牛流行热病毒间接elisa抗体检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测牛流行热病毒（bovineephemeralfevervirus，BEFV）血清抗体的间接ELISA试剂盒，以及试剂盒中所用的BEFV重组抗原的制备方法和这种重组抗原。这种重组蛋白仅与BEFV抗体发生反应，而不与其它同属或同科病毒的抗体发生交叉反应，具有极高的特异性；重组蛋白还具有良好的反应敏感性。另外，试剂盒重复性良好，与病毒中和试验具有较高的符合率，保存期长。试剂盒操作时技术要求比较宽松，可在生产中广泛推广使用，应用于BEFV流行病学调查和免疫水平监测。
【专利说明】牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测哺乳动物疾病的检测试剂盒，确切讲本发明是一种用于检测牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus, BEFV)试剂盒及这种试剂盒的方法。
【背景技术】
[0002]牛流行热(bovine ephemeral fever,BEF)是由BEFV引起的黄牛、奶牛、肉牛以及水牛的一种急性、热性传染病。BEF由媒介昆虫传播，目前比较明确的媒介是蚊子和库蠓。本病的流行具有明显的季节性，常发生在夏末秋初，消失于第一次霜冻；在传播扩散方式上不受山川和河流的影响，呈跳跃式蔓延。它能够快速传播，流行面广，有一定的周期性。BEF发生于非洲、亚洲和澳大利亚，也在我国多个省份多次发生，导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行以及瘫痪，对养牛业造成重大经济损失。
[0003]疫苗预防是防控BEF的主要手段。国内外的有关科研工作者研制成功了多种疫苗，包括加入不同佐剂的灭活疫苗、弱毒苗以及亚单位苗，并对这些疫苗的免疫效果进行了评价。在实际生产中应用的主要是灭活苗和弱毒苗，我国推广使用的是适应到BHK-21细胞上的JB76H株制备的灭活苗。
[0004]对BEFV疫苗的免疫效果进行评价，或者对BEF进行流行病学调查，就需要检测BEFV血清抗体的试剂盒。虽然国内外学者对检测BEFV抗体的方法进行了许多有意义的研究工作，包括补体结合试验、免疫荧光试验、G1-EL1SA、阻断ELISA方法和中和试验等，但真正实际应用的只有中和试验。其它方法均来源于文献报道，仅仅初步建立了方法，并没有进一步对所建立的方法进行优化，也没有开展临床试验，验证其实际应用效果。到目前为止，这一工作在国内外都是空白，也没有任何一种实现商品化的检测BEFV血清抗体的试剂盒。
[0005]现有技术中，中和试验是检测BEFV抗体的标准方法，可以定性测定血清，也可以有效的检测BEFV抗体效价，但这种方法技术要求比较苛刻，要动用活毒，以细胞病变作为指示指标。因此必须在专业实验室内、由专业人员操作才能完成，局限性非常大，基层兽医单位以及养牛场基本无应用可能。鉴于此种现状，需要研发一种检测BEFV抗体的试剂盒，要求这种试剂盒操作相对简单，大多数兽医单位均可用其检测BEFV血清抗体。
[0006]BEFV属于弹状病毒科，暂时热病毒属，同属的其它病毒还有berrimah virus(BRMV),adelaide river virus (ARV),kotonkan virus (KOTV),obodhiang virus (0B0V)和malakal virus(MALV)。这些病毒的抗血清之间均有交叉反应。要想特异性的检测BEFV血清抗体，必须选择合适的抗原。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种可克服现有技术的不足，仅与BEFV抗体发生反应，而不与其它同属或同科病毒的抗体发生交叉反应的，用于检测BEFV血清抗体的间接ELISA试剂盒，同时提供制备这一检测试剂盒的方法和试剂盒中所用的BEFV重组抗原的制备方法，以及这种
