接Elisa检测及免疫荧光筛选出抗猪瘟病毒Erns蛋白的单克隆杂交瘤细胞株；将此杂交瘤细胞株进行冻存，同时打3只小鼠制备腹水，将制得的小鼠腹水以辛酸硫酸铵沉淀法纯化、透析，制得抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体。
[0020]2)将抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，其步骤是:称取5mgHRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混匀置冰箱4度反应30分钟，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室温避光反应30分钟后加入含5mg抗猪痕病毒Erns单克隆抗体的水溶液ImL,混勻并装透析袋与0.05mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，使之结合；然后吸出加入NaBH4溶液(5mg/mL) 0.2mL,置冰箱4度2h，取出加入等体积饱和硫酸铵；放冰箱4度30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH7.4PBS中，并透析过夜；次日再离心除去不溶物，即得HRP标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体；用0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL，再以Bradford法测定浓度，然后以酶标抗体稀释液(可商购)稀释至10-20 μ g/mL制成酶结合物工作液。
[0021]所述的酶显色底物优选为TMB显色液。
[0022]所述的终止液优选为lmol/L的H2SO4溶液。
[0023]上述检测猪瘟病毒(CSFV)Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
[0024](I)将待测血清或其它样品用样品稀释液按1:100稀释，每孔100 μ L加入酶标板中，平行加样2~6个孔，同时设置阳性对照组、阴性对照组及空白对照组；其中阳性对照组加入100 μ L阳性对照液、阴性对照组加入100 μ L阴性对照液、空白对照组加入100 μ L样品稀释液，每组对照平行加样2~6个孔。
[0025](2)加样完成后，轻振酶标板混匀孔中样品，37°C孵育1小时。
[0026](3)弃去孔中溶液，洗涤液清洗3~5次，最后一次在吸水纸上拍干。
[0027](4)每孔加入100 μ L检测用抗原(重组猪瘟病毒Erns蛋白，样品稀释液溶解，浓度 5-10 μ g/mL)，37°C孵育 I 小时。
[0028](5)重复步骤(3)，每孔加入酶结合物100μ L，37°C孵育I小时。
[0029](6)重复步骤(3)，每孔加入酶显色底物100 μ L,室温避光反应10_15分钟。
[0030](7)每孔加入100 μ L终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD45tlnm)。
[0031](8)结果计算与判定:检测中阳性对照血清的OD值与阴性对照血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；Cut off (CO值)=阴性对照光吸收值OD45tolX 2.1倍，样品值=样品光吸收值0D45tol/C0值，其中，样品值> I为阳性；样品值≤I为阴性。
[0032]与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下优点和效果:
[0033](I)本发明的检测猪瘟病毒(CSFV)Erns IgM抗体的ELISA试剂盒采用猪IgM单克隆抗体制备酶标板，进而组成双抗夹心法Elisa检测猪瘟病毒Erns特异性IgM抗体的试剂盒，显著提高了检测的灵敏度和特异性。
[0034](2)本发明通过采用伴侣蛋白表达系统原核表达猪瘟病毒(CSFV)Erns蛋白，成功的使Erns蛋白在上清中表达，并提高了表达量。
[0035](3)本发明采用捕获法检测IgM抗体，夹心法检测特异的(CSFV)Erns IgM抗体，所制成的试剂盒特异性达100%，灵敏度高于1:800，可用于对猪瘟病毒感染的诊断及猪瘟疫苗的免疫效果评价。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1本发明制备的重组猪瘟病毒(CSFV)Erns蛋白小量表达SDS-PAGE图。
[0037]图2本发明制备的重组猪瘟病毒(CSFV)Erns蛋白纯化后的SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0039]实施例1重组猪瘟病毒Erns蛋白的制备
[0040](I)根据NCBI GeneBank中猪瘟病毒石门株全基因组序列(登录号AF333000.1)，以猪瘟病毒石门株囊膜蛋白Erns全序列及E2主要抗原区B/C区和D/A区的基因序列为模板设计合成引物，
[0041]CSFV-Erns 基因上游引物为:5’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3，,
[0042]CSFV-Erns 基因下游引物为:5’ -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3，；
