专利名称：一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法。
背景技术：
视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,简称RP)是遗传性盲目最常见的病因之一。由于RP患者视力持续性下降的原因是感光细胞的变性和凋亡，而感光细胞不能再生，移植健康的视网膜组织或者感光细胞，已经成为目前最具前景的治疗策略。目前国内外对视网膜干细胞(Retinal stem cells，简称RSCs)定向分化为感光细胞的机制展开了广泛的研究工作，阐述了许多促进RSCs向感光细胞分化的物质及相关的信号途径，如基因沉默和转染等，但始终面临这样一个问题在促分化条件下，RSCs向感光细胞的分化增加，但因导入了病毒基因和实施了基因操作，存在在体研究安全性的问题和向其它类型的细胞分化问题，而从已有成熟细胞分化的视网膜(胚胎晚期、成体视网膜等)中分离得到的RSCs，还会有其它成熟细胞类型的混杂，这将不利于RSCs诱导分化为感光细胞的在体实验、临床研究和临床应用。因此，需要一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，不导入病毒基因和进行基因操作，无视网膜成熟细胞的混杂污染，且分化效率高，操作简单。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，不导入病毒基因和进行基因操作，无视网膜成熟细胞的混杂污染，且分化效率高，操作简单。本发明提供了一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，通过抑制视网膜干细胞的IGF IRa受体使视网膜干细胞分化为感光细胞。不导入病毒基因和进行基因操作。优选的，所述视网膜干细胞为视杯视网膜干细胞。胚胎视杯(Optic cup，简称0C)中富集视网膜干细胞，并称视杯中的视网膜干细胞为视杯视网膜干细胞(OC-RSCs)，视杯视网膜干细胞是视杯发育成胚眼之前的原始视网膜细胞，因此从视杯中取材、培养会获得较原始的、未分化的、更易富集的视网膜干细胞，无各种成熟细胞的混杂污染。优选的，所述抑制视网膜干细胞的IGF IRa受体包括如下步骤a.接种视网膜干细胞于细胞培养器皿；b.加入含抗IGF IRa受体抗体的分化诱导培养基；c.放置培养且定期更换步骤b中的培养基至细胞分化。优选的，步骤a中所述视网膜干细胞为大鼠E12. 5胚胎视杯视网膜干细胞；所述培养器皿为50mL培养瓶；所述接种采用的接种密度为每瓶2 X IO5个细胞。大鼠E12. 5胚胎视杯视网膜干细胞全表达IGF IRa受体，如图I所示视杯视网膜干细胞的IGF IRa受体免疫荧光鉴定图，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为IGF IRa受体，说明全部细胞均表达IGFIRa受体。优选的，步骤b中所述含抗IGF IR α受体抗体的分化诱导培养基为I μ g/ml抗IGFIRa受体抗体+B27+20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+2. 5%胎牛血清+DMEM/F12培养基。抗IGF IRa受体抗体会特异地与IGF IRa受体结合而使失去生理功能。优选的，步骤c中所述放置培养是在37°C和5% CO2细胞培养箱中进行；所述定期更换为每2-3天更换一次至7天。与现有技术相比，本发明通过抑制视网膜干细胞的IGF IRa受体使视网膜干细胞分化为感光细胞的方 法，不导入病毒基因和进行基因操作，无视网膜成熟细胞的混杂污染，且分化效率高，操作简单。
图I为本发明OC-RSCs细胞的IGF IRa受体免疫荧光鉴定图；图2为本发明OC-RSCs细胞在抑制IGF IR a受体后视紫红蛋白的表达的ffestern-blot 鉴定图。
具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。本实施例诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，通过抑制视网膜干细胞的IGF IRa受体使视网膜干细胞分化为感光细胞。本实施例中，所述视网膜干细胞为视杯视网膜干细胞，当然也可以是来自成体视网膜、胚胎晚期视网膜等的视网膜干细胞，均能够实现发明目的，但采用视杯视网膜干细胞效果较佳。本实施例中，所述视网膜干细胞的IGF IRa受体包括如下步骤a.接种视网膜干细胞于细胞培养器皿；本步骤中所述视网膜干细胞为大鼠E12. 5胚胎视杯视网膜干细胞；所述培养器皿为50mL培养瓶；所述接种采用的接种密度为每瓶2X IO5个细胞。大鼠E12. 5胚胎的视杯视网膜干细胞全表达IGF IRa受体，如图I所示视杯视网膜干细胞的IGF IRa受体免疫荧光鉴定图，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为IGF IRa受体，说明全部细胞均表达IGF IRa受体。b.加入含抗IGF IRa受体抗体的分化诱导培养基；本步骤中所述含抗IGF IRa受体抗体的分化诱导培养基为I μ g/ml抗IGF IRa受体抗体+B27+20ng/ml bFGF+2. 5%胎牛血清+DMEM/F12培养基。c.放置培养且定期更换步骤b中的培养基至细胞分化。本步骤中所述放置培养是在37°C和5% CO2细胞培养箱中进行；所述定期更换为每2天更换一次至7天。本步骤2-3天更换一次均能够实现发明目的，但2天效果更佳。视紫红蛋白(Rhodopsin)是感光细胞的标志蛋白，Rhodopsin表达增加即说明感光细胞分化增加。对分化细胞的Rhodopsin蛋白做Western_blot鉴定,如图2所示，I为对照，即为未抑制IGF IRa受体的OC-RSCs细胞的Rhodopsin表达，II为抑制IGF IRa受体的分化细胞的Rhodopsin表达，II中Rhodopsin表达明显增加，即说明感光细胞分化增加了。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，其特征在于通过抑制视网膜干细胞的IGF IRa受体使视网膜干细胞分化为感光细胞。
2.根据权利要求I所述的诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，其特征在于所述视网膜干细胞为视杯视网膜干细胞。
3.根据权利要求I或2所述的诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，其特征在于所述抑制视网膜干细胞的IGF IRa受体包括如下步骤 a.接种视网膜干细胞于细胞培养器皿； b.加入含抗IGFIRa受体抗体的分化诱导培养基； c.放置培养且定期更换步骤b中的培养基至细胞分化。
4.根据权利要求3所述的诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，其特征在于步骤a中所述视网膜干细胞为大鼠E12. 5胚胎视杯视网膜干细胞；所述培养器皿为50mL培养瓶；所述接种采用的接种密度为每瓶2 X IO5个细胞。
5.根据权利要求4所述的诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，其特征在于步骤b中所述含抗IGF IRa受体抗体的分化诱导培养基为I μ g/ml抗IGFIRa受体抗体+B27+20ng/ml bFGF+2. 5%胎牛血清 +DMEM/F12 培养基。
6.根据权利要求5所述的诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，其特征在于步骤c中所述放置培养是在37°C和5% CO2细胞培养箱中进行；所述定期更换为每2-3天更换一次至7天。
全文摘要
本发明公开了一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，通过抑制视网膜干细胞的IGF IRα受体使视网膜干细胞分化为感光细胞；与现有技术相比，本发明通过抑制视网膜干细胞的IGF IRα受体使视网膜干细胞分化为感光细胞的方法，不导入病毒基因和进行基因操作，无视网膜成熟细胞的混杂污染，且分化效率高，操作简单。
文档编号C12N5/071GK102618490SQ201210075088
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者谭小玲, 阴正勤, 黄小勇 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院