专利名称：抗虫防病木霉菌的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗虫防病木霉菌的制备方法，及木霉菌的在植物抗虫防病方面的应用。
背景技术：
在植物病害生物防治领域中微生物所发挥的作用越来越大，在国外，美国成功的将Bt毒素基因转移到假单胞细菌(Pf)中，构件出转基因工程细菌；澳大利亚科学家用生物技术手段，将放线土壤杆菌(K84)改良成具有持久效力的K1026菌株。在国内，利用现代基因工程技术建立了苏云金芽胞杆菌(Bt)、荧光假单胞菌(Pf)、枯草芽孢杆菌(Bs)等细菌的遗传转化体系，创造出一套适合我国国情的菌株分离筛选、基因鉴定、克隆等研究方法，并在真菌的生物改良上取得了重大突破。微生物农药的研究与生产逐渐成为生物防治的支柱产业。而在微生物农药的研发过程中，其技术轨迹由最早的大规模的野生菌株的筛选，发展到采用物理及化学方法定向诱变技术，进而利用选择压力的调节来达到筛选理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，严重地限制了它们广泛应用。为了克服杀菌剂与生物防治菌使用之间的矛盾，人们试图采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能够提高对化学杀菌剂的抗性，使生物防治与化学防治的综合体系得以建立。
随着人类环保意识的加强，大力发展绿色农业已经成为新的时代要求，生物防治作为绿色农业的内容越来越受到人们的关注。微生物农药的研究逐步成为生物防治的支柱产业。苏云金芽孢杆菌是世界上产量最大、应用最广的微生物杀虫剂，但是其效期短，对根部和蛀茎的害虫难以作用，因而限制了其应用潜力的发挥。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗虫防病木霉菌的制备方法及应用，通过木霉菌和农杆菌的共同培养转化，使得木霉菌具有抗虫防病的性能。
本发明的主要内容包括1.生物材料来源哈茨木霉菌菌株(Trichoderma harzianum)由河北农业大学提供，根癌农杆菌AGL-1由中科院遗传与发育研究所提供，带有苏云金芽孢杆菌的基因的质粒pPBH由中国农科院提供。
2.培养基2.1 LB培养基胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1000mL，完全溶解后用NaOH调PH值7.0，121℃湿热灭菌20min。
2.2 PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000mL，121℃湿热灭菌20min。PDA固体培养基和PdA液体培养基分别用于木霉的孢子培养和菌丝培养。
2.3 10mmol/L乙酰丁香酮(AS)10mL蒸馏水中溶解0.01962g AS，用5mol/L KOH调PH值8.0，过滤除菌，-20℃保存。
2.4诱导培养基(MM)KH2PO41.45g，K2HPO42.05g，NaCl 0.15g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.066g，FeSO4·7H2O 0.00248g，(NH4)2SO40.5g，葡萄糖1.8g，甘油5mL，蒸馏水定容至940mL，121℃湿热灭菌20min，待冷却至50℃时加入40mL1mol/L MES，20mL10mmol/LAS。
2.6诱导培养基(MMA)KH2PO41.45g，K2HPO42.05g，NaCl 0.15g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.066g，FeSO4·7H2O 0.00248g，(NH4)2SO40.5g，葡萄糖0.9g，甘油5mL，琼脂粉15g，蒸馏水定容至940mL，121℃湿热灭菌20min，待冷却至50℃时加入40mL1mol/L MES，20mL10mmol/LAS。
3.抗虫防病木霉菌的制备方法，包括取得常规保藏的哈茨木霉菌Trichodermaharizianum、根癌农杆菌AGL-1、带有苏云金芽孢杆菌的基因的pPBH质粒，然后进行以下步骤
a.通过所述的哈茨木霉菌制备分生孢子悬液；b.将取得的农杆菌与]pPBH质粒进行转化和活化培养；c.将上述的分生孢子悬液和农杆菌与]pPBH质粒的活化菌液共同培养、转化；d.进行转化子筛选、纯化。
4.上述的抗虫防病木霉菌的制备方法中，所述的通过哈茨木霉菌制备分生孢子悬液，是用蒸馏水从培养5-7天的PDA平板上洗下哈茨木霉菌的分生孢子，用液体培养基稀释为孢子浓度105--106个/ml。
