专利名称：产芥子酶的深绿木霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种木霉菌株及其应用。具体是一株能代谢产生芥子酶、对常见植物病原真菌有强烈拮抗作用的深绿青霉(Trichederma atroviride)及其在以芸薹属植物为土壤熏蒸材料时促进硫代葡萄糖甙降解的应用。属于利用微生物对农业废弃物或农副产品下脚料通过生物降解提高其生物有效性或实现废弃物的高附加值的具体应用。
背景技术：
土传病害是危害设施蔬菜生产的重要病害之一，主要通过土壤、植物残体或土壤中的病菌残体传播。土壤消毒处理是控制土传病害的重要措施，其中以溴甲烷为代表的土壤熏蒸剂因为其较好的使用效果一直在多种作物土传病害的防治上被广泛应用，但由于它对臭氧层的破坏作用，联合国环境规划署在1997年规定工业国家在2005年禁用溴甲烷，而发展中国家也将于2015全面禁用溴甲烷。因此，溴甲烷替代技术研究将是当前及未来很长时间内土壤消毒的研究热点之一。生物熏蒸是利用外源加入到土壤中的植物有机质在分解过程中产生的挥发性杀生气体抑制或杀死土壤中的有害生物的方法。1994年Angus等将芸薹属(Brassica spp.) 植物组织深翻到小麦田，发现能够减少小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici)的数量，并首次将该种土壤处理方法称为生物熏蒸。芸薹属植物组织中含有大量的硫代葡糖酸酯(Glucosinolates, GSLs), GSLs本身的杀生活性不高,但植物组织在腐烂过程中，GSLs可被植物自身产生的植物源酶一黑芥子酶(Myrosinase)水解而形成挥发性和杀生性很强的异硫氰酸酯(Isothiocyanates, ITCs)类物质,对农业生产中的寄生线虫、 键刀菌(Fusarium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)大_花轮枝抱(Verticillium dahliae)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、疫霉(Phytophthoraspp.)和畸雌腐霉 (Pythium irregulare)等多种重要土传植物病原菌和杂草昆虫等具有很强的抑制杀生作用。此外，生物熏蒸还能提高土壤有机质含量、改善土壤结构、对环境无污染、对植物无药害，因此被视为很有应用前景的环保型土壤处理措施。生物熏蒸材料的降解是由微生物或酶参与的生物学过程，大量的应用和研究发现，即使是相同的植物原料，生物熏蒸效果仍然不稳定，可预见性差，影响生物熏蒸效果的因素主要有熏蒸材料中GSLs的总含量及GSLs的种类、土壤水份含量、土壤温度以及熏蒸材料的降解速度和降解程度，因此，如何通过优化以上影响提高生物熏蒸的效果将是生物熏蒸技术研究的热点。国外已有的研究表明，在土壤处理时间内，芸薹属植物中硫代葡萄糖苷的降解率仅为30-50%，排除土壤条件及材料的破碎程度的影响后，促进熏蒸材料中GSLs 降解的芥子酶的含量及活性高低是重要的影响因素，而通过在土壤中添加能促进生物熏蒸材料快速降解、释放杀生气体的微生物菌株将为生物熏蒸研究提供新的思路和技术支撑。芥子酶普遍存在于所有含硫甙葡萄糖苷植物的种子、根、茎和叶中。目前在分属 15个科500多种双子叶植物中均鉴定到黑芥子酶的存在，但在实际的熏蒸过程中，植物内源的芥子酶的活性仍不能满足GSLs降解的要求。此外，国外研究还发现微生物体内以及一些以含黑芥子酶的植物为宿主的昆虫中也存在黑芥子酶，例如Aspergillus sp. NR46F13、 啤酒酵母、交链抱霉属的 Alternaria brassicae、莖点霉(Lepthosphaeria maculans 或 Phoma Iingam)、拟步行虫(Tenebrio molitor)、黄条跳甲(Phyllotreta undulate)、甘蓝虫牙(Brevicoryne brassicae)、小菜蛾(Plutella xylostella)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等。但国内对微生物或昆虫体内芥子酶的研究几乎还处于空白状态。更未有通过添加产芥子酶的微生物提高生物熏蒸效果的公开报道。深绿木霉由于其较强的生态竞争能力、对许多植物病原真菌的生长抑制作用以及对作物生长的促进作用，已被国内外作为一种重要的生防菌在农业生产上应用，但对于能代谢产生芥子酶的深绿木霉，国内外未见公开报道。
