专利名称：一种重组菌株发酵生产还原性辅酶q10的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法。
背景技术：
还原性辅酶QlO是ー种有效的抗氧化剂，其用途十分广泛，发达国家除药品外已广泛用于食品添加、日化产品、保健品、化妆品等领域。它的药效众多，临床已证实具有消除疲劳、增强体力、抗衰老、免疫调节作用、抗肿瘤作用、缓节帕金森氏症、治疗和缓解神经性 头痛以及降低阿霉素或他汀类药物副作用等之功效。还原性辅酶QlO和氧化性辅酶QlO是人体细胞中的线粒体电子传导系统的构成因子，在氧化磷酸化反应中起到搬运电子的功能，參与ATP的生成。以往大多数人都把氧化性辅酶QlO和还原性辅酶QlO混为ー谈，其实还原性辅酶QlO才是真正具有生物活性的抗氧化体。氧化性必需转换成还原性的CoQlO后才具有抗氧化能力。还原性辅酶QlO可以直接被人体利用，与氧化性辅酶QlO相比在人的新陈代谢中具有更高的生物利用率。近年来对还原性辅酶QlO的研究逐渐增多，目前其制作方法大致如下通过在DMEM-I培养液中进行细胞培养，获得含有还原性辅酶QlO的细胞液[1]，此方法生产的辅酶QlO成本较高，含量也相对较低。采用化学合成法，但其合成过程烦杂、危险，生产成本高，而且可靠性不高-必须最大限度地降低产生或混入异构体[2]。使用天然生物酶转化法生产。有专利报道，利用生物还原酶将氧化性辅酶QlO还原成还原性辅酶Q10，但这种方法要求使用纯度大于99%的氧化性辅酶Q10[3]。另有报道，将辅酶QlO先磷酸化，再通过生物还原酶还原磷酸化的氧化性辅酶Q10，从而得到还原性辅SIqiom0在抗氧化条件下生产。采用氯化钙-镁-水(醇)还原体系，将氧化性辅酶QlO快速制备成还原性辅酶Q10[5]。在还原过程中使用至少ー种选自烃、脂肪酸酷、醚和腈的溶剂保护还原性辅酶QlO免受氧化作用[6]。这些方法效率低，含有较多的氧化性辅酶Q10，用已知的方法分离，回收还原辅酶QlO的成本很高。另外还有利用微生物发酵法生产还原性辅酶QlO的有关报道，筛选产还原性辅酶QlO微生物，得到含有70%以上摩尔含量的还原性菌株，然后利用化学诱变方法提高其产量。但是化学诱变法提高产量有限，且多次诱变才能达到一定效果，耗费大量时间和精力利用基因工程理论改变细胞内代谢调节机制也是获得高产菌种的ー个重要方法。通过基因重组提高氧化性辅酶QlO产量的成功例子不在少数。Cheong等M将聚十异戊ニ烯焦磷酸(DPS)基因和I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入载体pGPRXll中，通过质粒转化入Agrobacterium tumefaciensBNQ-pGPRXlI- (KCCM-10554)中表达，得到氧化性辅酶QlO的高产菌，通过发酵エ艺优化后产率达到6. 69mg/g，エ业化生产前景较好。
如上所述，目前尚无通过基因重组得到还原性辅酶QlO高产菌株的例子，更无利用重组还原性菌株进行エ业规模发酵还原性辅酶QlO的报道。如果筛选到还原性辅酶QlO菌株，采用基因重组技术提高其生产能力，无疑对生产还原性辅酶Qio是非常有利的。本发明利用分子生物学技术找到还原性辅酶QlO生产菌株的关键酶基因，通过重组DNA技术筛选带有目标基因的细胞，将目的基因引入生产菌株(如酵母菌等)，增强合成目的产物的能力，构建还原性辅酶QlO发酵重组菌株。利用重组菌株发酵生产还原性辅酶Q10，在从发酵物中回收还原性辅酶Q10，从而安全、高效地获得エ业规模生产还原性性辅酶QlO的方法。本发明利用高比例还原性菌株(还原性辅酶QlO占70% (摩尔含量)以上)，如Rhodotorula glutinis IF01125、Saitoella complicate IF010748 扩增生产还原性辅酶QlO的关键基因如2，3_ ニ甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因、聚十异戊ニ烯 焦磷酸(DPS)基因、I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，通过将带有目的基因的质粒转化至突变株中，随着细胞中合成酶基因拷贝数的増加，可积累较大量的产物。即找出辅酶QlO合成过程中的关键酶基因，通过其强化表达就有可能提高产物的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法，提高发酵生产还原性辅酶QlO的产量。本发明的目的还在于提供ー种生产还原性辅酶QlO的重组菌株。ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法，将生产还原性辅酶QlO的基因转入还原性辅酶QlO比率达到70%以上的菌株，然后采用诱变技木，筛选还原性辅酶QlO比率达到90%以上的菌株，以还原性辅酶QlO比率达到90%以上的菌株为菌种，发酵生产还原性辅酶QlO ;所述还原性辅酶QlO比率是指还原性辅酶QlO占氧化性辅酶QlO和还原性辅酶QlO总和的摩尔百分比。所述生产还原性辅酶QlO的基因为2，3- ニ甲氧基-5-甲基_6_癸异戊烯基苯醌合成酶基因、聚十异戊ニ烯焦磷酸基因、I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因中的ー种或一种以上。