重组抗原。[0008]本发明的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中，包括包被抗原的酶标板，其中的抗原为大肠杆菌表达的蛋白，表达的基因位于BEFV G基因的1141bp-1620bp、长度为480bp，包含有BEFV的特异性Gl抗原表位。
[0009]本发明的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中，其抗原为重组蛋白。
[0010]为方便使用，本发明的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中还有标准阳性血清、标准阴性血清、HRP标记兔抗牛抗体、血清稀释液、酶标抗体稀释液、TMB显色液、终止液和浓缩洗涤液。
[0011]本发明的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒包被抗原的酶标板制备方法是:用SEQ ID Na I和SEQ ID Na 2为上、下游引物，以BEFV RNA为模板扩增出BEFV G基因的1141bp-1620bp，长度为480bp的片段，将前述扩增片段与pMD 19-T Simple载体连接，转化感受态DH5a大肠杆菌，筛选阳性菌株，提取重组质粒pMD-Gl，再将质粒pET30a和pMD_Gl分别用内切酶Λ汝I和通ο I双酶切，分别回收目的DNA片段和pET30a载体片段，再连接、转化感受态BL21 (DE3)大肠杆菌，筛选阳性菌株，用终浓度0.3mmol/L的IPTG进行诱导表达，表达产物经纯化后得到重组目的蛋白，以重组目的蛋白为包被抗原包被酶标板。
[0012]本发明经过相应的试验发现，BEFV糖蛋白(G)基因的部分特异性片段，即BEFV G基因中的1141bp-1620bp，长度为480bp片段具有特异性，只与BEFV阳性血清发生反应，而与其它同属的阳性血清无交叉反应，经进一步试验表明，用这一片段进行检测其结果具有极高的特异性。
[0013]本发明的优越性表现在:
a.选择BEFV G基因的特异性保守片段进行克隆表达，所选择的基因片段与同属其它病毒G基因对应片段的同源性低于40%，并且含有BEFV G基因特异性的Gl抗原表位。因此，这种纯化的重组蛋白作为包被抗原，只与BEFV的阳性血清发生反应，而与同属或同科的其它病毒的阳性血清均不反应，保证了反应的特异性；并且Gl抗原表位是线性表位，重组蛋白具有良好的反应性，保证了反应的敏感性。
[0014]b.表达目前基因片段所用的载体为pET30a，得到的重组蛋白带有组氨酸标签。虽然重组蛋白以包涵体形式存在，但溶解后可用N1-NTA Agarose柱进行纯化,纯度达90%以上，保证了与抗体反应的特异性。
[0015]c.本发明涉及的试剂盒应用间接ELISA技术，开放性操作，与目前用于检测BEFV血清抗体的病毒中和试验相比，技术要求比较宽松，具有极大的可操作性。
[0016]d.本发明中的试剂盒操作步骤简单、方便、快速，相关专业人员均可按照说明书步骤检测血清样品，因此本发明的试剂盒可在兽医机构广泛推广应用。
【具体实施方式】
[0017]一、抗原制备
根据选定的基因片段设计一对引物，上游引物序列为5’ -catatgaatcattatgggatcggatc-3’，下游引物序列为 5’ -ctcgagtgtccatcttactgcctttg-3, ο 引物序列中斜体加黑者为内切酶位点，上游引物中为I酶切位点，下游引物中为ZAo I酶切位点。用病毒RNA提取试剂盒，从BEFV感染血中提取BEFV RNA基因组作模板，用上述引物对，RT-PCR方法扩增目的DNA片段。所扩增到的目的片段长度为480bp，位于BEFV G基因的1141bp-1620bp，包含有Gl抗原表位。将扩增到的目的DNA进行琼脂糖电泳，纯化、回收目的DNA，与克隆载体pMD 19-T Simple连接，转化进大肠杆菌DH5a ;挑取阳性单克隆菌株，提取重组质粒pMD-Gl ;用内切酶I和通ο I对质粒pMD-Gl和表达载体pET30a分别进行双酶切；然后分别进行琼脂糖凝胶电泳，纯化、回收酶切后的目的DNA和载体片段。
[0018]将回收的目的DNA和载体pET30a片段用T4连接酶进行连接，然后转化进表达菌株BL21 (DE3)，挑取阳性单克隆菌株，以终浓度0.3 mmol/L的IPTG进行诱导表达。
