专利名称：禽脑脊髓炎病毒lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种禽脑脊髓炎病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
禽脑脊髓炎(avian encephalomyelitis,AE)又称流行性震颤,是由禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)引起的青年鸡、雉鸡、鹤鹁和火鸡的一种急性、 高度接触性传染病。该病通过消化道感染家禽，侵害鸡的中枢神经系统和其它实质性器官， 病毒经蛋垂直传播，导致孵化率下降，感染雏鸡在1-7日龄出现震颤、运动失调等症状，随着鸡日龄的增长，这些临床神经症状慢慢不表现。另外，病毒感染产蛋鸡，可导致产蛋鸡产蛋量轻微下降，对养禽业尤其是种禽饲养业危害极大。目前，实验室检测脑脊髓炎病毒的方法有病毒分离、PCR方法和荧光PCR检测方法等，但是病毒分离鉴定存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。目前已建立的禽脑脊髓炎病毒PCR方法和荧光PCR检测方法，虽然检测的敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳等，而荧光PCR检测方法需要昂贵的荧光PCR仪和昂贵的试剂，不利于在临床中推广。LAMP具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增引物组。本发明提供的引物组，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物组中，还包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6 ；上述引物组由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比具体为 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 15-17 15-17 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 ;所述引物 I、 所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比进一步具体为 8 : 8 : 16 : 16 : 8 : 8。本发明的第二个目的是提供一种检测禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增试剂。本发明提供的环介导等温扩增试剂，由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、反转录酶(AMV)、抑制剂(inhibitor)、DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、 钙黄绿素、氯化锰和水组成。上述环介导等温扩增试剂中，所述引物组中的引物I在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为 7. 5u mol/ μ L_8. 5u mol/ μ L ；所述引物组中的引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7.5u mo μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物组中的引物3在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为15u mo μ L-17u mol/μ L ；所述引物组中的引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为15u mo μ L-17u mol/μ L ；所述引物组中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7.5u mo μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物组中的引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7.5u mo] μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物组中的引物I在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为 8umol/μ L ；所述引物组中的引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为 8umol/μ L ；所述引物组中的引物3在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为 16umol/μ L ；所述引物组中的引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为 16umol/μ L ；所述引物组中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为 8umol/μ L ；所述引物组中的引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为 8umol/μ L0本发明的第三个目的是提供一种检测禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述环介导等温扩增试剂。上述的引物组或上述环介导等温扩增试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽脑脊髓炎病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽脑脊髓炎病毒为用上述的引物组或上述环介导等温扩增试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行环介导等温扩增反应；上述应用中，所述反应的模板为待测样品的RNA。