所述还原性辅酶QlO比率达到70 %以上的菌株为Saitoellacomplicata (IF010748)> Rhodotorula glutinis(IF0 1125)、Agrobacteriumtumefacience (IFO 13263) > Agrobacterium radiobacter (ATCC47 I 8)、Aspergillus clavatus(JCM1718)、Acetobacter xylinum(IF015237)、Aminobacteraganouensis(JCM7854)、Agromonas oligotrophica(JCM1494)、Acidiphiliummultivorum(JCM8867)>Bulleromyces albus(IF01192)或Bullera armeniaca(IF010112)。所述诱变技术为化学试剂诱变、紫外线照射或离子光束照射。所述化学试剂诱变中的化学试剂为亚硝基胍、甲基磺酸こ酷、硫酸ニこ酯或6-溴尿嘧啶。ー种生产还原性辅酶QlO的重组菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC NO. 5668。本发明的重组菌株Rhodotorula glutinis已于2011年12月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO. 5668保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。本发明的有益效果本发明是微生物发酵法，与其它制备方法相比，生产辅酶QlO具有不受原料限制，原料成本低，分离过程相对简単，不存在手性问题，易控制及可实现大规模生产的优点，另外，随着生活水平的提高，人们对纯天然产品的崇尚日益増加，化学合成药物已越来越不受欢迎。本发明的诱变技术可以提高辅酶QlO产量，但单次诱变提高的产量有限，且诱变不确定因素较多，使得筛选工作量巨大，多次诱变能达到一定效果，这样更是耗费大量时间和精力，基因重组是高产菌株的定向突变途径，通过基因工程组建的高产菌株，再结合诱变进ー步提高基因重组菌株的产能，能满足エ业化生产的要求。
图I为辅酶QlO的峰面积标准曲线。图2为还原性辅酶QlO和氧化性辅酶QlO的HPLC检测图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步说明。实施例II、Rhodotorula glutinis (IF0 1125)的基因重组操作步骤如下(I)克隆 Rhodotorula glutinis (IF0 1125) l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (dxslI)gene 和 decaprenyl diphosphate synthase (dps44)gene。(2)设计两对引物加入酶切位点 BamHI 和 XhoI DXS up :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，， DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3’，DPSup : 5 ’-TTTGGATCCTTGCCGCGCAAGGCGTCA-3， DPSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGTTGAGACGCTCGAT-3，。(3)抽提 Rhodotorula glutinis (IFO 1125)基因组 DNA，通过 PCR 的方法扩增出DXS和DPS基因。(4) DXS和DPS基因末端加A后与T载体进行连接，转化DH5a，挑克隆摇菌抽提质粒获得正确的重组质粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上两个基因片段。(5)用同样的限制性内切酶BamHI和XhoI酶切原核表达载体PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切产物后用T4连接酶将DXS和DPS两个基因片段分别与载体连接。(6)将连接产物分两次转化Rhodotorula glutinis (IFO 1125),通过氨节青霉素和卡那霉素抗性筛选后获得DXS和DPS表达的重组菌株。2、重组高产菌株的诱变改良采用亚硝基胍(NTG)化学诱变剂，菌种在28°C，有氧培养48h，离心得到菌体，添加PH7. O磷酸缓冲液，再加入NTG并使其浓度达到200ug/mL，25°C静置lh。再次离心后，将菌体用O. 9%的生理盐水冲洗5次，再用O. 9%的生理盐水悬浮。稀释悬浮液，涂布于抗性平板和对照平板上，培养3d-5d。诱变之后，为快速筛选高产突变株，采用抗阿霉素和维生素K3的突变株，筛选具有较高还原性辅酶QlO生产能力的菌株(还原性辅酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培养方法和测定方法来评价生产还原性辅酶QlO的能力