[0043]其中，下划线部分为引入的酶切位点，上游引物引入的酶切位点为BamHI，下游引物引入的酶切位点为XhoI。以从猪瘟病毒石门株中提取的RNA为模板进行反转录PCR，获取Erns蛋白目的基因。
[0044](2)构建重组表达载体:将表达质粒pET30a用限制性内切酶和上述扩增的Erns蛋白目的基因用BamHI和XhoI进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳后，用凝胶回收试剂盒(购自Invitrogen公司)回收DNA片段，用T4DNA连接酶连接回收的DNA片段。
[0045](3)将步骤2)中所得连接产物转化大肠杆菌DH5CI，根据重组载体的标志(抗Kan或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，菌落PCR初步鉴定。
[0046](4)重组表达载体的鉴定:提取质粒，进行双酶切鉴定，获得了约为680bp的DNA片段，与预期的CSFV-Erns (681bp)大小一致。将酶切片段与预期相符的CSFV-Erns阳性克隆送至华大基因公司测序，结果插入的位置、方向、大小、读码框及核苷酸序列均正确，将该重组表达载体命名为pET30a-Erns。
[0047](5)伴侣蛋白感受态表达宿主菌的制作:为了提高CSFV-Erns在上清表达的几率，将测序正确的重组质粒pET30a-Erns转化到含有PGr07重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21(DE3)感受态细胞中。
[0048](6)小量诱导表达:挑取转化平板上的单菌落接种到3mL LB培养液(需加入终浓度0.05-0.lg/L的卡那霉素和氯霉素两种抗生素)中，37°C、180rpm将细菌培养至OD6tltl =
0.2 ;加入0.1-0.5mmol/L伴侣蛋白的诱导剂四环素或L-阿拉伯糖，37°C、180rpm继续将细菌培养至OD6tltl = 1.0 ;加入终浓度为0.5mM的IPTG，30°C、180rpm诱导过夜。
[0049](7)表达蛋白的鉴定:将诱导过夜的宿主菌收集、破碎，进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，诱导表达的pET30a-Erns重组菌在60KD处有明显的伴侣蛋白GroEL表达，在26KD处有明显的重组蛋白Erns表达，说明表达成功(图1)。
[0050](8)重组CSFV-Erns蛋白的大量诱导表达:将含有正确表达载体的大肠杆菌接种于大量培养液中以小量诱导相同条件诱导表达，培养结束后离心收集菌液，超声波裂解菌液菌液澄清或疏散状态；11000rpm、4°C离心30min，将上清与沉淀分离，保存于4°C。取上清与沉淀样品进行SDS-PAGE，发现重组CSFV-Erns在上清表达。
[0051](9)重组CSFV-Erns蛋白的纯化:按照N1-NTA琼脂糖柱(Qiagen，货号30210)说明书纯化，纯化的SDS-PAGE电泳重组CSFV-Erns蛋白SDS-PAGE结果见图2。
[0052]实施例2抗猪瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns) IgG单克隆抗体的制备
[0053](I)将实施例1纯化的重组CSFV-Erns蛋白免疫Balb/c小鼠，三免后，取Elisa效价达到1:10000的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以HAT培养基37°C、饱和湿度、5% CO2培养融合细胞。
[0054](2)融合后第四天开始观察集落，待集落生长至孔底约1/6时半量换HT培养基，次日分别以重组CSFV-Erns蛋白包板进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔进行亚克隆。
[0055](3)亚克隆:镜下观察阳性孔细胞，选择细胞形态好的集落以有限稀释法进行亚克隆。亚克隆板第5天以CSFV阳性血清1:1000包板进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔转入24孔板进行第二次亚克隆。
[0056](4) 二次亚克隆第5天，取培养上清同步进行免疫荧光(IF)及以下三种Elisa检测:
[0057]A.以重组CSFV-Erns蛋白包板的间接Elisa检测。
[0058]B.以CSFV阳性血清1:1000包板的间接Elisa检测。
[0059]C.先以CSFV-Erns中和抗CSFV-Erns的阳性孔上清，将中和后的上清进行B检测。
[0060]最终筛选出同时满足免疫荧光(IF)阳性及A、B检测阳性和C检测阴性的抗CSFV-Erns杂交瘤细胞株，此杂交瘤细胞株即为可识别猪瘟病毒Erns蛋白的细胞株。
[0061](5)细胞株冻存及腹水制备:将上述成功建株的杂交瘤细胞株进行冻存，同时打3只小鼠制备腹水，每只小鼠腹腔注射细胞量为5 X IO5?I X IO6个/0.5mL。
[0062](6)将制得的小鼠腹水以辛酸硫酸铵沉淀法纯化、透析，制得抗猪瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns) IgG单克隆抗体。
[0063]实施例3检测猪瘟病毒(CSFV) Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的制备
