抗α_vβ₆抗体的制作方法

专利名称：抗α_vβ₆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及抗ανβ6整联蛋白抗体。
背景技术：
整联蛋白是一个细胞表面受体超家族，介导细胞-细胞和细胞-基质粘附。这些蛋白质被认为在发育和组织损伤过程中为细胞的生长、迁移和分化提供锚定以及信号。整联蛋白还与细胞的去分化和侵入有关，特别是在细胞失去它们的特化形态，而成为转移的癌细胞时。整联蛋白是由两个非共价连接的亚基-α和β组成的异源二聚体蛋白质。整联蛋白的结合特异性是由18种不同α链中的一些与8种不同β链中的一些组合所规定的。 ανβ6整联蛋白能够结合多种配基，包括纤连蛋白、腱生蛋白、玻连蛋白和最近鉴定的潜伏相关肽(LAP)，即一种278个氨基酸的肽，其作为前体TGF- β蛋白的一部分合成(Munger等人，Cell96(3) :319_328 (1999))。在分泌过程中，LAP作为N端肽从TGF-β的成熟形式上切下，但是仍然与TGF-β非共价结合，从而保持潜伏状态。该复合物不能与TGF-β受体结合，因此无生物学活性。α νβ 6整联蛋白能够直接结合LAP内所含的RGD基序，导致LAP的释放和TGF- β的激活。由于α ν β 6与LAP的结合对于TGF- β转化为活性状态可能非常重要，因此阻断这种结合可导致ανβ6介导的TGF-β激活的抑制和相关的纤维化病理学。发明概述本发明是基于抗ανβ6高亲和力抗体的发现和表征，包括这些抗体的互补决定区(CDRs)中关键氨基酸残基的鉴定和分析。本发明包括一种单克隆抗体，其可以(a)特异性结合α νβ 6 ; (b)抑制α νβ 6与其配体(如LAP、纤连蛋白、玻连蛋白和腱生蛋白)的结合，其IC5tl值低于10D5的IC50值(国际专利申请公开文本WO 99/07405) ； (c)阻断TGF-β的激活；(d)含有提供ανβ6结合特异性的CDR中的某些氨基酸序列(如图7Α和7Β所示)；(e)特异性结合β 6亚基；和/或(f)在免疫染色程序，如石蜡包埋组织的免疫染色中识别ανβ6。已经发现，与ανβ6结合的抗体可以被分类为生物物理学上不同的类和亚类。一类抗体显示阻断配体(如LAP)与ανβ6结合的能力(阻断剂)。这类抗体可以被进一步分为依赖阳离子的阻断剂和不依赖阳离子的阻断剂之亚类。一些依赖阳离子的阻断剂含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而不依赖阳离子的阻断剂不含RGD序列。另一类抗体显示与ανβ6结合的能力，并且不能阻断ανβ6与配体的结合(非阻断剂)。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明的一些抗体与ανβ6的结合是依赖二价阳离子的，而有些是不依赖二价阳离子的。示例性的阳离子是Ca2+、Mg2+和Mn2+。在一些实施方案中，抗体包含与杂交瘤6. 1A8、6. 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6. 2Β10、
6.2Α1、6. 2Ε5、7. 1G10、7. 7G5或7. 1C5产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。在一些实施方案中，抗体包含一条重链和/或一条轻链，重链的互补决定区(CDR) 1、2和3分别基本(即除了一些保守性变异之外)由SEQID NOs :1、4和7的序列组成，该轻链的CDRs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :10、13和15的序列组成。
在一些实施方案中，抗体包含一条重链和/或一条轻链，重链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :3、5和8的序列组成，该轻链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ IDNOs : 11、14和17的序列组成。在一些实施方案中，抗体包含一条重链和/或一条轻链，重链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :3、6和9的序列组成，该轻链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ IDNOs : 12、14和18的序列组成。在一些实施方案中，抗体包含一条重链和/或一条轻链，重链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :2、46和47的序列组成，该轻链的CDRs 1、2和3分别基本由SEQ IDNOs 48,13和16的序列组成。在一些实施方案中，抗体包含一条重链和/或一条轻链，重链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :49、51和53的序列组成，该轻链的CDRs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :55、57和59的序列组成。在一些实施方案中，抗体包含一条重链和/或一条轻链，重链的⑶Rs 1、2和3分别基本由SEQ ID NOs :50、52和54的序列组成，该轻链的CDRs 1、2和3分别基本由SEQ IDNOs :56、58和60的序列组成。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NOs : 19-36和61-62中任何一个的重链可变域序列。