发明内容
本发明的目的在于针对以芸薹属植物为土壤生物熏蒸材料时，其中的GSLs降解释放杀生气体ITCs的速度慢、降解程度低进而熏蒸效果不稳定的生产实际问题，提出将一种能代谢产生芥子酶促进GSLs降解释放杀生气体ITCs、同时对植物病原菌具有拮抗作用而对植物生长具有促进作用、生长速度快、易于培养、土壤定殖力强的深绿木霉 Trichederma atroviride菌株应用于土壤的生物熏蒸，以提高其对土传病虫害的防治效果O本发明的目的是这样实现的一种产芥子酶的深绿木霉(Trichederma atroviride)菌株，其特征在于所述深绿木霉菌株的保藏号为CGMCCNo. 5609,该菌株在 PDA平板上30°C培养4天即可覆盖直径90mm的平板，菌丝体表面疏松、平坦，初为白色；在培养的第3天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹，培养基背面棕黄色。一种保藏号为CGMCC No. 5609的产芥子酶的深绿木霉菌株的应用，其特征在于 将所述深绿木霉以固体菌剂的形式施用到含有芸薹属(Brassica spp.)植物组织为熏蒸材料的土壤中，通过生物熏蒸杀灭土壤中的病虫害，防治作物土传病害。在所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用中所述深绿木霉的固体菌剂是这样获得的将深绿木霉的保藏菌株置入试管斜面培养基PDA中进行试管斜面活化后，再置入装有液体培养基I3DB的容量为250ml的三角瓶，装液量为80ml/250ml ;将三角瓶置于摇床培养 3-4天，摇床的转速160r/min，培养期的环境温度为28±2°C;结束后以5%接种量V/W接入固体培养基，在28±2°C环境中继续培养6-8天，每隔2-3天翻拌一次，至产孢；最后自然风干或30°C烘干后粉碎过10-20目筛，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为lO.Ucfu/g。在所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用中所述的试管斜面培养基PDA是这样获得的称取马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20 克，琼脂20克，溶化后补足水至1000毫升；所述的液体培养基PDB是这样获得的称取马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20克，溶化后补足水至1000毫升；所述的固体培养基是由质量配比为I : I : I的麸皮草炭稻草粉复配均匀混合后获得。在所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用中所述的以固体菌剂形式加入到含有芸薹属植物组织的土壤中进行生物熏蒸防治植物土传病害是指在芸薹属植物组织均匀撒到土壤表层后，将固体菌剂均匀撒在植物组织表面，随后进行土壤旋耕，浇水后覆盖塑料膜， 固体菌剂用量为30-40公斤/亩。在所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用中所述的芸薹属植物组织是指芥菜、 油菜、大白菜、甘蓝的植物组织，或芥菜、油菜、大白菜、甘蓝的残体，或由它们制备的饼柏。本发明的优点在于保藏号为CGMCC No. 5609的产芥子酶的深绿木霉 (Trichederma atroviride)菌株,对杀生气体ITCs有极强的耐受能力，它不仅能代谢产生促进GSLs降解快速释放杀生气体ITCs，而且作为一种已被广泛接受的生防菌，对多种土传病害有较好的防效；尤其是该菌株生长速度快，易于培养且产孢子量大，有较强的土壤及根际定殖能力，在土壤熏蒸期发挥其促进ITCs释放的功能，熏蒸结束后继续发挥其生防菌的功能，是一株优良的多功能生防菌株。该菌株的固体菌剂的可以通过常规的固体浅盘培养， 成本低，生产方法简单，可操作性强，本发明为土壤生物熏蒸注入新生力量，提供一种新的技术支撑。