菌体培养种子培养基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。发酵培养基(葡萄糖15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g、MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培养方法为将I环生长良好的斜面种子接入装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，28V，200r/min往复摇床培养24h (细菌)或48h (酵母)，然后取8mL种子液加入装有IOOmL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于28°C，200r/min往复摇床培养96h。提取检测4500r/min离心30min,收集菌体,将得到的菌体用constant system的高压细胞破碎仪(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎压カ下破碎2次，调制菌体破碎液。加入异丙 醇和η-己烷，在40°C温度下搅拌30分钟，提取完后，静置10分钟，将上层分离，然后取上清液，旋蒸至干，5ml无水こ醇溶解，放置4°C过夜，过滤后待测。HPLC检测含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移动相甲醇/こ醇=I I流速lml/min检出UV275nm柱温35°C进样20μ I持续时间还原性辅酶QlO 17. 5分钟氧化性辅酶QlO 27. 91分钟上述方法中辅酶QlO的峰面积标准曲线如图I所示，根据上述标准曲线测得一株高辅酶QlO产量和高还原性辅酶QlO比率的菌株，该菌株酶QlO产量为33. 71mg/g菌液，还原性辅酶QlO比率为93%，还原性辅酶QlO和氧化性辅酶QlO的HPLC检测结果如图2所
/Jn ο本实施例的重组菌株Rhodotorula glutinis已于2011年12月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO. 5668保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。实施例2I、Agrobacterium radiobacter(ATCC4718)的基因重组操作步骤如下(I)克隆 Agrobacterium radiobacter (ATCC4718) l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(dxs)gene 和 l-Deoxy-D-xylulose-D-phospnate reductoisomerase(dxr)gene o(2)设计两对引物加入酶切位点 BamHI 和 XhoI DXSup :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，, DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3，, DXRup 5，-TTTGGATCCATGACGAATGCCAGTGAA-3， DXRdown 5，-TTTCTCGAGTCACGCGGCCTTTTCTTT-3，。(3)抽提 Agrobacterium radiobacter (ATCC4718)基因组 DNA,通过 PCR 的方法扩增出DXS和DXR基因。(4) DXS和DXR基因末端加A后与T载体进行连接，转化DH5a，挑克隆摇菌抽提质粒获得正确的重组质粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上两个基因片段。
(5)用同样的限制性内切酶BamHI和XhoI酶切原核表达载体PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切产物后用T4连接酶将DXS和DXR两个基因片段分别与载体连接。(6)将连接产物分两次转化Agrobacterium radiobacter (ATCC4718),通过氨节青霉素和卡那霉素抗性筛选后获得DSX和DPS表达的重组菌株。2、重组高产菌株的诱变改良采用亚硝基胍(NTG)化学诱变剂，菌种在28°C，有氧培养48h，离心得到菌体，添加PH7. O磷酸缓冲液，再加入NTG并使其浓度达到200ug/mL，25°C静置lh。再次离心后，将菌体用O. 9%的生理盐水冲洗5次，再用O. 9%的生理盐水悬浮。稀释悬浮液，涂布于抗性平板和对照平板上，培养3d-5d。诱变之后，为快速筛选高产突变株，采用抗阿 霉素和维生素K3的突变株，筛选具有较高还原性辅酶QlO生产能力的菌株(还原性辅酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培养方法和测定方法来评价生产还原性辅酶QlO的能力菌体培养种子培养基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。发酵培养基(葡萄糖1如、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g,MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培养方法为将I环生长良好的斜面种子接入装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，28V，200r/min往复摇床培养24h (细菌)或48h (酵母)，然后取8mL种子液加入装有IOOmL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于28°C，200r/min往复摇床培养96h。