在一些实施方案中，抗体分别包含下列重链和轻链可变域序列(I)SEQ ID NOs : 19 和 37 ;(2) SEQ ID NOs :20 或 21，和 SEQ ID NO 38 ；(3) SEQ ID NOs 22 和 43 ；(4) SEQ ID NOs 23 和 44 ；(5) SEQ ID NOs 24 和 45 ；(6) SEQ ID NOs 25 或 26，和 SEQ ID NOs 42 ；(7) SEQ ID N0s27、28 或 29，和 SEQ ID NOs 39 ；(8) SEQ ID NOs 34 或 35，和 SEQ ID NOs 40 ；(9) SEQ ID NOs 36 和 41 ；(IO)SEQ ID NOs 61 和 63 ;或(Il)SEQ ID NOs 62 和 64。在一些实施方案中，抗体可特异性结合ανβ6，但是不抑制ανβ6与潜伏相关肽(LAP)的结合。至少有些这样的抗体能够与石蜡包埋组织切片中的ανβ6结合，因此能够用于诊断用途。示例性的抗体包括6. 2Α1和6. 2Ε5。 本发明也包括可结合与上述任何抗体相同表位的抗体。本发明也包括含有本发明的一种或多种抗体和药学可接受的载体的组合物。在一些这样的组合物中，抗体与细胞毒性剂(即影响细胞的存活力和/或功能的物质)如毒素或放射性核素偶联。这些组合物中的抗体可以是依赖阳离子的抗体。这些组合物能够对患有或者具有患ανβ6介导的疾病危险的对象(例如哺乳动物，如人)施用，以治疗(例如缓解、减轻、降低、阻止、延迟发生)该疾病。这类疾病的例子包括，但不限于纤维化(例如硬皮病、结瘢、肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化)；银屑病；癌症(例如上皮癌；口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳房、肾或结肠直肠癌)；奥尔波特综合征；急性及慢性肺、肝、肾和其它内脏损伤；肺、肝、肾和其它内脏的硬化。患这些疾病的危险可能是由于遗传诱因；某些生活方式，如吸烟和酗酒；接触环境污染物，如石棉；生理疾病，如糖尿病、肝炎病毒感染(例如丙型肝炎病毒感染)、自身免疫病；和医学治疗，如放射治疗。本发明还包括检测来自哺乳动物(例如人)的组织标本中α ν β 6的方法，包括使组织标本接触本发明的抗体，如6. 2Α1和6. 2Ε5。本发明还包括杂交瘤6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6· 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、
7.7G5和7. 1C5的细胞；包含编码SEQ ID NOs 19-45和61-64中任何一种的序列的分离的核酸；包含SEQ ID NOs 19-45和61-64中任何一种的氨基酸序列的分离的多肽。本发明的抗体是指完整抗体，例如，含有两条重链和两条轻链的抗体，或者是指完整抗体的抗原结合片段，如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或F(V)片段。本发明的抗体 可以是鼠抗体或其同源物，或者是完整的人抗体。本发明的抗体也可以是人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。本发明的抗体可以是任何同种型和亚型的，如IgA(例如IgAl和IgA2)、IgG(如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。在一些实施方案中，本发明的抗体可以在重链的一个或多个(例如2、3、4、5或6个)特定位点处含有突变(例如缺失、置换或添加)，使得该抗体的效应物功能(例如该抗体结合Fe受体或补体因子的能力)发生改变，而不影响抗体的抗原结合能力。在另外一些实施方案中，本发明的抗体可以在作为糖基化位点的氨基酸残基处含有突变，使得糖基化位点消除。这种抗体可能具有临床上有益的、降低的效应物功能或其它不希望的功能，而保留其抗原结合亲和力。糖基化位点的突变也可能有利于工艺发展(例如蛋白质的表达和纯化)。在另外一些实施方案中，重链或轻链可能含有提高亲和力或效能的突变。几种融合#6和融合#7杂交瘤根据布达佩斯条约保藏已在美国典型培养物保藏中心(ATCC ；Ρ. O. Box 1549，Manassas, VA 20108，USA)。杂交瘤克隆 6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、
6.8G6和 6· 2Β1 于 2001 年8 月 16 日保藏，保藏号分别是ATCC ΡΤΑ-3647、-3648、-3649、-3645和-3646。杂交瘤克隆 6. 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、7. 7G5 和 7. 1C5 在 2001 年 12 月 5 日保藏，保藏号分别是 ATCC PTA-3896、-3897、-3898、-3899 和-3900。见下文表 I。本发明的抗体可用于治疗由α νβ 6与配体(如LAP和纤连蛋白)结合介导的任何临床上不希望的病症或疾病(如此处所述)。由于更高的亲和力或亲合力，以及与配体结合的阳离子依赖性或非依赖性，这些抗体可能比以前所知的α νβ 6抗体更有效。除了本发明的抗体特别是阻断剂的治疗用途之外，非阻断剂类的抗体也能够用于诊断目的，如用于抗原捕获测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组化等。通过下列详述、附图和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。附图简述图IA和IB是显示细胞捕获测定结果的条形图，该试验是测定多种抗ανβ6单克隆抗体(“mAb”)结合β 6转染的FDC-Pl细胞的能力(未转染的细胞作为对照)。图2Α是显示ELISA测定结果的图，该试验是测定多种纯化的抗ανβ6 “融合6”单克隆抗体结合可溶性重组人ανβ6( “hsaj6”)的能力。这些抗体通过用截短的可溶性人ανβ6免疫β6-/-小鼠产生。图例中的数字表示克隆数。相应的克隆名称见表2。
