专利名称：志贺氏菌的培养方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种微生物培养方法。
背景技术：
志贺氏菌(Shigella)是目前致肠道感染的主要病原菌之一，属于肠杆菌科的志贺氏菌(Shigella)属，又称痢疾杆菌，为革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧。人类对痢疾杆菌有很高的易感性，幼儿可引起急性中毒，死亡率甚高。临床上通常表现腹部痉挛痛、腹泻和发热，患者将不能从事饮食业、炊事及保育等工作。目前在我国志贺氏菌的检测及确认的方法为《GB/T4789. 5-2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》，检验步骤有(I)增菌无菌操作将待检样品放入GN增菌液中，置37°C培养6小时 8小时。(2)分离取⑴增菌液I环划线接种于SS琼脂平板或HE琼脂平板，于37°C培养18小时 24小时。志贺氏菌在在这些琼脂平板上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。(3)生化试验和血清学鉴定从平板上要求挑选不少于5个 8个可疑菌落，进行生化鉴定和血清凝集试验。⑷结果报告根据选择性分离平板、生化试验和血清学鉴定结果，报告样品中检出或未检出志贺氏菌。由于志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌有较高的同源性，在麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板上都能生长，且侵袭性大肠杆菌菌落大，增长速度快，经常会覆盖菌落小并透明的志贺氏菌菌落，导致难以挑取可疑的志贺氏菌菌落，造成低浓度志贺氏菌漏检和误判的结果O
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种志贺氏菌培养方法，解决现有技术中志贺氏菌一般培养方法造成志贺氏菌漏检或误判的技术问题。本发明是这样实现的，一种志贺氏菌培养方法，包括如下步骤将硝酸纤维素膜用志贺氏菌抗血清处理一次以上，晾干后再用质量百分数为 1% I. 5%的硫代硫酸钠处理，晾干，得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素将所述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜加入至含志贺氏菌的悬浮液中，于36. 8 37. 2°C条件下放置30 35分钟，得到含志贺氏菌的硝酸纤维素膜；将所述含志贺氏菌的硝酸纤维素膜用磷酸缓冲液洗涤；
将所述用磷酸盐缓冲液洗涤后的硝酸纤维素膜涂板于培养基，在36. 8 37. 2°C 条件下培养18 24小时。本发明志贺氏菌培养方法，通过使用含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜，根据抗原抗体反应的特异性，硝酸纤维素膜中志贺氏菌抗血清与样本中的志贺氏菌特异结合，硫代硫酸钠能防止其他的细菌在膜条上的生长，通过洗涤将其他细菌洗脱，将吸附有较纯浓度志贺氏菌的硝酸纤维素膜条接种于培养基并进行培养，减少了其他细菌，特别是侵袭性大肠菌落对志贺氏菌菌落的影响，保证样本中低浓度志贺氏菌不出现漏检，从而提高志贺菌的检出率。
图I是本发明实施例志贺氏菌培养方法得到的SS琼脂平板菌落图；图2是对比例志贺氏菌培养方法得到的SS琼脂平板菌落图；图3是本发明实施例含硝酸纤维素膜的搅拌示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种志贺氏菌培养方法，包括如下步骤步骤SOI，制备含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜将硝酸纤维素膜用志贺氏菌抗血清处理一次以上，晾干后再用质量百分数为 I % I. 5 %的硫代硫酸钠处理，晾干，得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素步骤S02，制备含志贺氏菌的硝酸纤维素膜将所述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜加入至含志贺氏菌的悬浮液中，于36. 8 37. 2°C条件下放置30 35分钟，得到含志贺氏菌的硝酸纤维素膜；步骤S03，洗涤上述含志贺氏菌的硝酸纤维素膜将所述含志贺氏菌的硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤；步骤S04，培养志贺氏菌将所述用磷酸盐缓冲液洗涤后的硝酸纤维素膜涂板于培养基，在36. 8 37. 2°C 条件下培养18 24小时。步骤SOl之前，还包括硝酸纤维素膜的预处理步骤在SM31-25胶版的一端，贴上带有“MAX箭头”的膜条；然后在SM31-25胶版的另一端贴上硝酸纤维素膜；然后将贴有“MAX箭头”和硝酸纤维素膜的搅拌剪切成面积为4 Scm2的膜条。