5.上述抗虫防病木霉菌的制备方法中，所述的将取得的农杆菌进行转化和活化培养，是将pPBH质粒采用冻融法直接转化到所述的农杆菌AGL-1上，从含有卡那霉素和链霉素的LB平板上挑取所述的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素和链霉素的LB液体培养基上，在250rpm、29℃培养过夜，第二天用含有乙烯丁香酮的MM液体培养基稀释至OD6600.15，继续培养3-5小时至OD660为0.6-0.8。
6.上述的抗虫防病木霉菌的制备方法中，所述的将上述的分生孢子悬液和活化的农杆菌共同培养、转化过程包括取100μl已经活化的农杆菌和pPBH质粒的活化菌液和100μl稀释好的哈茨木霉菌分生孢子悬液混合后，涂布在MM平板上，在27℃培养两天后，在平皿中倒入10ml的M-100固体培养基，在27℃培养5-7天，出现抗虫防病木霉菌菌落。
7.将上述的抗虫防病木霉菌应用于杀虫和植物防病。
本发明的优点在于微生物农药在植物病害的生物防治中具有防治效果好、无污染、对人畜安全、无残留、特异性强以及保持生态平衡等优点，除此之外，利用本发明的方法，使得木霉菌株具有更好的性能1.该方法整合理来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因Cry IA(b)，使得木霉菌不但保持了原有的对植物病毒的抑菌效果，还表现出强烈的杀虫作用，从而建立了一种培养防病治病和抑菌、杀虫双重效果的木霉菌的方法。
2.本方法是以根癌农杆菌介导的转化系统，以分生孢子为受体材料转化而改变木霉菌性能的方法，转化后的木霉菌性能稳定，实验证明，该方法培养的菌株在非选择压力下连续培养10代，所取得的抗虫性能不变。这说明本方法取得的性能非常稳定，不需要反复进行基因转化，有利于实际应用于大规模的农业林业生产实践。
3.由于采用的农杆菌介质的转化系统，使该菌株只整合了载体中含有目的基因的T-DNA片段，保持了木霉菌具有的优良的生物性状。
4.用本方法制备的木霉菌，在培养相同的条件下，与普通木霉菌相比，具有生长速度快、菌丝粗大的特点。由此缩短了育菌周期，使其产业化的时间进程缩短，更加方便容易。
5.木霉菌原菌T0及其用本方法制备的木霉菌转化子Ta1对核盘菌抑菌实验结果的影响T0和核盘菌同时接种后，两菌落生长都很快，在接种第2d两菌落相接，此时核盘菌菌丝的相向生长停止，T0生长在短暂停滞后继续向核盘菌生长，并产生孢子，同时核盘菌菌落逐渐向后收缩，T0最终覆盖整个平板，T0在与核盘菌对峙培养中表现出很强的拮抗效果，对核盘菌的生长抑制作用非常明显。转化子Ta1与核盘菌对峙培养的菌落生长情况与T0情况相似，Ta1同样表现出很强的拮抗效果，两菌接种第2d菌落相接，此时核盘菌生长基本被抑制，而Ta1生长在短暂停滞后继续向核盘菌菌落生长，并逐渐覆盖之，与此同时核盘菌菌落逐渐收缩消解，最终Ta1覆盖整个平板。
6.利用本发明的方法制备的转化子Ta1、Ta2具有显著的杀虫活性玉米螟试虫取食转化子Ta1、Ta2处理的人工饲料2d后就开始陆续死亡，到第6d校正死亡率(以木霉原菌为对照)分别达到69.57％和91.30％，而对照组试虫生长良好。这里需要指出的是木霉菌原菌对照死亡率达到23.33％，比空白对照死亡率高出很多，转化子对玉米螟试虫表现出了显著的杀虫活性，特别是转化子Ta2杀虫活性较高。
本发明的
具体实施例方式实施例1抗虫防病木霉菌的制备方法，包括取得常规保藏的哈茨木霉菌Trichoderma harizianum、根癌农杆菌AGL-1及质粒pPBHe.通过所述的哈茨木霉菌制备分生孢子悬液；f.将取得的农杆菌与]pPBH质粒进行转化和活化培养；g.将上述的分生孢子悬液和农杆菌与]pPBH质粒的活化菌液共同培养、转化；h.进行转化子筛选、纯化。
实施例2上述的抗虫防病木霉菌的制备方法中，所述的通过哈茨木霉菌制备分生孢子悬液，是用5ml灭菌蒸馏水从培养5-7天的PDA平板上洗下哈茨木霉菌的分生孢子，用血球计数板计数，然后用MM液体培养基稀释为孢子浓度105--106个/ml。
实施例3上述的抗虫防病木霉菌的制备方法中，所述的将取得的农杆菌进行转化和活化培养，是将pPBH质粒采用常规的冻融法直接转化到所述的农杆菌AGL-1上，从含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的LB平板上挑取一个所述的农杆菌单菌落，接种于7ml含有卡那霉素50μg/ml和链霉素50μg/ml的LB液体培养基上，在250rpm、29℃培养过夜，第二天用含有200μM乙烯丁香酮(AS)的MM液体培养基稀释至OD6600.15，根据温度和环境，继续培养3-5小时至OD660为0.6-0.8。