图2B是显示ELISA测定结果的图，该试验是测定多种纯化的抗α νβ 6“融合7”单克隆抗体结合可溶性重组hsaj 6的能力。这些抗体通过用β6转染的NIH 3Τ3细胞(融合#7)免疫β6_/_小鼠产生。图3A-F是显示多种抗α νβ 6单克隆抗体与hs α νβ 6结合的不同阳离子依赖性的图。图4Α和4Β是显示融合#6和融合#7单克隆抗体分别抑制生物素_hs α ν β 6与LAP结合的图。图5A-E是显示本发明的示例性单克隆抗体抑制β 6转染的FDC-Pl细胞与LAP结合的图。图5Α和5Β显示融合#6抗体的结果。图5C-E显示融合#7抗体的结果。图6Α和6Β是显示融合#6和融合#7抗体分别抑制α ν β 6_介导的TGF- β激活的图，其中使用PAI-I萤光素酶报道基因测定监测TGF-β的激活。图7Α显示0 36单克隆抗体6.1八8、6.866(亚克隆六和抝、7.765、6.281、6.369、6. 2Β10 (亚克隆 A 和 B)、6· 2G2、6. 2Α1、6· 4Β4 (亚克隆 A、B 和 C)、7· 10Η2、7· 9Η5、7· 4Α3 (亚克隆A和Β)、7. 1C5(亚克隆A和B)和7. IGlO的重链可变域的氨基酸序列。抗体6. 1A8、6. 8G6和7. 7G5与α νβ6的结合是依赖阳离子的，而抗体6. 2BU6. 2AU6. 3G9.6. 2Β10、
6.4B4、7. 1C5和7. IGlO则是不依赖阳离子的(见下文)。括号中的数字代表氨基酸残基位点。CDR在大框中，而含有斜体氨基酸的小框则代表具体抗体在不同克隆中的多态性。图7Β 显示 α νβ 6 单克隆抗体 6. 1A8、6. 8G6、6. 4Β4、6· 2Α1、7· 1C5、7. 1G10、6. 2B10、
7.7G5、6. 2B1和6. 3G9的轻链可变域的氨基酸序列。图8是一张散布图，显示人乳腺癌和人鳞状癌组织切片中α νβ 6的表达。正常人组织只显不可以忽略的ανβ6表达水平。图9Α和9Β是二次曲线图，显示两种抗α νβ 6抗体6. 8G6和6. 3G9分别对可溶性α νβ6的溶液结合亲和力。图IOA和IOB是两张条形图，证实纯化的单克隆抗体与生物素化的6. 3G9和生物素化的6. 8G6分别竞争结合α ν β 6的能力。

图11是一张条形图，显示在用抗α νβ6单克隆抗体治疗处理的UUO动物的肾脏中，平滑肌肌动蛋白染色的百分比。图12显示根据FACS分析，肿瘤细胞系上α ν β 6的表达(图右侧)，以及单克隆抗体6. 3G9和6· 4Β4对肿瘤细胞系与LAP配体结合的抑制(图左侧)。图13是一张条形图，证实抗0 36单克隆抗体6.369、6.866和6.484对三种肿瘤细胞系与LAP配体结合的抑制。单克隆抗体的结合与不添加试验单克隆抗体的总结合(TB)并与单独BSA对照的非特异性结合(NSB)相比较。图14Α和14Β显示在33天的研究期内，抗α ν β 6单克隆抗体6. 3G9和6. 4Β4分别对皮下植入Detroit 562细胞产生的肿瘤的作用。图15A-C显示抗α νβ 6单克隆抗体对博来霉素诱导的肺纤维化的作用。㈧使用6. 3G9单克隆抗体的抗体治疗在第O天施用博来霉素时开始，监测30天；(B)使用6. 3G9单克隆抗体的抗体治疗在博来霉素治疗15天后开始，监测30天；(C)使用6. 3G9、6. 8G6和6. 4B4单克隆抗体的抗体治疗在博来霉素治疗15天后开始，监测延长的60天。在图15A和15B中，左侧的条图代表yg羟脯氨酸/肺，而右侧的条图显示与盐水处理的小鼠(无博来霉素)相比，羟脯氨酸的增加百分数。在图15C中，该图显示每个肺的羟脯氨酸含量。发明详述本发明表征了对于整联蛋白ανβ6特异的抗体的类和亚类。至少一类抗体(阻断剂)能够阻断α ν β 6与LAP的结合或者阻止TGF- β的激活。以下描述了制备本发明的抗体的多种方法。本领域公知但是在此没有具体描述的方法也包含在发明的范围内。例如，本发明的抗体也能够用噬菌体展示抗体文库鉴定，如 Smith, Science 228 1315-7 (1985);美国专利 5，565，332,5, 733，743,6, 291，650和6，303，313所述。本发明的另外一些抗体能够如下制备将此处鉴定的重链与非相关(noncognate)轻链(例如通过曬菌体展示技术鉴定的轻链)相偶联。