图I是深绿木霉(Trichederma atroviride)) 18SrDNA的ITS3部分序列分析聚类结果。图2是固体菌剂对瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的抑制作用；图中，A为培养24小时的观察图，B为培养72小时的观察图。图3是固体菌剂对立枯丝核病菌(Rh izoctonia solani Kiihn)的抑制作用；图中，A为培养24小时的观察图，B为培养72小时的观察图。图4是固体菌剂对辣椒疫霉病菌(Pytophthora capsici Leonian)的抑制作用； 图中，A为培养24小时的观察图，B为培养72小时的观察图。图5是固体菌剂对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)的抑制作用；图中， A为培养24小时的观察图，B为培养72小时的观察图。图6是固体菌剂对辣椒枯萎病菌(Fusaiumoxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans) 的抑制作用；图中，A为培养24小时的观察图，B为培养72小时的观察图。
具体实施例方式实施例I江苏省农业科学院从土壤中筛选得到一种木霉菌株，该菌株于2011年12月23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。保藏号为CGMCC No.5609，菌株特征为在PDA平板上30°C培养4天即可覆盖直径90mm的平板，菌丝体表面疏松、平坦，初为白色；在培养的第3天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹，培养基背面棕黄色。经形态学和分子生物学手段鉴定为深绿木霉(Trichederma atroviride)。分子生物学鉴定结果深绿木霉(Trichedermaatroviride) ITS 序列为 SEQ ID N0. I。
深绿木霉(Trichederma atroviride) 18SrDNA的ITS3部分序列分析聚类结果见图I。图I为该深绿木霉(Trichederma atroviride)的系统发育树。采用邻位相连算法(Neighbor Joining method)获得分支系统树,并通过自举分析(bootstrap)进行置信度检测，自展数据集为1000次。用Mega4. O进行统计和聚类分析构建进化树。用Kimura 双参数模型，计算各序列分化距离，缺少和不确定的位点在计算中被省略。结果表明该菌株与发育树中深绿木霉(Trichederma atroviride)的同源性最高,达90%,所以确定该菌株为深绿木霉。实施例2 培养基的配制试管斜面培养基PDA的配制称取马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20克，琼脂20克，溶化后补足水至1000毫升，装量为试管高度的1/5-1/6，用试管塞塞好试管口，121°C高压灭菌25min，趁热取出后摆斜面至冷却备用， 斜面高度不超过试管高度的1/3。液体种子培养基PDB的配制称取马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20克，补足水至1000毫升，然后分装，装液量为80-100ml/250ml 三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121 °C高压灭菌25min，冷却后备用。固体培养基的配制麸皮草炭稻草粉质量配比为I: I : I。在本实施例中， 取麸皮1kg，草炭1kg、稻草粉Ikg均匀搅拌，加水调整培养基水分含量为60-65%，121 °C高压灭囷40min,间隔24小时后在冋样条件重新灭囷一次，冷却后备用。实施例3 产芥子酶的深绿木霉(Trichederma atroviride)固体菌剂的制备(本实施例涉及的各种培养基均匀实施例2提供)a)菌种的活化采用试管斜面保藏菌种的活化方法将试管斜面保藏的菌种挑取一块直径5mm左右的保藏号为为CGMCC No. 5609的深绿木霉菌丝块接种到试管斜面培养基PDA中活化，在 28±2°C的环境中培养3-5天后备用。采用安瓿管冷冻干燥保藏菌种的活化方法在超净工作台中用70%酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中挫一道沟，用无菌纱布垫或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿管向其中加入0. 