[0019]诱导后的菌液离心沉淀，用pH 7.4 PBS洗涤沉淀、重悬，然后超声波破碎菌体，再离心，表达的目的蛋白为包涵体，处于沉淀中。沉淀用8M尿素溶解，然后过N1-NTA Agarose柱进行纯化，得到重组目的蛋白。操作按照说明书进行。
[0020]二、抗原包被
纯化好的重组蛋白作为抗原包被酶标板。经棋盘滴定试验，确定抗原的最佳包被浓度为l.Syg/miaOOy I/孔；血清稀释倍数为1:10 ;HRP标记兔抗牛抗体稀释倍数为1:20000，将其先稀释100倍，用时再作200倍稀释。
[0021]抗原的包被程序为:将_75°C冻存的抗原融化，用PH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1.5“/1111，加入酶标板，10(^1/孔，转入41:过夜。次日甩掉抗原液，洗涤后以2%明胶封闭，100 μ I/孔，37 °C温育30min,再洗漆。然后加入蛋白稳定剂，100 μ I/孔，室温孵育IOmin,甩干,在超净台内吹lh。最后放入包装袋内，抽成真空。
[0022]本发明涉及的试剂盒中的标准阳性血清，用BEFV血毒多次静脉攻毒1.5岁黄牛后制备，共攻毒5-7次。阴性血清为既没有免疫过BEFV疫苗，又没有感染过BEFV的健康黄牛血清。本发明的检测试剂盒中的200倍HRP标记兔抗牛抗体购买于Sigma公司；血清稀释液、酶标抗体稀释液、TMB显色液、终止液、50倍浓缩洗涤液均购自于中国农业科学院兰州兽医研究所生物制品诊断中心。
[0023]三、组装试剂盒
各种试剂完备后组装成本发明的检测BEFV血清抗体的间接ELISA试剂盒(以下简称试剂盒)。建议试剂盒中包括:已包被抗原、真空包装的酶标板(2块)；标准阳性血清I支(100 μ I);标准阴性血清I支(100 μ I) ；200倍HRP标记兔抗牛抗体I支(100 μ I);血清稀释液I瓶(20ml);酶标抗体稀释液I瓶(20ml);TMB显色液I瓶(20ml);终止液I瓶(20ml);50倍浓缩洗涤液I瓶(20ml)。试剂盒4°C保存，保存期为6个月。试剂盒可检测180份血清。
[0024]四、试剂盒的使用方法示例
1.将试剂盒从4°C冰箱中取出，平衡至室温。用双蒸水将50倍洗涤液稀释至I倍使用浓度。
[0025]2.取出酶标板，按待检血清的数量确定需要的酶标板条，剩余的板条放入包装袋中，4°C保存。拆封的酶标板最好在7天内用完。
[0026]3.加血清稀释液:在酶标板孔内加入血清稀释液，第一排的第5~6孔(空白对照孔)为100 μ I/孔，其余各孔为90 μ I/孔。
[0027]4.加血清:酶标板第一排的I~2孔加入标准阳性血清，第3~4孔加入标准阴性血清,第5~6孔为空白对照。其余各孔加入待检血清,每份血清加I孔,不做重复。各血清加入量均为?ο μ I/孔(血清最终稀释度为1:10)，空白对照孔不加血清。轻轻摇动混匀。
[0028]5.温育:用封板膜封住酶标板，放入37°C温箱中孵育30min。
[0029]6.洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去。如此重复4次，拍干。
[0030]7.加酶:用酶标抗体稀释液将HRP标记兔抗牛抗体作200倍稀释，加入酶标板孔内，100 μ I/孔。
[0031]8.温育:操作同5。
[0032]9.洗涤:操作同6。
[0033]10.显色:加入TMB显色液，100 μ I/孔，37°C避光显色5min。
[0034]11.终止:加入终止液，100 μ I/孔。
[0035]12.测定:立即用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD45tl值)。
[0036]13.结果判定:样品OD45tl值一标准阴性血清OD45tl值/标准阳性血清OD45tl值一标准阴性血清OD450值≤0.3为阳性；样品OD45tl值一标准阴性血清OD45tl值/标准阳性血清OD450值一标准阴性血清 OD45tl值< 0.2为阴性；0.2 <样品OD450值一标准阴性血清OD450值/标准阳性血清OD45tl值一标准阴性血清OD45tl值< 0.3为可疑。