非人杂交瘤抗体本发明的单克隆抗体能够通过众所周知的杂交瘤技术产生。为此，β 6-/_动物(例如小鼠、大鼠或兔)用如下材料免疫纯化的或粗ανβ6制品，用编码αν、β6或这两种抗原的cDNA构建体转染的细胞，组成型表达ανβ6的细胞，等等。可以作为纯化的蛋白质、在细胞上表达的蛋白质、其蛋白质片段或肽，或者作为裸DNA或编码该蛋白质、蛋白质片段或肽的病毒载体递送这些抗原。然后检测免疫动物的血清中抗ανβ6抗体的存在。从检测为阳性的动物中分离B细胞，用这些B细胞制备杂交瘤。筛选杂交瘤分泌的抗体，这是根据它们特异性结合ανβ6(例如结合@6转染的细胞，而不结合未转染的亲本细胞)的能力，和其它任何希望的特征，例如含有希望的CDR共有序列，以低于已知抗ανβ6抗体10D5的IC5tl值抑制(或者对于非阻断剂，不抑制)LAP与α ν β 6的结合，或抑制TGF- β的激活。筛选实验中检测为阳性的杂交瘤细胞于使细胞向培养基内分泌单克隆抗体的条件下在营养培养基中培养。然后收集条件杂交瘤培养上清液，纯化上清液中所含的抗体。另外，希望的抗体也可以通过向未免疫的动物(例如小鼠)的腹腔内注射杂交瘤细胞产生。杂交瘤细胞在腹腔内增殖，分泌抗体，积累为腹水。然后可以用注射器从腹腔中吸出腹水，收集抗体。单克隆抗体也能够如下产生从希望的杂交瘤中分离编码抗体的cDNA，用此cDNA转染哺乳动物宿主细胞(例如CHO或NSO细胞)，培养转染的宿主细胞，从培养基中回收抗体。嵌合抗体本发明的单克隆抗体也能够通过工程构建相关(cognate)杂交瘤(例如鼠、大鼠或兔)抗体产生。例如，可以通过重组DNA技术改变相关抗体，使得重链和/或轻链的部分或全部铰链区和/或恒定区被替换为来自另外一个种(例如人)的抗体的相应成分。通常，工程化抗体的可变域与相关抗体的可变域相同或基本相同。这种工程化抗体被称为嵌合抗体，当对作为铰链区和/或恒定区来源的种(例如人)的个体施用时，抗原性低于相关抗体。制备嵌合抗体的方法在本领域公知。本发明包括的嵌合抗体可包含一个重链可变域和/或一个轻链可变域，重链可变域含有与SEQ ID NOs : 19-36中任何一个相同(或基本相同)的序列，轻链可变域含有与SEQ ID NOs : 37-45中任何一个相同(或基本相同)的序列。优选的人恒定区包括来源于IgGl和IgG4的恒定区。
完全人抗体本发明的单克隆抗体还包括完全人抗体。它们可以用体外免疫(prime)的人脾细胞制备，如Boerner等人，J. Immunol. 147 86-95 (1991)所述,或者用曬菌体展示抗体文库制备，如美国专利6，300，064所述。生产完全人抗体的其它一些方法包括使用含有灭活的内源Ig基因座并且对于未重排的人抗体重链和轻链基因而言是转基因的非人动物。这些转基因动物可以用ανβ6免疫，然后由来源于它们的B细胞制备杂交瘤。这些方法在下列文献中描述，例如关于含有人Ig小基因座的转基因小鼠的多篇GenPharm/Medarex(Palo Alto, CA)公开文本/专利(例如，Lonberg 美国专利 5，789，650);关于 XEMOMICE 的多篇 Abgenix (Fremont, CA)公开文本 / 专利(例如，Kucherlapati 美国专利 6，075，181,6, 150，584 和 6，162，963 ；Green等人，Nature Genetics 7:13-21(1994);和 Mendez 等人，15 (2) 146-56 (1997);和关于“transomic”小鼠的多篇Kirin(日本)公开文本/专利(例如，EP 843961,和Tomizuka等人，Nature Genetics 16:133-1443(1997))。 人源化抗体本发明的单克隆抗体还包括来源于其它种的人源化形式的相关抗α νβ 6抗体。人源化抗体是通过重组DNA技术产生的抗体，其中用抗原结合不需要的人免疫球蛋白轻链或重链的一些或全部氨基酸(例如可变域的恒定区和框架区)置换来自相关非人抗体的轻链和重链的相应氨基酸。例如，针对特定抗原的一种人源化鼠抗体在其重链和轻链上均含有(I)人抗体的恒定区；⑵来自人抗体的可变域的框架区；和(3)来自鼠抗体的CDR。必要时，能够将人框架区中的一个或多个残基改变为鼠抗体相应位点的残基，以保持人源化抗体与抗原的结合亲和力。这种改变有时被称为“回复突变”。人源化抗体在人体中引发免疫反应的可能性通常低于嵌合人抗体，因为前者含有相当少的非人成分。制备人源化抗体的方法在下列文献中描述，例如Winter EP 239400 Jones等人，Nature 321 :522_525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature332 :323_327 (1988);Verhoeyen 等人，Science 239 :1534-1536 (1988) ；Queen 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA86 10029 (1989);美国专利 6，180，370 ；和 Orlandi 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 3833(1989)。鼠(或其它非人)CDR向人抗体上的移植通常如下实现。从杂交瘤中分离编码重链和轻链可变域的cDNA。可变域，包括⑶R的DNA序列通过测序测定。编码⑶R的DNA通过定点诱变转移到人抗体重链或轻链可变域编码序列的相应区。然后添加希望的同种型的人恒定区基因片段(例如对于CH添加Y1，对于CL添加K)。人源化重链和轻链基因在哺乳动物宿主细胞(例如CHO或NSO细胞)中共表达，产生可溶性人源化抗体。为了促进抗体的大规模生产，通常希望在含有抗体表达细胞的生物反应器中生产这些人源化抗体，或者生产在乳汁中表达该抗体的转基因哺乳动物(例如山羊、母牛或绵羊)(参见，例如美国专利 5，827，690)。有时，CDR向人框架的直接转移导致获得的抗体丢失抗原结合亲和力。这是因为在有些相关抗体中，框架区内的某些氨基酸与CDR相互作用，从而影响抗体的总抗原结合亲和力。在这种情况下，为了保留相关抗体的抗原结合活性，在接受抗体的框架区内引入“回复突变”(同上)是很关键的。形成回复突变的普通方法在本领域中公知。