本发明的实验证明，与现有技术相比，其优点和积极效果表现在本发明建立了禽脑脊髓炎病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒根据禽脑脊髓炎病毒的VP2基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，该保守基因序列为禽脑脊髓炎病毒所共有。常规的LAMP方法,需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或 Gene Finder染料来显色，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境，容易污染环境而造成假阳性，同时SYBR Green I或Gene Finder染料还会因为引物二聚体而引起假阳性。因此本发明使用钙黄绿素+氯化锰替代了 SYBR Green I和Gene Finder这些染料，在配置LAMP反应液时就可以加入反应液中，无需LAMP反应后开盖，并且钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现翠绿色,避免了 SYBR Green I和Gene Finder染料造成的假阳性问题,具有更好的特异性。总之，本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需要普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳来观察，简单而快速，特别适用于基层现场检测禽脑脊髓炎病毒。
图I为LAMP方法检测禽脑脊髓炎病毒的特异性2为LAMP方法检测禽脑脊髓炎病毒的敏感性试验3为PCR方法检测禽脑脊髓炎病毒敏感性试验4为禽脑脊髓炎病毒LAMP反应对临床样品检测
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、引物的设计及其试剂盒的制备根据禽脑脊髓炎(avian encephalomyelitis, AE)的VP2基因保守区域(序列号 BU327593)，设计如下引物内引物I 为CAATCGATTCAATGTCAACCTGATC-AACATCTTTTCAAGCTGGAG(序列 I)；内引物2 为CCGCTATGACCACATATTGCC-TGTATATGTAAGGAACTTTCATCC(序列 2)；外引物I 为GGACTAGACGTTATTGTTCAGAT(序列 3)；外引物2 为GGTTGTAGCAACCCCTAC(序列 4)；环引物I 为GCACAAGGGCTGCTATGAGAC(序列 5)；环引物2 为ACGGTAAGCTGAATTGCAACA(序列 6)。2、LAMP鉴别试剂及试剂盒24ul反应液体系如下2. 5ul IOX等温反应缓冲液(中国大连宝生物工程公司 Takara产品，产品目录号DR100A)、lul 5U/ul AMV(中国大连宝生物工程公司Takara产品，产品目录号D2620，反应体系中的终浓度为O. 2U/ul)、lul 40U/ul inhibitor(抑制剂，中国大连宝生物工程公司Takara产品，产品目录号D2313A，反应体系中的终浓度为
1.6U/ul)、lul 8U/ul Bst DNA 聚合酶(反应体系中的终浓度为 O. 35U/ul)、3. 5ul IOmM dNTPs (中国大连宝生物工程公司Takara产品，产品目录号D4030RA，反应体系中的终浓度为I. 4mM)、5ul 25mM硫酸镁(反应体系中的终浓度为5mM)、lul 200uM/uL的外引物I (反应体系中的终浓度8uM/uL)、lul 200uM/uL的外引物2 (反应体系中的终浓度8uM/uL)、2ul 200uM/uL的内引物I (反应体系中的终浓度16uM/uL)、2ul 200uM/uL的内引物2(反应体系中的终浓度16uM/uL)、lul 200uM/uL的环引物I (反应体系中的终浓度8uM/uL)、Iul 200uM/uL的环引物2 (反应体系中的终浓度8uM/uL)，O. 5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素、Iul 12. 5mM氯化猛和3ul双蒸水。鉴别检测试剂盒包括上述反应液，也可以包括是各独立包装的引物。实施例2、禽脑脊髓炎病毒LAMP检测方法的特异性和敏感性试验
I、禽脑脊髓炎病毒LAMP检测方法的特异性试验禽脑脊髓炎病毒Van株(AE Van株)、禽脑脊髓炎病19株(AE 19株)、禽脑脊髓炎病毒Wl株(AE Wl株)、禽脑脊髓炎病毒W2株(AE W2株)、禽脑脊髓炎病毒1163株(AEl 163 株)(上述 5 株病毒均详见 Zhiqin Xie (谢志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美国禽病杂志)，2005，49 :227-230,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。)、鸡马立克氏病毒(MDV)株(购自南京梅里亚动物保健品公司)、鸡传染性支气管炎病毒株(Mass 41)、 鸡传染性喉气管炎病毒株(北京株)、禽呼肠孤病毒株(S1133)、禽巴氏杆菌(C48-1)、鸡毒霉形体(MG)、鸡新城疫病毒(Lasota)(记载上述6株病毒的文献详见Zhiqin Xie (谢志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美国禽病杂志)，2005,49 :227-230 ;谢志勤等，应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，广西科学，2001，8(2) :152-153，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。)