[0037]五、试剂盒的敏感性、特异性、重复性、符合率、保存期测定
经病毒中和实验检测抗体效价为1:8和1:32的2份牛流行热阳性血清，分别标记为1、2号血清，将其分别作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160共5个稀释度，用本发明中的试剂盒检测每个稀释梯度的样品，检验试剂盒能检测出的最低抗体效价。结果表明，效价为1:8的I号阳性血清稀释至1:20时检测为阳性；效价为1:32的2号阳性血清稀释至1:80时仍可检测出阳性，说明试剂盒有较高的敏感性。
[0038]用试剂盒检测BRMV、ARV、KOTV, OBOV, MALV 以及狂犬病病毒(Rabies virus, RV,与BEFV同属弹状病毒科)的阳性血清，结果均为阴性，说明BEFV阳性血清和同属其它病毒以及RV阳性血清之间不存在交叉反应，试剂盒有良好的特异性。
[0039]取20份BEFV阳性血清和20份阴性血清，用同批次试剂盒在不同时间相同条件下重复检测三次，判定结果完全相同，说明试剂盒重复性较好。
[0040]经病毒中和试验鉴定的54份阳性血清和30份阴性血清，用试剂盒进行检测，验证该方法与病毒中和试验的符合率。结果表明，试剂盒与病毒中和试验的符合率为97.6%。
[0041]用同批制备的试剂盒每间隔2周检测相同的54份阳性血清和30份阴性血清。结果表明，保存6个月的试剂盒对同一份血清的检测结果相同，说明试剂盒的保存期至少为6个月。
[0042]六、试剂盒检测田间血清样品
用本发明中的试剂盒检测了采自7个省的牛血清共1301份，包括青海省的牦牛血清476份，宁夏自治区的奶牛血清179份，甘肃省的黄牛血清98份，内蒙古自治区的奶牛血清175份，山西省的黄牛血清109份，广东省的黄牛血清34份，云南省的黄牛血清230份。同时用病毒中和试验检测上述血清。检测结果如表1。
【权利要求】
1.牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，包括包被抗原的酶标板，其特征在于抗原对应的基因片段位于BEFV G基因的1141bp-1620bp、长度为480bp。
2.根据权利要求1所述的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于抗原为重组蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于试剂盒中还有标准阳性血清、标准阴性血清、HRP标记兔抗牛抗体、血清稀释液、酶标抗体稀释液、TMB显色液、终止液和浓缩洗涤液。
4.权利要求2或3的牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒包被抗原的酶标板制备方法，其特征在于用SEQ ID Na I和SEQ ID Na 2为上、下游引物，以BEFV RNA为模板扩增出BEFV G基因的1141bp-1620bp，长度为480bp的片段，将前述扩增片段与pMD 19-TSimple载体连接，转化感受态DH5a大肠杆菌，筛选阳性菌株，提取重组质粒pMD_Gl，再将质粒pET30a和pMD-Gl分别用内切酶I和沿ο I双酶切，分别回收目的DNA片段和pET30a载体片段，再连接、转化感受态BL21 (DE3)大肠杆菌，筛选阳性菌株，用终浓度0.3mmol/L的IPTG进行诱导表达，表达产物经纯化后得到重组目的蛋白，以重组目的蛋白为包被抗原包被酶标板。
5.权利要求4的方法制备的重组目标蛋白。
【文档编号】G01N33/535GK103969435SQ201410244271
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】殷宏, 郑福英, 刘志杰, 陈泽, 王积栋, 李志 , 杨吉飞, 高闪电 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所