例如，Queen等人(同上)，Co等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873(1991)和 W090/07861 (Protein Design LabsInc.)描述了一种包括两个关键步骤的方法。首先，通过计算机分析与相关鼠抗体V区框架的最佳蛋白质序列同源性，选择人V框架区。然后，用计算机模拟鼠V区的三级结构，以显示可能与鼠CDR相互作用的框架氨基酸残基，然后将这些鼠氨基酸残基叠加到同源的人框架上。对于这种两个步骤的方法，有几个标准用来设计人源化抗体。第一个标准是用来自通常与非人供体免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的框架作为人受体，或者使用来自多种人抗体的共有框架。第二个标准是，如果人受体残基异常且供体残基在框架的特定残基处是人序列典型的，则使用供体氨基酸而不是受体氨基酸。第三个标准是在紧邻CDR的位置处使用供体框架氨基酸残基而不是受体氨基酸残基。也可以使用一种不同的方法，如Tempest, Biotechnology 9:266-271(1991)所述。对于这种方法，分别用来源于NEWM和REI重链和轻链的V区框架进行CDR移植，而不根本引入小鼠残基。使用该方法的一个优点是NEWM和REI可变区的三维结构通过X射线
结晶学已知，因此⑶R与V区框架残基的特异性相互作用能够容易地模拟。其它部分本发明的单克隆抗体还可包含用来实现希望的功能的其它部分。例如，这些抗体可以包括毒素部分(例如破伤风类毒素或篤麻毒素)或放射性核素(例如mIn或9°Y),用于杀伤抗体靶向的细胞(参见，例如美国专利6，307，026)。这些抗体可以含有易于分离或检测的部分(例如生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸尾或其它肽标签)。这些抗体也可含有一个能够延长其血清半衰期的部分，例如聚乙二醇(PEG)部分。病情和动物模型本发明的抗体可用于ανβ6介导的疾病的治疗，包括预防。例如，这些抗体通过阻断TGF-β的激活或阻断ανβ6与其它任何配体(如纤连蛋白、玻连蛋白和腱生蛋白)的结合，能够用来治疗纤维化(如肺纤维化、急性肺损伤、肾纤维化、肝纤维化、奥尔波特综合征和硬皮病)。该方法的新颖性包括(I)阻断TGF-β的激活，而不是TGF-β与其受体的结合，⑵能够局部抑制TGF-β (即在ανβ6上调位点处)，而不是全身抑制，(3)抑制ανβ6与配体的结合。除了纤维化疾病以外，本发明的抗体还可用于治疗癌症或癌症转移(包括肿瘤生长和侵袭)，特别是上皮癌。上皮癌的一个亚类是鳞状细胞癌，例如头颈癌、口、乳房、肺、前列腺、子宫颈、咽、结肠、胰腺和卵巢癌。我们使用新的ανβ6单克隆抗体的研究证实ανβ6在多种上皮癌中高表达，特别是在肿瘤的前缘。这些新抗体也能够用于ανβ6介导的其它任何疾病，包括银屑病。本发明的治疗对罹患这些疾病的人和动物对象都有效。本发明适用的动物对象扩展到作为宠物或为了商业目的获得的家畜和牲畜。例子包括狗、猫、牛、马、绵羊、猪和山羊。本发明的抗体的效能可以用不同的动物模型检验。肺纤维化小鼠模型包括博来霉素诱导的(Pittet 等人，J. Clin. Invest. 107(12) 1537-1544(2001);和 Munger 等人，同上)和放射诱导的肺纤维化(Franko等人，Rad. Res. 140 :347_355 (1994))。在博来霉素处理的小鼠中，ανβ6的表达在肺上皮肺泡细胞中增加。但是β6敲除小鼠受到保护，免遭博来霉素诱导的损伤和纤维化。肾纤维化小鼠模型包括C0L4A3-/-小鼠(参见，例如Cosgrove等人，Amer.J. Path. 157 1649-1659 (2000))、具有阿霉素诱导的损伤的小鼠(Wang等人，Kidney International 58 1797-1804(2000) ；Deman 等人，Nephrol Dial Transplant 16: 147-150(2001))、db/db 小鼠(Ziyadeh 等人，PNAS USA 97 =8015-8020 (2000))和单侧输尿管阻塞的小鼠(Fogo等人,Lab Investigation 81 :189A(2001))。在所有这些模型中，小鼠发展为肾损伤和纤维化，能够进展为肾衰竭。对于C0L4A3-/-小鼠、阿霉素处理的小鼠和单侧输尿管阻塞的小鼠，在其肾脏的上行小管和下行小管的上皮层中ανβ6上调。在多种肾损伤模型中，ανβ6的表达也可能增加。
也能够在作为标准体内肿瘤生长和转移模型的这些动物模型中检验抗ανβ6单克隆抗体抑制肿瘤生长、进展和转移的能力。参见，例如，Rockwell等人，J. Natl. Cancer Inst. 49 735(1972) ；Guy 等人，Mol. Cell Biol. 12 954(1992) ；ffyckoff 等人，Cancer Res. 60 =2504(2000);和 Oft 等人，Curr. Biol. 8 :124(1998)。癌症中重要的 ανβ6 配体可能包括与转移有关的TGF-β (综述见Akhurst等人，Trends in Cell Biology 11: S44-S51(2001))、纤连蛋白和玻连蛋白。
本发明的治疗的效能可以用多种可以获得的诊断方法检验，包括身体检查、血液检查、蛋白尿测定、肌酐水平和肌酐清除率、肺功能检查、血浆尿素氮(BUN)水平、瘢痕或纤维化损伤的观察和评分、胞外基质(如胶原蛋白、平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白)的沉积、肾功能检查、超声波、磁共振成像(MRI)和CT扫描。