。分别提取禽脑脊髓炎病毒Van株(AE Van株)、禽脑脊髓炎病19株(AE 19株)、 禽脑脊髓炎病毒Wl株(AE Wl株)、禽脑脊髓炎病毒W2株(AE W2株)、禽脑脊髓炎病毒 1163株(AE 1163株)、鸡马立克氏病毒(MDV)株、鸡传染性支气管炎病毒株(Mass41)、鸡传染性喉气管炎病毒株(北京株)、禽呼肠孤病毒株(S1133)、禽巴氏杆菌(C48-1)、鸡毒霉形体(MG)、鸡新城疫病毒(Lasota)的RNA为模板，在上述24ul由实施例I得到的反应体系中分别加入上述Iul模板。LAMP反应程序如下62°C 90min，然后80°C 5min。以正常鸡脑组织(表型正常，且经过PCR验证为阴性，用的引物为Pl CTTATGCTGGCCCTGATCGT, P2 TCCCAAATCCACAAACCTAGCC,详见 Zhiqin Xie (谢志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美国禽病杂志)，2005，49 :227-230)提取的RNA为阴性对照。LAMP反应结果可以通过以下两个方法判断在可见光下直接用肉眼观察颜色变化，阳性结果显示翠绿色，阴性结果显示淡桔红色；在紫外线下观察阳性结果显示明亮的绿色荧光，阴性结果显示无颜色。可见光下观察结果如图I所示，I为AE Van株；2为AE 19株；3为AE Wl株；4为 AE W2株；5为AE 1163株；6为鸡马立克氏病(MDV)株；7为鸡传染性支气管炎病毒(Mass 41) ;8为鸡传染性喉气管炎病毒(北京株)；9为禽呼肠孤病毒(S1133) ;10为禽巴氏杆菌 (C48-1) ;11为鸡毒霉形体(MG) ;12为鸡新城疫病毒(Lasota) ;13为阴性对照，可以看出， AE Van株、AE 19株、AE Wl株、AE W2株、AE 1163株检测为阳性结果(可见光下显示翠绿色)，而对鸡马立克氏病(MDV)株、鸡传染性支气管炎病毒(Mass 41)、鸡传染性喉气管炎病毒(北京株)、禽呼肠孤病毒(S1133)、禽巴氏杆菌(C48-1)、鸡毒霉形体(MG)、鸡新城疫病毒(Lasota)的检测均为阴性(可见光下显示淡桔红色)。在紫外光下判断，结果与上述可见光判断结果一致。说明引物及检测方法用于检测禽脑脊髓炎病毒的特异性高。因此，上述引物及判断标准可用来判断未知样本是否含有禽脑脊髓炎病毒。2、禽脑脊髓炎病毒LAMP检测方法的敏感性试验将禽脑脊髓炎病毒AE Van株的RNA按10倍递增稀释成10ng/ul、lng/ul、100p g/ul、10pg/ul、lpg/ul、100fg/ul、10fg/ul、lfg/ul,然后按照上述I的体系和反应程序进行实验，肉眼观察结果如图 2 所示，I lng/ul ；2 100pg/ul ；3 10pg/ul ；4 lpg/ul ；5 100fg/ ul ；6 10fg/ul ；7 :lfg/ul，可以看出，1-5为翠绿色，6-7为桔红色，禽脑脊髓炎病毒LAMP检测方法的检测限为lOOfg/ul。用常规的RT-PCR进行对照实验，具体如下在50ul 的反应体系中含 25mM MgCl2 2. 5ul, 10XPCR buffer 5ul, IOmM dNTPs 2ul，Taq 聚合酶(5U)0. 5ul，AMV(5U) I μ L，RI (40U) I μ L，上游弓丨物 5-CTTATGCTGGCCCTGATCGT-3 和下游引物 5-TCCCAAATCCACAAACCTAGCC-3 各 lul，禽脑脊髓炎病毒AE Van株的RNA按10倍递增作为模板lul，35ul双蒸水。扩增程序为42V 45分钟， 94°C变性2分钟，然后进入94°C变性I分钟，62°C退火I分钟，共进行35个循环，最后再经 62°C延伸10分钟。结果如图3 所示，I 100ng/ul ；2 10ng/ul ；3 lng/ul ；4 100pg/ul ；5 10pg/ul ； 6 lpg/ul ；7 100fg/ul, 1-5得到619bp的PCR产物(经过测序，为禽脑脊髓炎病毒Van株 VP2基因genbank号为AY517471的第570-1187位核苷酸)，检测限为10pg/ul。可以看出，禽脑脊髓炎病毒LAMP检测方法的检测限为IOOfg/ul，而常规RT-PCR的检测限为10pg/ul，RT-LAMP方法敏感性比常规RT-PCR高100倍。实施例3、禽脑脊髓炎病毒LAMP检测方法对临床样品的检测I、临床组织样品中RNA的提取A.分别取临床编号为17、23、45、116的鸡(7日龄的麻鸡，出现头部震颤，四肢运动失调等症状)脑组织5g，用碾磨磨碎后加入，反复冻融3次，10000转离心5分钟，收集 IOOul上清液，加入900ul Trizol液后，剧烈混匀，室温(25°C )放置IOmin ；B.加入200ul氯仿，剧烈混匀，室温放置5min ；C. 12000 Xg 离心 15min ；D.收集500ul上清，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置IOmin ；E. 12000X g 离心 15min,去上清,加入 IOOOul 75% 乙醇，12000X g 离心 15min,去
上清；F.在超净台内用自然干燥IOmin后加入20ul DEPC H2O溶解，即为待检RAN，_20°C 保持备用，得到编号为17、23、45、116的待检RNA。2、禽脑脊髓炎病毒LAMP反应对临床样品检测分别以上述I编号为17、23、45、116的待检RNA为模板，按照实施例2的I中的 LAMP反应体系和LAMP反应程序进行反应。以AE Van株的RNA为阳性对照，以正常鸡脑组织的RNA为阴性对照。结果如图4所示，I AE Van株阳性对照；2 :编号为17鸡脑样品；3 :编号为23鸡脑样品；4 :编号为45鸡脑样品45 ；5 :编号为116鸡脑样品；6 :阴性对照，通过肉眼直接观察结果，1-3为翠绿色,4-6为淡桔红色,因此说明鸡脑样品17和23含有禽脑脊髓炎病毒。采用实施例2的2中的常规的RT-PCR进行验证，模板分别为编号为17鸡脑样品的RNA、编号为23鸡脑样品的RNA、编号为45鸡脑样品的RNA、编号为116鸡脑样品的RNA， 结果为编号为17鸡脑样品和编号为23鸡脑样品的RNA、均得到619bp的PCR产物(经过测序，为禽脑脊髓炎病毒Van株VP2基因genbank号为AY517471的第570-1187，而编号为45鸡脑样品的RNA、编号为116鸡脑样品的RNA没有该大小的目的片段。因此，说明本方法正确。