实施例4上述的抗虫防病木霉菌的制备方法中，所述的将上述的分生孢子悬液和活化的农杆菌共同培养、转化过程包括取100μl已经活化的农杆菌和pPBH质粒的活化菌液和100μl稀释好的哈茨木霉菌分生孢子悬液混合后，涂布在MM(200μM AS)平板上，在27℃培养两天后，在平皿中倒入10ml的M-100固体培养基，在27℃培养5-7天，出现抗虫防病木霉菌菌落。
另外，介绍所述的带有苏云金芽孢杆菌的基因的质粒pPBH还可以通过以下方法构建将含有目的基因Cry1A(b)的片断酶切下来连接到克隆载体pUC18上，用限制性内切酶Nco I和HindIII双酶切质粒pFWZ10，胶回收含有目的基因Cry1A(b)的片断，该目的基因带有Nos终止子，将所回收片断与用同样的限制酶酶切的pUC18载体连接，转化大肠杆菌，用限制性内切酶Nco I和HindIII双酶切质粒pUC-Bt，胶回收含有目的基因Cry1A(b)的片断，用T4DNA聚合酶补平；然后用限制性内切酶Cla I和BamH I双酶切质粒pES200，回收载体大片断，T4DNA聚合酶补平，并用碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，将去磷酸化的载体与已经补平的目的基因进行平端连接，得到质粒pEB，即目的基因连接上启动子PtrpC，用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切农杆菌质粒pPK2，回收大片段，然后与用EcoR I酶切质粒pCB1003所得到的含有hph基因的小片段连接，再胶回收已连接的大片段；然后用EcoR I和Xba I部分酶切质粒pEB，回收带有PtrpC和Tnos的Cry1A(b)基因片断，与上一步所获得的大片段连接，得到用于农杆菌介导转化的二元表达载体pPBH。质粒pPBH酶切鉴定结果表明带有启动子PtrpC的潮霉素抗性基因已连接到载体上。
实施例5将上述的抗虫防病木霉菌应用于杀虫和植物防病。
权利要求
1.一种抗虫防病木霉菌的制备方法，包括取得常规保藏的哈茨木霉菌Trichoderma harizianum、根癌农杆菌AGL-1及带有苏云金芽孢杆菌的基因的质粒pPBH，其特征是a.通过所述的哈茨木霉菌制备分生孢子悬液；b.将取得的农杆菌与]pPBH质粒进行转化和活化培养；c.将上述的分生孢子悬液和农杆菌与]pPBH质粒的活化菌液共同培养、转化；d.进行转化子筛选、纯化。
2.根据权利要求1所述的抗虫防病木霉菌的制备方法，其特征是所述的通过哈茨木霉菌制备分生孢子悬液，是用蒸馏水从培养5-7天的PDA平板上洗下哈茨木霉菌的分生孢子，用液体培养基稀释为孢子浓度105-106个/ml。
3.根据权利要求1或2所述的抗虫防病木霉菌的制备方法，其特征是所述的将取得的农杆菌进行转化和活化培养，是将pPBH质粒采用冻融法直接转化到所述的农杆菌AGL-1上，从含有卡那霉素和链霉素的LB平板上挑取所述的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素和链霉素的LB液体培养基上，在250rpm、29℃培养过夜，第二天用含有乙烯丁香酮的MM液体培养基稀释至OD6600.15，继续培养3-5小时至OD660为0.6-0.8。
4.根据权利要求l或2所述的抗虫防病木霉菌的制备方法，其特征是所述的将上述的分生孢子悬液和活化的农杆菌共同培养、转化过程包括取100μl已经活化的农杆菌和pPBH质粒的活化菌液和100μl稀释好的哈茨木霉菌分生孢子悬液混合后，涂布在MM平板上，在27℃培养两天后，在平皿中倒入10ml的M-100固体培养基，在27℃培养5-7天，出现抗虫防病木霉菌菌落。
5.将上述的抗虫防病木霉菌应用于杀虫和植物防病。
全文摘要
抗虫防病木霉菌的制备方法及应用，在植物病害生物防治领域中微生物所发挥的作用越来越大，在国外，美国成功的将Bt毒素基因转移到假单胞细菌(Pf)中，构件出转基因工程细菌；由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，严重地限制了它们广泛应用。本发明的方法包括取得常规保藏的哈茨木霉菌、根癌农杆菌AGL－1及带有苏云金芽孢杆菌的基因的质粒p P BH，通过哈茨木霉菌制备分生孢子悬液；将取得的农杆菌与p P BH质粒进行转化和活化培养；将分生孢子悬液和农杆菌与p P BH质粒的活化菌液共同培养、转化；进行转化子筛选、纯化。本发明的方法用于制备抗虫防病木霉菌并将其应用于植物的抗虫害和植物的抗病、防病。
文档编号A01N63/02GK1778886SQ20041004406
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月17日 优先权日2004年11月17日
发明者杨谦 申请人:杨谦