药物组合物
本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的抗体，或其药学可接受的衍生物， 任选地含有任何一种药学可接受的载体。如此处所用的术语“载体”包括已知的可接受的佐剂和载体。
根据本发明，药物组合物可以是无菌注射制剂的形式，例如无菌注射用水或油悬液。该悬液可以根据本领域公知的技术用适当的分散剂、湿润剂和悬浮剂配制而成。
本发明的药物组合物可以按需要口服、局部、静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、髓内、 关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内或颅内施用，或者只是在炎症或肿瘤生长部位局部施用。本发明的药物组合物也可以通过使用如喷雾器、干粉吸入器或计量剂量吸入器吸入施用。
可有效产生希望的效应的本发明之抗体的剂量和剂量率取决于多种因素，如所治疗的疾病的性质、受试者的体重、治疗目的、使用的具体药物组合物和主治医生的判断。约0.001-约100mg/kg体重每天,例如约0. I-约50mg/kg体重每天的活性成分化合物的剂量水平是有用的。例如，本发明的抗体将以1-14天的间隔，以约0.01mg/kg体重/天到约 20mg/kg体重/天,例如约0. lmg/kg体重/天到约10mg/kg体重/天的剂量施用。在另一个实施方案中，当抗体腹膜内施用时，以约0. 3-lmg/kg体重的剂量施用。在另一个实施方案中，当抗体静脉内施用时，以约在5-12. 5mg/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，抗体组合物以有效产生至少lmg/ml的血浆抗体水平的量施用。
诊断方法
技术领域：
本发明的抗体能够用来诊断与ανβ6表达水平改变有关的疾病。来自受试者的组织标本，如组织活检、体液标本或灌洗液(如肺泡灌洗液)，可以通过使用这些抗体的抗原捕获测定、ELISA、免疫组化测定等来检测。来自正常个体的组织标本作为对照。
除非另外指出，本发明的实施将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白化学和免疫学常规技术，这些技术属于本领域的技能。这些技术在文献中描述。参见，例如《分子克隆实验室指南》，第二版(Sambrook等人编)，1989 ;《寡核苷酸合成》(M. J. Gait编)，1984 ;授予Mullis等人的美国专利4，683，195 ;《核酸杂交》(B. D. Hames 和 S. J. Higgins)，1984 :《转录和翻译》(B. D. Hames 和 S. J. Higgins)，1984 :《动物细胞培养》(R. I. Freshney编)，1987 ;《固定的细胞和酶》，IRL Press, 1986 :《分子克隆实用指南》 (B. Perbal)，1984 ;《酶学方法》，第154和155卷(Wu等人编),Academic Press,纽约；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(J. H. Miller和M. P. Calos编)，1987 ；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Mayer和Walker编)，1987 ；《实验免疫学手册》，第I-IV卷(D. M. Weir 和C. C. Blackwell编)，1986 ;《小鼠胚胎的操作》，1986。
除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。典型的方法与材料在下文中描述，但是与此处所述相似或相当的方法与材料也能够在本发明的实施中使用。此处提到的所有公开文本和其它参考文献在此全文引用作为参考。如果冲突，以本说明书，包括定义，为准。材料、方法和实施例只是说明性的，而非意在限制。在本说明书中，单词“包含”或其时态变化意味着包含所述整体或整体组，但是并不排除其它任何整体或整体组。实施例
下列实施例旨在说明本发明的方法与材料。在抗体领域通常遇到的，本领域技术人员公知的，所述条件和参数的适当修改和改变，在本发明的精神和范围之内。
在下列实施例中，β6-/-小鼠如Huang等人，J. Cell Biol. 133 =921(1996)所述产生。重组人 LAP 购自 R&D Systems (Minneapolis,MN)。抗体 10D5 购自 Chemicon (Temecula, CA)。L230杂交瘤购自ATCC，分泌的抗体通过在固定的蛋白A上亲和层析从饱和培养物的上清液中纯化。抗体的同种型分型用IS0STRIP试剂盒(Roche Diagnostics)根据厂商说明书进行。β 6 转染的 SW480 细胞系如 Weinacker 等人，J. Biol. Chem. 269 =6940-6948 (1994) 所述制备。
实施例I : β 6转染的稳定细胞系的产生
β 6转染的NIH 3Τ3和FDC-P1细胞如下产生用含有全长鼠β 6cDNA和新霉素选择性标记的DNA构建体电穿孔亲本细胞系。稳定转染的细胞如下筛选在含有G418的培养基中传代细胞14天，随后通过荧光激活细胞分选(FACS)分离表达最高水平的表面β6的细胞。转染的FDC-PI细胞在DMEM中培养，其中补充了 4mM L-谷氨酰胺，调节为含有1. 5g/L碳酸氢钠、4. 5g/L葡萄糖和I. OmM丙酮酸钠、10% FBS,2. 5%小鼠IL-3培养添加物和I. 5mg/ ml活性G418。转染的NIH 3T3细胞在补充了 10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和lmg/ml活性G418的DMEM中培养。