5-1. Oml液体培养基TOB，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水，然后再将此转接到试管斜面培养基PDA中活化，在28±2°C的环境中培养3-5天后备用。b)液体培养将试管活化好的所述深绿木霉挑取三块直径8mm左右的菌块分别接种在三个容积为250ml的装有IOOml液体培养基PDB三角瓶中，置于摇床，摇床的转速160r/min，在 28±2°C的环境中培养3-4天后备用。c)固体培养将液体培养好的250ml所述深绿木霉培养物接入5kg固体培养基中，将固体培养物平铺在浅盘中，厚度5-8cm，上面盖上双层经高压灭菌处理的纱布，在28±2°C环境中继续培养6-8天，每隔2-3天翻拌一次，同时适当补加无菌水，培养至产孢；最后自然风干或30°C烘干(水分含量小于10% )即为固体菌剂，菌剂含菌量为lO—cfu/g。以上所有接种操作必须在无菌条件下，即在超净工作台的酒精灯旁或经紫外线灭菌处理1-2小时的房间，固体培养的房间也需事先用紫外线灭菌处理1-2小时。实施例4保藏号为CGMCC No. 5609的深绿木霉(Trichederma atroviride)对生产上常见病原真菌生长的抑菌试验参试菌株瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)；立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)；辣椒疫霉病菌(Pytophthoracapsici Leonian)；辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)；辣椒枯萎病菌(Fusaiumoxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans)。试验方法将保藏号为为CGMCC No. 5609的深绿木霉及各病原菌分别单独接种到PDA平板上，30°C恒温培养，获得各个菌株的新鲜菌丝块(直径5毫米)，再将该深绿木霉分别与各个病原菌的新鲜菌丝块接种到PDA平板的中(每个平板接种I个深绿木霉的菌丝块以及I种病原菌的菌丝块)，两个菌丝块之间相距5厘米，30°C恒温箱中分别于24小时和72小时培
养观察。试验结果见图2 图6，由图可见，保藏号为为CGMCC No.5609的深绿木霉 (Trichederma atroviride)对瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum);立枯丝核病菌(Rh izoctonia solani Kiihn);辣椒疫霉病菌(Pytophthora capsici Leonian);辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici);辣椒枯萎病菌(Fusaium oxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans)等都有比较明显的生长抑制作用，所述的深绿木霉主要是通过重寄生作用抑制或杀灭病原菌，即通过分泌多种复合抗生物质或者能降解病原菌细胞壁的多种酶达到抑制靶标病原菌生长的效果。实施例5 产芥子酶的深绿木霉(Trichederma atroviride)固体菌剂(实施例3提供)的使用土壤施足底肥，再均匀施入事先破碎成5-8厘米长短芸薹属植物组织或残体或相应饼肥，每亩用量干物重400-500公斤，将固体菌剂均匀撒到土壤表层，随后进行土壤旋耕，再给土壤浇水至土壤持水量的70%左右，然后覆盖塑料薄膜，塑料薄膜四边要深埋入土中确保密封不漏气，平均土温高于15度时保持10-13天，平均土温低于15度时保持20-25 天，熏蒸结束后揭开塑料膜自然晾晒2-3天后即可栽种。固体菌剂用量为30-40公斤。采用这种方法可完全杀死土壤中的各种病原生物和杂草种子，对土壤进行彻底消毒，加入深绿木霉在夏季使得熏蒸时间缩短3-5天，冬天缩短5-7天。所述的芸薹属植物组织是指芥菜、油菜、大白菜、甘蓝的植物组织，或芥菜、油菜、大白菜、甘蓝的残体，或由它们制备的饼柏。实施例6 :固体菌剂(由实施例3提供)加入到用菜柏作为熏蒸材料的土壤中对辣椒疫霉病的防效(盆栽试验)