请参阅图3，图3显示硝酸纤维素膜预处理后得到的膜条，在SM31-25胶版上，包括MAX箭头I 和硝酸纤维素膜2。具体地，步骤SOl中，所述将硝酸纤维素膜用志贺氏菌抗血清处理的步骤具体为向硝酸纤维素膜上滴加志贺氏菌抗血清，晾干，再向硝酸纤维素膜上滴加志贺氏菌抗血清，晾干，使志贺氏菌抗血清对硝酸纤维素膜进行处理(浸溃)，志贺氏菌抗血清晾干以后，和硝酸纤维素膜紧密结合，实现志贺氏菌抗血清在硝酸纤维素膜上存留。步骤SOl中，该志贺氏菌抗血清用量为10 15ul，每次处理硝酸纤维素膜时志贺氏菌抗血清的用量没有限制，能富集至少104cfu/ml的志贺氏菌。用志贺氏菌抗血清处理完硝酸纤维素膜后，晾干，再用质量百分数为1% I. 5% 的硫代硫酸钠处理该志贺氏菌抗血清处理后的硝酸纤维素膜(浸溃)，硫代硫酸钠的用量没有限制，优选为10 15ul (能抑制部分大肠杆菌的生长)，硫代硫酸钠处理完以后，晾干， 使硫代硫酸钠硝酸纤维素膜紧密结合，实现硫代硫酸钠在硝酸纤维素膜上存留。步骤S02 中，首先制备含志贺氏菌的悬浮液，方法没有限制，例如I、在无菌操作条件下，将含有志贺氏菌的样品(肛拭子，普通医院体检科能得到) 加入至GN增菌液中，置36°C培养6小时 8小时；2、取Iml上述I步骤之后的液体，在3500rpm条件下离心2分钟，去除上清液，加入Iml磷酸盐缓冲液悬浮，即得到含志贺氏菌的悬浮液；得到含志贺氏菌的悬浮液后，将步骤SOl所得到的含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜加入至含志贺氏菌的悬浮液中，于36. 8 37. 2°C条件下放置30 35分钟，通过志贺氏菌和硝酸纤维素膜上的志贺氏菌抗血清的抗原抗体反应，使志贺氏菌附着于硝酸纤维素膜上，得到含志贺氏菌的硝酸纤维素膜。具体地，步骤S03中，将步骤S02所得到的含志贺氏菌的硝酸纤维素膜转移至含有磷酸盐缓冲液(PBS)的离心管中，放置2 3分钟，进行第一次洗涤；由于硝酸纤维素膜上的硫代硫酸钠会阻止步骤S02中的含志贺氏菌的悬浮液中的其他细菌在硝酸纤维素膜上生长，经过步骤S03用磷酸盐缓冲液洗涤，使得硝酸纤维素膜上的志贺氏菌以外的其他菌被洗脱；上次洗涤步骤完成后，再次将经过洗涤后的含志贺氏菌的硝酸纤维素膜放入至另一含磷酸盐缓冲液的离心管中，放置2 3分钟，进行第二次洗涤，使得硝酸纤维素膜上的非志贺氏菌被洗脱干净。具体地，步骤S04中，将经过步骤S03洗涤后的含志贺氏菌的硝酸纤维素膜涂板与培养基中，该培养基为SS平板或HE琼脂平板，然后在36. 8 37. 2°C条件下培养18 24 小时，即完成志贺氏菌的培养。本步骤涂板时，将贴有“MAX箭头”膜条的一端折成90°左右，便于操作，贴有硝酸纤维素膜的一端与琼脂平板充分接触，每平板涂I 2次，然后用接种环将其划开。进一步，步骤S04完成后，还包括检测步骤从志贺氏菌培养平板上挑选不少于5个 8个可疑菌落，进行生化鉴定和血清凝集试验。本发明志贺氏菌培养方法，通过使用含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜，根据抗原抗体反应的特异性，硝酸纤维素膜中志贺氏菌抗血清与样本中的志贺氏菌特异结合，硫代硫酸钠能防止其他的细菌在膜条上的生长，通过洗涤将其他细菌洗脱，将吸附有较纯浓度志贺氏菌膜条接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板，减少了其他细菌，特别是侵袭性大肠菌落对志贺氏菌菌落的影响，保证样本中低浓度志贺氏菌不出现漏检,从而提高志贺菌的检出率。
以下结合具体实施例对上述志贺氏菌培养方法进行详细阐述。实施例一本发明实施例志贺氏菌培养方法包括如下步骤a)将“MAX箭头”膜条贴在SM31-25胶板一端，另一端贴硝酸纤维素膜；b)将上述胶版切成8cmX0. 5cm的大小；c)在贴有硝酸纤维素膜的一端滴加5ul志贺氏菌抗血清，室温晾干后再加入5ul 志贺氏菌抗血清，室温晾干后滴加I %硫代硫酸钠溶液10ul，晾干得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜，加入干燥剂封好，备用；d)待检样本加入GN增菌液中，置37°C培养6小时；e)取上述GN增菌液3500rpm离心2min,去除上清,加入ImL的磷酸盐缓冲液悬浮, 得到含志贺氏菌的悬浮液，将上述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜上贴有硝酸纤维素膜的一端侵入含志贺氏菌抗血清的悬浮液中37°C放置30min，将膜条转移至含有Iml磷酸盐缓冲液溶液的离心管中，放置2 3min，重复洗涤I次，将膜条涂板于SS平板，于36°C培养18小时。实施例二本发明实施例志贺氏菌培养方法包括如下步骤a)将“MAX箭头”膜条贴在SM31-25胶板一端，另一端贴硝酸纤维素膜；b)将上述胶版切成8cmX Icm的大小；c)在贴有硝酸纤维素膜的一端滴加7ul志贺氏菌抗血清，室温晾干后再加入5ul 志贺氏菌抗血清，室温晾干后滴加I. 