权利要求
1.检测禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增引物组，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于所述引物组还包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6 ；所述弓I物组由所述弓I物I、所述弓I物2、所述弓I物3、所述弓I物4、所述弓I物5和所述弓I物 6组成。
3.根据权利要求I或2所述的引物组，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为7 5-8.5 7. 5-8. 5 15-17 15-17 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 ;所述引物 I、所述引物2、所述引物 3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比进一步具体为8 : 8 : 16 : 16 : 8 : 8。
4.检测禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增试剂，由权利要求1-3中任一所述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、反转录酶、抑制剂、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰和水组成。
5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于所述弓丨物组中的弓丨物I在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述弓丨物组中的弓丨物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述引物组中的弓丨物3在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为15u nDl/yL-17u hdI/uL；所述引物组中的弓丨物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为15u nDl/yL-17u hdI/uL； 所述弓丨物组中的弓丨物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述弓丨物组中的弓丨物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述引物组中的引物I在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为8umol/y L ； 所述引物组中的引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为Sumol/μ L ； 所述引物组中的引物3在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为16umol/y L ； 所述引物组中的引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为16umol/y L ； 所述引物组中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为Sumol/μ L ； 所述引物组中的引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度进一步具体为Sumol/
6.检测禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4或5所述环介导等温扩增试剂。
7.权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4或5所述环介导等温扩增试剂或权利要求6所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽脑脊髓炎病毒产品中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽脑脊髓炎病毒为用权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4或5所述环介导等温扩增试剂或权利要求6所述试剂盒对所述待测样品进行环介导等温扩增反应；所述反应的模板具体为待测样品的RNA。
全文摘要
本发明公开了一种禽脑脊髓炎病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。所述引物组还包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；本发明的实验证明，本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需要普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳来观察，简单而快速，特别适用于基层现场检测禽脑脊髓炎病毒。
文档编号C12R1/93GK102586486SQ20121006850
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所