提取检测4500r/min离心30min,收集菌体,将得到的菌体用constant system的高压细胞破碎仪(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎压カ下破碎2次，调制菌体破碎液。加入异丙醇和η-己烷，在40°C温度下搅拌30分钟，提取完后，静置10分钟，将上层分离，然后取上清液，旋蒸至干，5ml无水こ醇溶解，放置4°C过夜，过滤后待测。HPLC检测含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移动相甲醇/こ醇=I I流速lml/min检出UV275nm柱温35°C进样20μ I持续时间还原性辅酶QlO 17. 5分钟氧化性辅酶QlO 27. 91分钟上述方法中辅酶QlO的峰面积标准曲线如图I所示，根据上述标准曲线测得一株高辅酶QlO产量和高还原性辅酶QlO比率的菌株，该菌株酶QlO产量为30. llmg/g菌液，还原性辅酶QlO比率为91%。实施例3I、Rhodotorula glutinis (IFO 1125)的基因重组操作步骤如下(I)克隆 Rhodotorula glutinis(IFO 1125)l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(dxs)gene、 decaprenyl diphosphate synthase(dps)gene 和l-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase(dxr)gene。(2)设计三对引物加入酶切位点 BamHI 和 XhoI DXS up :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，， DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3’，DPSup : 5 ’-TTTGGATCCTTGCCGCGCAAGGCGTCA-3， DPSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGTTGAGACGCTCGAT-3，, DXRup 5，-TTTGGATCCATGACGAATGCCAGTGAA-3， DXRdown 5，-TTTCTCGAGTCACGCGGCCTTTTCTTT-3，
o(3)抽提 Rhodotorula glutinis (IFO 1125)基因组 DNA，通过 PCR 的方法扩增出DXS、DPS 和 DXR 基因。(4) DXS、DPS和DXR基因末端加A后与T载体进行连接，转化DH5a，挑克隆摇菌抽提质粒获得正确的重组质粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上两个基因片段。(5)用同样的限制性内切酶BamHI和XhoI酶切原核表达载体PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切产物后用T4连接酶将DXS和DXR两个基因片段连入载体PET_24_a，DPS基因片段与载体PGEX-6P-1连接。(6)将连接产物分三次转化Rhodotorula glutinis (IFO 1125),通过氨节青霉素和卡那霉素抗性筛选后获得DXS、DXR和DPS表达的重组菌株。2、重组高产菌株的诱变改良采用亚硝基胍(NTG)化学诱变剂，菌种在28°C，有氧培养48h，离心得到菌体，添加PH7. O磷酸缓冲液，再加入NTG并使其浓度达到200ug/mL，25°C静置lh。再次离心后，将菌体用O. 9%的生理盐水冲洗5次，再用O. 9%的生理盐水悬浮。稀释悬浮液，涂布于抗性平板和对照平板上，培养3d-5d。诱变之后，为快速筛选高产突变株，采用抗阿霉素和维生素K3的突变株，筛选具有较高还原性辅酶QlO生产能力的菌株(还原性辅酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培养方法和测定方法来评价生产还原性辅酶QlO的能力菌体培养
种子培养基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。发酵培养基(葡萄糖1如、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g,MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培养方法为将I环生长良好的斜面种子接入装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，28V，200r/min往复摇床培养24h (细菌)或48h (酵母)，然后取8mL种子液加入装有IOOmL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于28°C，200r/min往复摇床培养96h。提取检测4500r/min离心30min,收集菌体,将得到的菌体用constant system的高压细胞破碎仪(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎压カ下破碎2次，调制菌体破碎液。加入异丙醇和η-己烷，在40°C温度下搅拌30分钟，提取完后，静置10分钟，将上层分离，然后取上清液，旋蒸至干，5ml无水こ醇溶解，放置4°C过夜，过滤后待测。HPLC检测含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移动相甲醇/こ醇=I I流速lml/min