5%硫代硫酸钠溶液15ul，晾干得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜，加入干燥剂封好，备用；d)待检样本加入GN增菌液中，置37. 2°C培养8小时；e)取上述GN增菌液3500rpm离心2min,去除上清,加入ImL的磷酸盐缓冲液悬浮，得到含志贺氏菌的悬浮液，将上述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜上贴有硝酸纤维素膜的一端侵入含志贺氏菌的悬浮液中37. 2°C放置35min，将膜条转移至含有Iml磷酸盐缓冲液溶液的离心管中，放置2 3min，重复洗涤I次，将膜条涂板于SS平板，于36°C培养18小时。实施例三本发明实施例志贺氏菌培养方法包括如下步骤a)将“MAX箭头”膜条贴在SM31-25胶板一端，另一端贴硝酸纤维素膜；b)将上述胶版切成12cmX0. 5cm的大小；c)在贴有硝酸纤维素膜的一端滴加6ul志贺氏菌抗血清，室温晾干后再加入6ul 志贺氏菌抗血清，室温晾干后滴加I. 25%硫代硫酸钠溶液12ul，晾干得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜，加入干燥剂封好，备用；d)待检样本加入GN增菌液中，置36. 8°C培养7小时；e)取上述GN增菌液3500rpm离心2min,去除上清,加入ImL的磷酸盐缓冲液悬浮，将上述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜上贴有硝酸纤维素膜的一端侵入悬浮液中36. 8°C放置32min，将膜条转移至含有Iml磷酸盐缓冲液溶液的离心管中，放置 2 3min，重复洗涤I次，将膜条涂板于SS平板，于36°C培养18小时。
对比例(I)待检样本加入GN增菌液中，置36°C培养6小时。(2)对照组(培养法):取上述GN增菌液I环划线接种于SS琼脂平板，于36°C培养18小时结果报告请参阅图1，图I显示本发明实施例志贺氏菌培养方法得到的SS琼脂平板菌落图， 该SS琼脂平板上可明显看出志贺氏菌菌落，请参阅图2，图2显示对比例志贺氏菌培养方法得到的SS琼脂平板菌落图，从图2中可以看出，对比例的SS琼脂平板上大部分是侵袭性大肠杆菌，难以挑取出志贺氏菌菌落。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种志贺氏菌培养方法，包括如下步骤将硝酸纤维素膜用志贺氏菌抗血清处理一次以上，晾干后再用质量百分数为1% I. 5%的硫代硫酸钠处理，晾干，得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜；将所述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜加入至含志贺氏菌的悬浮液中，于36. 8 37. 2°C条件下放置30 35分钟，得到含志贺氏菌的硝酸纤维素膜；将所述含志贺氏菌的硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤；将所述用磷酸盐缓冲液洗涤后的硝酸纤维素膜涂板于培养基，在36. 8 37. 2°C条件下培养18 24小时。
2.如权利要求I所述的志贺氏菌培养方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的面积为 4 8cm2。
3.如权利要求I所述的志贺氏菌培养方法，其特征在于，所述志贺氏菌抗血清的用量为 10 15ul。
4.如权利要求2所述的志贺氏菌培养方法，其特征在于，所述硫代硫酸钠的体积为 10 15ul。
5.如权利要求I所述的志贺氏菌培养方法，其特征在于，所述含志贺氏菌的悬浮液通过如下步骤制备将含志贺氏菌的样品加入至GN增菌液中，在36. 8 37. 2°C条件下培养6 8小时，离心后除上清液，加入磷酸盐缓冲液悬浮，得到含志贺氏菌的悬浮液。
全文摘要
本发明适用于微生物领域，提供了一种志贺氏菌培养方法，包括制备含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜、制备含志贺氏菌的硝酸纤维素膜、洗涤上述含志贺氏菌的硝酸纤维素膜及培养志贺氏菌等步骤。本发明志贺氏菌培养方法，通过使用含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜，减少了其他细菌，特别是侵袭性大肠菌落对志贺氏菌菌落的影响，保证样本中低浓度志贺氏菌不出现漏检，从而提高志贺菌的检出率。
文档编号C12R1/01GK102604866SQ20121006811
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者卢柳燕, 吴炳义, 唐晓玲, 李兵, 汪再兴, 董绍旺, 龚剑 申请人:深圳市生科源技术有限公司