实施例2 :可溶性人α ν β 6的纯化
α νβ 6蛋白质基本如上文的Weinacker所述纯化。培养一种表达hs α νβ 6的CHO 细胞系，离心收集获得的上清液。使用抗αν抗体L230通过亲和层析纯化整联蛋白。纯化的L230与CNBr激活的Sepharose 4Β(Sigma)以4. 8mg抗体/ml树脂的比例交联。α νβ 6 上清液以O. 5mg抗体/ml树脂的比例加到L230亲和柱上，用10倍体积的下列每种溶液洗柱(l)50mM Tris-Cl，pH 7· 5，IM NaCl,ImM MgCl2 ；(2) 50mM Tris-Cl,pH 7. 5,50mM NaCl， ImM MgCl2 ;和(3) IOmM Na3PO4, pH 7· 0。hs α νβ 6 用 IOOmM 甘氨酸，pH 2. 5 洗脱到 I : 10 体积的IM Na3PO4, pH 8. O内。蛋白质对磷酸缓冲液(PBS)透析，期间更换几次PBS，贮存于-20 0C ο
实施例3 β 6-/-小鼠的免疫
β 6-/-小鼠通过腹膜内(IP)注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的25 μ g纯化重组人α νβ 6而免疫，其体积比为I : 1，总体积为200 μ I。此外，β 6-/-小鼠也通过IP注射 4Χ106β6转染的NIH 3Τ3细胞而免疫，这些细胞重悬浮于补充了 lmg/ml CaCl2和lmg/ml MgCl^lOOyl PBS中，同一小鼠也在相邻部位注射100 μ I CFA。开始免疫2周和4周后，用相同的试剂类似地加强免疫小鼠，不同之处是使用不完全弗氏佐剂代替CFA。小鼠在最后一次加强7天后采血，根据血清与纯化的重组人α ν β 6或与β 6转染的细胞的结合，测定抗β 6 滴度。对于用纯化的重组人α νβ 6免疫的小鼠，使小鼠休息3个月，用与ImmunEasy (Qiagen) 混合的相同抗原再次免疫。在为了杂交瘤融合分离脾脏前3天，通过IP和静脉内注射，用 12.5yg纯化的重组人ανβ6蛋白免疫小鼠。在融合当天，杀死动物，取出脾脏，制成单细胞悬液。脾细胞通过与可药物选择的细胞融合配偶体融合而成为无限增殖的。
实施例4 :杂交瘤的筛选
通过β6_/_小鼠的免疫产生两组抗体。一组抗体通过用截短的可溶性人 ανβ6(融合#6)免疫产生。另一组抗体通过用鼠β6转染的NIH 3Τ3细胞(融合#7)免疫产生。抗ανβ6抗体的筛选用如下所述的基于细胞的和无细胞的结合和功能测定进行。 阳性克隆的最初筛选是基于与纯化的β6转染的人和鼠细胞的结合(未转染的细胞作为对照)。使选择的克隆扩增，利用细胞捕获试验再次评价终培养物与β 6转染的和未转染的细胞的结合(实施例5b，同上)(图IA和IB显示的代表性实施例，其中省略了 mAb名称的前缀“6. ”或“7. ”，它们分别是指融合6和融合7 ;参见下表2)。某些抗体偏爱结合β 6转染的细胞，而有些与转染的和未转染的细胞都结合，表明只有一个亚类的抗体具有β 6偏好性(图IA和1Β)。进一步的筛选是基于抗体阻断生物素化的hs α νβ 6和β 6转染的鼠细胞与LAP结合的能力。使用FACS亚克隆选择的克隆，冻存到使用前。
根据与ανβ6结合的特异性筛选单克隆抗体，这是基于它们结合β6转染的细胞而不结合未转染的亲本细胞的能力。根据它们不能与表达CtvP1或 a J1的细胞系结合，这些单克隆抗体进一步被证实为α νβ6而不是其它Civ整联蛋白或非特异性整联蛋白(即与含RGD的配体结合的非(^整联蛋白)的特异结合剂。其中包括稳定转染的细胞以及未转染的JY、K562、SW480、NIH 3T3和FDCPl细胞系。
已经由ATCC保藏的其中一些抗体在下面表I中列出。
表I保藏的杂交瘤
权利要求
1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其(a)特异性结合α νβ6 ;和(b)抑制ανβ6与潜伏相关肽的结合，其IC5tl值低于10D5的IC5tl值，其中所述单克隆抗体含有与杂交瘤产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区或其中所述互补决定区具有氨基酸突变使得糖基化位点消除，其中所述杂交瘤选自ATCC保藏号为ΡΤΑ-3647的杂交瘤6. 1Α8、ATCC保藏号为ΡΤΑ-3649的杂交瘤6. 3G9、 ATCC保藏号为ΡΤΑ-3645的杂交瘤6. 8G6、ATCC保藏号为ΡΤΑ-3646的杂交瘤6. 2Β1、ATCC 保藏号为ΡΤΑ-3898的杂交瘤7. 1G10、ATCC保藏号为ΡΤΑ-3899的杂交瘤7. 7G5、ATCC保藏号为PTA-3900的杂交瘤7. 1C5。
2.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3647的杂交瘤6.1A8产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
3.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3649的杂交瘤6.3G9产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