病原菌辣椒疫霉由本实验室收藏或者到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心也可获得。化学熏蒸剂棉隆，由南通垄鑫农药有限公司提供。菜柏陇油7号油菜的菜柏。实验在温室进行，土壤为水稻田土自然风干后过5mm筛后与草炭以5 I (V/V)比例混合备用，病原菌为辣椒疫霉游动孢子液，接种浓度为100个孢子/g土。设以下处理1、 空白对照，土壤不作任何处理。2、病原菌，土壤只接种辣椒疫霉孢子液。3、棉隆+病原菌， 棉隆用量为O. 01% (W/W)。4、菜柏+病原菌，菜柏用量为O. I % (W/W)。5、固体菌剂+菜柏 +病原菌，菜柏用量为O. 1% (W/W)，固体菌剂接种浓度为IXlO6个孢子/克土。将每个处理的土壤混合物装入塑料袋中密封，置于人工气候箱中培养。人工气候箱条件为12h，35°C，相对湿度80%，另外1211，181，相对湿度80%。土壤湿度70%。培养10天后，打开塑料袋口自然摊晾24小时后装盆，移栽4叶期辣椒苗，每盆栽I棵，每个处理10棵，分别在移栽后的
7、15、21天观察辣椒发病情况，统计发病率。本实验重复做2次。表I盆栽条件下不同熏蒸方法对辣椒疫病发病率的影响)
权利要求
1.一种产芥子酶的深绿木霉(TricAeofezma airoririofe)菌株,其特征在于所述深绿木霉菌株的保藏号为CGMCC No. 5609，该菌株在PDA平板上30°C培养4天即可覆盖直径90mm的平板，菌丝体表面疏松、平坦，初为白色；在培养的第3天明显可见有孢子产生， 最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹，培养基背面棕黄色。
2.一种保藏号为CGMCC No. 5609的产芥子酶的深绿木霉菌株的应用，其特征在于将所述深绿木霉以固体菌剂的形式施用到含有芸薹属(Brassica )植物组织为熏蒸材料的土壤中，通过生物熏蒸杀灭土壤中的病虫害，防治作物土传病害。
3.根据权利要求2所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用，其特征在于所述深绿木霉的固体菌剂是这样获得的将深绿木霉的保藏菌株置入试管斜面培养基PDA中进行试管斜面活化后，再置入装有液体培养基PDB的容量为250ml的三角瓶，装液量为80ml/250ml ;将三角瓶置于摇床培养3-4天，摇床的转速160r/min，培养期的环境温度为28±2°C ;结束后以5%接种量V/W接入固体培养基，在28 ±2°C环境中继续培养6-8天，每隔2_3天翻拌一次，至产孢；最后自然风干或30°C烘干后粉碎过10-20目筛，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为Wcfu/g。
4.根据权利要求3所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用，其特征在于所述的试管斜面培养基PDA是这样获得的称取马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20克，琼脂20克，溶化后补足水至1000毫升；所述的液体培养基PDB是这样获得的称取马铃薯200克，去皮，切成块煮沸半小时，然后用两层纱布过滤，再加葡萄糖20克，溶化后补足水至1000毫升；所述的固体培养基是由质量配比为I :1 1的麸皮草炭稻草粉复配均匀混合后获得。
5.根据权利要求2所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用，其特征在于所述的以固体菌剂形式加入到含有芸薹属植物组织的土壤中进行生物熏蒸防治植物土传病害是指在芸薹属植物组织均匀撒到土壤表层后，将固体菌剂均匀撒在植物组织表面，随后进行土壤旋耕，浇水后覆盖塑料膜，固体菌剂用量为30-40公斤/亩。
6.根据权利要求2所述产芥子酶的深绿木霉菌株的应用，其特征在于所述的芸薹属植物组织是指芥菜、油菜、大白菜、甘蓝的植物组织，或芥菜、油菜、大白菜、甘蓝的残体，或由它们制备的饼柏。
全文摘要
本发明涉及一种产芥子酶的深绿木霉菌株及其应用，深绿木霉菌株的保藏号为CGMCCNo.5609，使用中，是将所述深绿木霉以固体菌剂的形式施用到含有芸薹属植物组织为熏蒸材料的土壤中，通过生物熏蒸杀灭土壤中的病虫害，防治作物土传病害。
文档编号C12N1/14GK102604842SQ20121006820
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者常志州, 张建英, 徐跃定, 殷蒙, 马艳 申请人:江苏省农业科学院