检出UV275nm柱温35°C进样20μ I持续时间还原性辅酶QlO 17. 5分钟氧化性辅酶QlO 27. 91分钟上述方法中辅酶QlO的峰面积标准曲线如图I所示，根据上述标准曲线测得一株高辅酶QlO产量和高还原性辅酶QlO比率的菌株，该菌株酶QlO产量为38. 51mg/g菌液，还原性辅酶QlO比率为95%，
參考文献[I] 一种还原性辅酶 QlO 的生产方法.[P]· CN200910201918，2011/02/09[2]Biomedical and clinical aspects of coenzyme· 3卷· 19项-30项(页)1981[O 川][3]还原性辅酶 QlO 的制备方法.[P], CN10143497L2009. 05. 20[4]还原性辅酶 QlO 的制备方法· [P], CN101307338. 2008. 11. 19[5] 一种还原性辅酶 QlO 的制备方法· [P], CN101514148. 2009. 08. 26[6]利用防氧化效果高的溶剂生产还原性辅酶QlO的方法.[P]CN02814136. 9[7]Processes for producing coenzyme Q10. [P]. US2005/0069996A1. 2005. 3. 31[8]Fermentation process for preparing coenzyme QlO by the recomomantAgrobacterium tumefaciens. [P]. US20050181490,2005. 8. 18.
权利要求
1.ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法，其特征在于，将生产还原性辅酶QlO的基因转入还原性辅酶QlO比率达到70%以上的菌株，然后采用诱变技木，筛选还原性辅酶QlO比率达到90%以上的菌株，以还原性辅酶QlO比率达到90%以上的菌株为菌种，发酵生产还原性辅酶QlO ;所述还原性辅酶QlO比率是指还原性辅酶QlO占氧化性辅酶QlO和还原性辅酶QlO总和的摩尔百分比。
2.根据权利要求I所述ー种重组菌株发酵 生产还原性辅酶QlO的方法，其特征在于，所述生产还原性辅酶QlO的基因为2，3- ニ甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因、聚十异戊ニ烯焦磷酸基因、I-脱氧D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因中的ー种或ー种以上。
3.根据权利要求I所述ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法，其特征在干，所述还原性辅酶QlO比率达到70%以上的菌株为Saitoella complicata、Rhodotorulaglutinis、Agrobacterium tumefacience、Agrobacterium radiobacter、Aspergillusclavatus、Acetobacter xylinum、Aminobacter aganouensis、Agromonas oligotrophica、Acidiphilium multivorum、Bulleromyces albus 或 Bullera armeniaca。
4.根据权利要求I所述ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法，其特征在于，所述诱变技术为化学试剂诱变、紫外线照射或离子光束照射。
5.根据权利要求4所述ー种重组菌株发酵生产还原性辅酶QlO的方法，其特征在于，所述化学试剂诱变中的化学试剂为亚硝基胍、甲基磺酸こ酷、硫酸ニこ酯或6-溴尿嘧啶。
6.ー种生产还原性辅酶QlO的重组菌株，其特征在于，该菌株的保藏编号为CGMCCNO. 5668。
全文摘要
本发明公开了属于分子生物学技术领域的一种重组菌株发酵生产还原性辅酶Q10的方法。该方法是将生产还原性辅酶Q10的基因转入还原性辅酶Q10比率达到70％以上的菌株，然后采用诱变技术，筛选还原性辅酶Q10比率达到90％以上的菌株，以还原性辅酶Q10比率达到90％以上的菌株为菌种，发酵生产还原性辅酶Q10。本发明通过基因工程组建的高产菌株，再结合诱变进一步提高基因重组菌株的产能，能满足工业化生产的要求。
文档编号C12R1/01GK102676595SQ20121006732
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者党珍, 李明, 糜军 申请人:苏州海吉亚生物科技有限公司