[0064](I)包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板:将抗猪IgM单克隆抗体以包被缓冲液稀释成I μ g/mL,每孔加100 μ L，4°C包被过夜；以洗涤液洗涤2?3次，拍干；每孔加150 μ L封闭液，37°C温育lh，洗涤液洗涤2?3次，拍干。其中，包被缓冲液为0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，其配制为:准确称取1.59g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠，加蒸馏水至IOOOmL ;封闭液为以0.01mol/L、pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解的浓度为5%的BSA ;洗涤液为浓缩洗涤液稀释10倍后制成的工作液。
[0065](2)样品稀释液:在0.01mol/L、pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入I % (m/v)BSA、0.1% (m/v)深海鱼明胶、0.02% (m/v)叠氮化钠(NaN3)配制而成。
[0066](3)阳性对照液:采集以猪瘟兔化弱毒苗免疫获得的含猪瘟病毒Erns IgM抗体的猪阳性血清，以样品稀释液100倍稀释。阴性对照液:采集未感染过猪瘟病毒且未以猪瘟疫苗免疫过的健康猪血清，以样品稀释液100倍稀释。
[0067](4)检测用抗原为实施例1纯化的重组CSFV-Erns蛋白，以样品稀释液溶解稀释至5-10 μ g/mL。
[0068](5)浓缩洗涤液(IOX):在0.lmol/L、pH7.2-7.4的PBS中加入体积比为0.5%的Tween20,使用前用去离子水做10倍稀释。
[0069](6)酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体，将实施例2制得的抗猪瘟病毒Erns蛋白IgG单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，其步骤是:
[0070]I)称取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液
0.5mL,混匀置冰箱4度反应30分钟；
[0071]2)取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室温避光反应30分钟；
[0072]3)加入含5mg抗猪痕病毒Erns蛋白IgG单克隆抗体的水溶液ImL,混勻并装透析袋与0.05mol/L, pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，使之结合；
[0073]4)吸出加入NaBH4溶液(5mg/ml) 0.2mL,置冰箱4度2h，取出加入等体积饱和硫酸铵；放冰箱4度30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH7.4PBS中，并透析过夜；
[0074]5)次日再离心除去不溶物，即得HRP标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体，用
0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL,再以Bradford法测定浓度,然后以酶标抗体稀释液(可商购)稀释至10-20 μ g/mL。
[0075](7)酶显色底物:为购自Sigma的商用即用型单一溶液TMB显色液(货号:T8665)
[0076](8)终止液:取54.3mL浓度为95 %的浓硫酸，加蒸馏水至1000mL,制成浓度为ImolA^AH2SO4 溶液。
[0077]实施例4检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的使用方法
[0078]利用本发明的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒在检测猪瘟病毒中的应用，其步骤是:
[0079](I)从试剂盒中取出酶标板，将待测血清或其它样品用样品稀释液按1:100稀释，每孔100 μ L加入酶标板中，平行加样2~6个孔，同时设置阳性对照组、阴性对照组及空白对照组，其中阳性对照组加入100μ L阳性对照液、阴性对照组加入100μ L阴性对照液、空白对照组加入100 μ L样品稀释液，每组对照平行加样2~6个孔。
[0080](2)加样完成后，轻振酶标板混匀孔中样品，37°C孵育I小时。 [0081](3)弃去孔中溶液，洗涤液清洗3~5次，最后一次在吸水纸上拍干。
[0082](4)每孔加入100μ L检测用抗原，37°C孵育I小时。
[0083](5)重复步骤(3)，每孔加入酶结合物100μ L，37°C孵育I小时。
[0084](6)重复步骤(3)，每孔加入酶显色底物100 μ L,室温避光反应10_15分钟。
[0085](7)每孔加入100 μ L终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD45tlnm)。
[0086](8)结果计算与判定:检测测中阳性对照血清的OD值与阴性对照血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；Cut off (CO值)=阴性对照光吸收值OD45tlnmX 2.1倍，样品值=样品光吸收值0D45tol/C0值，其中，样品值> I为阳性；样品值≤I为阴性。
[0087]实施例5检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的特异性、灵敏度测试