4.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3645的杂交瘤6.8G6产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
5.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3646的杂交瘤6.2B1产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
6.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3898的杂交瘤7.IGlO产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
7.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3899的杂交瘤7.7G5产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
8.权利要求I的抗体，其中该抗体含有与ATCC保藏号为PTA-3900的杂交瘤7.1C5产生的抗体相同的重链和轻链互补决定区。
9.权利要求I的抗体，其中抗体与ανβ6的结合依赖于二价阳离子。
10.权利要求9的抗体，其中二价阳离子是Ca2+、Mg2+或Mn2+。
11.权利要求I的抗体，其中抗体与ανβ6的结合不依赖于二价阳离子。
12.—种抗ανβ6抗体，选自a)其重链互补决定区1、2和3分别由SEQID NOs :1、4和7的序列组成，其轻链互补决定区1、2和3分别由SEQ ID NOs :10、13和15的序列组成的抗体；b)其重链互补决定区1、2和3分别由SEQID NOs :3、5和8的序列组成，其轻链互补决定区1、2和3分别由SEQ ID NOs :11、14和17的序列组成的抗体；c)其重链互补决定区1、2和3分别由SEQID NOs :3、6和9的序列组成，其轻链互补决定区1、2和3分别由SEQ ID NOs :12、14和18的序列组成的抗体；d)其重链互补决定区1、2和3分别由SEQID NOs :2、46和47的序列组成，其轻链互补决定区分别由SEQ ID NOs :48、13和16的序列组成的抗体；e)其重链互补决定区1、2和3分别由SEQID NOs :49、51和53的序列组成，其轻链互补决定区1、2和3分别由SEQ ID NOs :55、57和59的序列组成的抗体；和f)其重链互补决定区1、2和3分别由SEQID NOs :50、52和54的序列组成，其轻链互补决定区1、2和3分别由SEQ ID NOs :56、58和60的序列组成的抗体。
13.—种抗ανβ6抗体，其含有选自如下序列的重链可变域序列和轻链可变域序列(a)SEQ ID NO 19的重链可变域序列和SEQ ID NO 37的轻链可变域序列；(b)SEQ ID NO 20或21的重链可变域序列和SEQ ID NO 38的轻链可变域序列；(c)SEQ ID NO 22的重链可变域序列和SEQ ID NO 43的轻链可变域序列；(d)SEQ ID NO 23的重链可变域序列和SEQ ID NO 44的轻链可变域序列；(e)SEQ ID NO 24的重链可变域序列和SEQ ID NO 45的轻链可变域序列；(f)SEQ ID NO 25或26的重链可变域序列和SEQ ID NO 42的轻链可变域序列；(g)SEQ ID NO :27、28或29的重链可变域序列和SEQ ID NO 39的轻链可变域序列；(h)SEQ ID NO 34或35的重链可变域序列和SEQ ID NO 40的轻链可变域序列；(i)SEQID NO 36的重链可变域序列和SEQ ID NO 41的轻链可变域序列；(j) SEQ ID NO 61的重链可变域序列和SEQ ID NO 63的轻链可变域序列；和 (k) SEQ ID NO 62的重链可变域序列和SEQ ID NO 64的轻链可变域序列。
14.一种组合物，其含有权利要求1-13中任何一项的抗体，和药学可接受的载体。
15.权利要求14的组合物，其中所述抗体与细胞毒性剂偶联。
16.权利要求14的组合物，其中所述抗体是依赖阳离子的抗体。
17.一种检测哺乳动物组织标本中的a v 0 6的方法，包括使组织标本接触权利要求1的 抗体。
18.保藏号为ATCCPTA-3647的杂交瘤细胞6. 1A8。
19.保藏号为ATCCPTA-3648杂交瘤细胞6. 2B10。
20.保藏号为ATCCPTA-3649杂交瘤细胞6. 3G9。
21.保藏号为ATCCPTA-3645杂交瘤细胞6. 8G6。
22.保藏号为ATCCPTA-3646杂交瘤细胞6. 2B1。
23.保藏号为ATCCPTA-3896杂交瘤细胞6. 2A1。
24.保藏号为ATCCPTA-3897杂交瘤细胞6. 2E5。
25.保藏号为ATCCPTA-3898杂交瘤细胞7. 1G10。
26.保藏号为ATCCPTA-3899杂交瘤细胞7. 7G5。
27.保藏号为ATCCPTA-3900杂交瘤细胞7. 1C5。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及抗αvβ6抗体。
文档编号C12N15/09GK102924598SQ20121006722
公开日2013年2月13日 申请日期2003年3月13日 优先权日2002年3月13日
发明者S·M·维欧雷特, P·H·维尼尔博, K·J·西蒙, D·舍帕德, D·R·利昂 申请人:拜奥根Idec马萨诸塞公司, 加利福尼亚大学董事会