一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法
【专利说明】
一、技术领域
[0001]本发明属于生产莱菔素的技术领域，特别涉及一种用萝卜籽柏生产高纯度莱菔素的方法。
二、技术背景
[0002]近年来，全球癌症患者人数在大幅度增加，而每年我国新增癌症患者占到全球新增病例的20%以上。因此，癌症已经成为人类不容忽视的一种疾病。萝卜籽中含有丰富的硫苷，其中，4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷在萝卜籽中的含量最高，经过黑芥子酶酶解后可生成4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基异硫氰酸酯(俗称莱菔素，sulforaphene) 0莱菔素与萝卜硫素相比，在结构上，莱菔素在烃基链上有一个不饱和键；在性能上，莱菔素抑制突变的活性是萝卜硫素的1.3?1.5倍。据相关研究报道，莱菔素对食道癌、结肠癌、乳腺癌等表现出良好的抗癌活性。
[0003]现有生产莱菔素的方法，如2014年10月8日公开的公开号为CN 104086467A“一种利用溶剂萃取法和分子蒸馏法联合制备莱菔素的方法”的发明专利，该专利公开的方法是:利用有机溶剂从莱菔素水解液中萃取并减压蒸馏得到莱菔素粗提物，再利用分子蒸馏分离纯化技术纯化得到高纯度的莱菔素产品。该方法存在的主要缺点有:①萃取过程中使用氯仿、二氯甲烷等有毒试剂，不但造成环境污染，而且萃取选择性较低。②分子蒸馏过程中温度较高、受热时间过长，极易造成莱菔素降解，影响产品质量。⑧分子蒸馏设备昂贵，投资成本大，技术要求较高，生产能力有限。④采用萝卜籽或萝卜芽苗作为原料成本较高，且造成萝卜籽中萝卜籽油的极大浪费。
三、
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有生产莱菔素方法的不足之处，提供一种用萝卜籽柏生产高纯度莱菔素的方法，具有不需要使用氯仿、正己烷等有机试剂，操作简单，产品纯度高，废弃物有效循环利用，提取纯化效率高，无“三废”排放等特点。
[0005]本发明机理:用乙醇对萝卜籽柏中的4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷进行提取，经纳滤膜除去提取液中的小分子蛋白、多糖等物质，达到纯化4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷的目的。制备色谱是基于高效液相色谱技术发展起来的，分离效率与纯化倍数高，产品纯度高。4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷与其它物质存在结构差异，在色谱填料上的吸附力不同，用适当的洗脱液进行洗脱分离，可以获得高纯度的4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷。黑芥子酶经溶解、超声预处理，不仅改变了粗酶中各物质表面类型，且可最大程度提高产品稳定性。黑芥子酶通过交联剂丙二醛固定于胺基型树脂，形成固定化黑芥子酶。将固定化黑芥子酶反应柱与装有吸附树脂的分离柱耦联，形成反应-分离耦合柱式反应器，使高纯度4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷在黑芥子酶的催化下生成莱菔素，然后吸附于分离柱上，实现莱菔素的生成与分离。
[0006]本发明的目的是这样实现的:一种用萝卜籽柏生产高纯度莱菔素的方法，以萝卜籽柏为原料，经过乙醇提取、制备色谱、反应分离、真空干燥等生产得到高纯度莱菔素。其具体的方法步骤如下:
[0007](I)制备4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷粗提液
[0008]以萝卜籽柏为原料，按照萝卜籽柏的质量(kg):体积分数为50?60%乙醇溶液的体积(L)之比为1: 6?8的比例，将萝卜籽柏均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70°C的条件下，进行第一次浸提，浸提I?2h。第一次浸提完成后，将浸提混合物栗入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣。对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣。对于收集的第二次浸提残渣，因含有丰富的蛋白质，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再栗入截留分子量为600?SOODa的纳滤器中，在0.25?0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20?30%时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液。对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5?15%时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并。对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理。对于收集的第二次纳滤截留液，因含有丰富的蛋白质、多糖，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。
[0009](2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷浓缩液
[0010]第⑴步完成后，将市售制备色谱填料(SPS C18 ΙΟμπι色谱填料或SMB C18ΙΟμπι色谱填料)，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用。再按照制备色谱柱:第
(I)步合并的纳滤滤过液的体积比为1: 3?5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，栗入制备色谱柱中，进行吸附上样。上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30?40 %的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3?5倍/小时的条件下，将流动相栗入制备色谱柱中，进行洗脱制备。然后待流动相栗入18?22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基_3_ 丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相栗入25?30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基_3_ 丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱。对于收集的制备色谱柱，可再生后重复使用。对于收集的制备色谱洗脱液，经反渗透浓缩回收乙醇，其中截留液含有丰富的硫苷，经冻干后可用于制作保健品等高附加值产品。对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，栗入反渗透浓缩器中，在0.15?0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10?15%为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液。对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5?8%为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液。对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷浓缩液，纯度为95.6?98.9%。对于收集的第二次反渗透透过液，与收集的第一次反渗透透过液合并，经减压蒸馏回收乙醇，调配后可继续使用。
[0011](3)制备反应-分离耦合柱式反应器
[0012]第⑵步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量(g):缓冲溶液的体积(mL)比为1: 6?8的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10?20min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣。对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶。对于收集的滤渣，烘干后用作动物饲料添加剂。其中，所述的缓冲溶液为PH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或PH 5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液或pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
[0013]将市售已活化的胺基型树脂(WA30树脂或SA20A树脂或SA21A树脂)，按照胺基型树脂的质量(g):收集的过滤液的体积(mL):丙二醛质量浓度为18%的丙二醛溶液的体积(mL)比为1: 3?5: 0.7?0.9的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2?3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40?45°C下进行固定化酶反应3?6h。反