[0088](I)特异性检测
[0089]按实施例4所述的检测方法，利用实施例3制得的试剂盒分别检测猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)免疫早期(7-14天)血清、猪瘟病毒(CSFV)感染早期(7_14天)的血清、纯化的CSFV-Erns IgG抗体(实施例2制得)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，又称猪蓝耳病毒)感染的血清、猪圆环病毒2型(PCV2)感染的血清、猪伪狂犬病毒(PRV)感染的血清、猪乙型脑炎病毒(JEV)感染的血清和猪瘟病毒阴性血清。
[0090]每种血清平行加样三个孔，测定OD45tlnm值，计算其OD45tlnm平均值。结果如下表所示:
[0091]
【权利要求】
1.一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包含有:包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液；所述的检测用抗原为猪瘟病毒Erns蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的检测用抗原的浓度为5-10μ g/mL ;所述的猪瘟病毒Erns蛋白通过包含如下步骤的方法制备得到:提取猪瘟病毒的RNA为模板通过反转录PCR扩增Erns蛋白目的基因，将目的基因与连接到pET30a载体上再转入含有PGr07重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21进行原核表达、纯化得到纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白；其中扩增引物为: CSFV-Erns 基因上游引物:5’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’， CSFV-Erns 基因下游引物:5’ -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’。
3.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板所包被的抗猪IgM单克隆抗体的量为0.1-0.5 μ go
4.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的样品稀释液为含1% BSA、0.1%深海鱼明胶、0.02%叠氮化钠的PBS。
5.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照为用样品稀释液100倍稀释的含猪瘟病毒Erns IgM抗体的的猪阳性血清；所述的阴性对 照为用样品稀释液100倍稀释的未感染过猪瘟病毒且未以猪瘟疫苗免疫过的健康猪阴性血清。
6.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的浓缩洗涤液为含0.5% Tween20的0.lmol/L、pH7.2-7.4的PBS，使用前用去离子水做10倍稀释。
7.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体，其浓度为10-20 μ g/mL。
8.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的酶显色底物为TMB显色液。
9.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的终止液为lmol/L的H2SO4溶液。
10.权利要求1-9任一项所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将待测血清或其它样品用样品稀释液按1:100稀释，每孔100μ L加入酶标板中，平行加样2~6个孔，同时设置阳性对照组、阴性对照组及空白对照组；其中阳性对照组加Λ IOOyL阳性对照液、阴性对照组加入100 μ L阴性对照液、空白对照组加入100 μ L样品稀释液，每组对照平行加样2~6个孔； (2)加样完成后,轻振酶标板混勾孔中样品,37C鮮育I小时； (3)弃去孔中溶液，洗涤液清洗3~5次，最后一次在吸水纸上拍干； (4)每孔加入100μ L检测用抗原，37°C孵育I小时； (5)重复步骤(3)，每孔加入酶结合物100μL，37°C孵育I小时；(6)重复步骤(3)，每孔加入酶显色底物100μ L，室温避光反应10-15分钟； (7)每孔加入100μ L终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值； (8)结果计算与判定:检测中阳性对照血清的OD值与阴性对照血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；C0值=阴性对照光吸收值OD45tolX 2.1倍，样品值=样品光吸收值0D450nm/C0值，其中，样品 值> 1为阳性；样品值≤1为阴性。
【文档编号】G01N33/577GK103983782SQ201410250235
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】李建, 漆世华, 韩兴, 舒银辉, 廖园园, 刘洁, 谢红玲, 秦红刚, 徐松, 牟林琳, 朱薇, 温文生 申请人:武汉中博生物股份有限公司