的去离子水对抽滤渣进行洗涤。
[0057]将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，然后升温至30°C。将市售已活化的吸附树脂(D113树脂)，并装配成吸附树脂层析柱，就得到了莱菔素分离柱。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用。
[0058](4)制备高纯度莱菔素
[0059]第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷浓缩液，栗入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷浓缩液的栗入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的3倍/小时下，进行连续反应。先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱。对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.08MPa下，真空干燥30h，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达99.2%。
【主权项】
1.一种用萝卜籽柏生产高纯度莱菔素的方法，其特征在于具体方法步骤如下: (1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液 以萝卜籽柏为原料，按照萝卜籽柏的质量:体积分数为50?60%乙醇溶液的体积之比为Ikg: 6?8L的比例，将萝卜籽柏均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70°C的条件下，进行第一次浸提，浸提I?2h ;第一次浸提完成后，将浸提混合物栗入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣；对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣；对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再栗入截留分子量为600?SOODa的纳滤器中，在.0.25?0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20?30%时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5?15%时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并；对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理； (2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液 第(1)步完成后，将市售制备色谱填料，即SPS C18 10 μπι色谱填料或SMB C18 1ym色谱填料，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用；再按照制备色谱柱:第(I)步合并的纳滤滤过液的体积比为1: 3?5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，栗入制备色谱柱中，进行吸附上样；上样结束后，在检测波长为.280nm，体积分数为30?40 %的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3?.5倍/小时的条件下，将流动相栗入制备色谱柱中，进行洗脱制备；然后待流动相栗入18?.22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基_3_ 丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相栗入25?.30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基_3_ 丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱；对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，栗入反渗透浓缩器中，在0.15?0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10?15%为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5?8%为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫苷浓缩液，纯度为.95.6 ?98.9% ； (3)制备反应-分离耦合柱式反应器 第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量:缓冲溶液的体积比为Ig: 6?SmL的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10?20min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣；对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶；其中，所述的缓冲溶液为PH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或pH 5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液或pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液； 将市售已活化的胺基型树脂，即WA30树脂或SA20A树脂或SA21A树脂，按照胺基型树脂的质量:收集的过滤液的体积:丙二醛质量浓度为18%的丙二醛溶液的体积比为.1g: 3?5mL: 0.7?0.9mL的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2?3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40?45°C下进行固定化酶反应3?6h ;反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液；对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液；对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，4°C保存备用； 将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，然后升温至25?30°C，就得到固定化黑芥子酶反应柱；将市售已活化的吸附树脂，即HP20树脂或AB-8树脂或Dl 13树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素分离柱；将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用； (4)制备高纯度莱菔素 第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，栗入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液的栗入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的I?3倍/小时下，进行连续反应；反应结束后，收集柱式反应器流出液和反应-分离耦合柱式反应器；对于收集的反应-分离耦合柱式反应器，先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱，洗脱完成后，收集洗脱液和洗脱后的莱菔素分离柱；对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.07?0.08MPa下，真空干燥20?30h，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达.98.1 ?99.2% ο
【专利摘要】一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，属于莱菔素生产领域。本发明以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、制备色谱、反应分离、真空干燥等生产得到高纯度莱菔素。本发明方法具有不需要使用氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，操作简单，产品纯度高，废弃物有效循环利用，提取纯化效率高，无“三废”排放等特点。本发明在生产过程中，使用固定化酶作为催化剂，大大提高了酶的利用率。同时创新组装出反应-分离耦合柱式反应器，可进行连续操作、反复使用。本发明提供生产莱菔素的方法纯化效率高，产品的纯度高达98％以上，且无溶剂残留。采用本发明方法生产出的产品，可广泛应用于医药、保健等行业中。
【IPC分类】C07H1/08, C12P13/00, C07H5/10
【公开号】CN105177072
【申请号】
【发明人】刘兵, 张 杰
【申请人】广州六顺生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月14日