表达hsa-miR-21^＊的重组腺相关病毒的制备方法及其在高血压病治疗中的用途的制作方法

专利名称：表达hsa-miR-21^＊的重组腺相关病毒的制备方法及其在高血压病治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能调控人类miRNA-21 *的重组腺相关病毒重组体(rAAV-miRNA_21 */ rAAV-anti-mi RNA-21 * )的构建和制备方法,更具体地说涉及hsa-miR-21 *及反义序列hsa-anti-miR-21 *的克隆及分别包含hsa-miR-21 *和hsa-anti-miR-21 *的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。
背景技术：
microRNA(miRNA, miR)是一类新近发现的来源于内源 性发夹结构转录本的长度大约为22个核苷酸的内源性小分子非编码单链RNA，通过与靶mRNA的3’非翻译区(3，untranslated region, 3’ UTR)特异性结合,促进革E mRNA降解,或者抑制革E mRNA翻译，降低编码蛋白质水平，从而实现对基因转录后的表达调控。miCToRNA与机体的多种疾病联系紧密，包括神经退行性疾病、糖尿病、肾病以及肿瘤等。近年来的研究发现，miRNA在心脏的生成、发育和功能方面均有着重要作用。高血压是我国最常见的心血管疾病，可导致多种严重并发症，如慢性心力衰竭、慢性肾功能衰竭、脑中风等，导致社会经济负担加重。关于高血压的预防、诊断和治疗工作，目前仍存在巨大的不足，治疗率、控制达标率低，而致心脑血管疾病预防效果欠佳。高血压病因和发病机制复杂，涉及多种效应器官和靶器官。目前世界卫生组织推荐的抗高血压药物有六大类利尿剂、钙拮抗剂(CCB)、β受体阻滞剂、α I受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)，但尚不能达到让人满意的效果。miRNA参与许多重要病理生理过程，由于单一 miRNA可调控多个靶基因的表达，因此针对疾病关键miRNA靶点的药物可参与多种信号通路调控，从而为高血压的防治带来新的希望。近年来研究发现，miR-155对血管紧张素11_1型受体的调控作用可能是调控动脉血压的重要机制之一。而L-精氨酸转运子SLC7A1的3’ UTR的多态性位点ss52051869与miR-122之间的调控关系与高血压之间的关系，并已在几个遗传性高血压家系中得到证实。但是目前为止尚未见关于miR-21*在高血压中的作用及相关的治疗药物用途。目前多米用腺病毒和慢病毒作为miRNA的表达载体,但腺病毒载体表达时间短、对机体有免疫原性，慢病毒多由白血病病毒或HIV改造而来，生物安全性堪忧，均不适合将来的临床应用。而重组腺相关病毒载体(rAAV)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，从而成为基因治疗最有前途的载体。为了真正实现高血压的基因治疗，我们将hsa-miR-21 *与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测获得满足治疗要求的高滴度，在动物实验中证实了其可以有效降低自发性高血压大鼠的血压水平，同时改善了心脏功能。因此，有希望成为用于临床高血压治疗的药物。
发明内容
本发明人根据hsa-miR-21 *碱基序列，分别设计并合成了表达hsa-miR-21 *和反义互补anti-hsa-miR-21 *的序列，并成功分别插入真核表达载体pAAV_D(+)中构成重组质粒 pAAV-D (+) -miR-21 * 和 pAAV-D (+) -anti-miR-21 *。之后，将 pXX9、phelper>pAAV-D (+) -miR-21 *和pAAV_D (+) -anti-miR-21 *用钙磷共转染法分别转入293细胞包装制备能分别表达hsa-miR-21 *和反义互补anti-hsa-miR-21 *的重组腺相关病毒,经纯化后，real-time PCR法测定滴度。下一步将包装制备的两种重组腺相关病毒(rAAV-miRNA_21 *和rAAV-anti-miRNA-21*)分别经尾静脉注射至自发性高血压大鼠(SHR)，发现大鼠主动脉中hsa-miR-21 *的长期表达发生明显变化，说明重组腺相关病毒能介导hsa-miR-21 */anti-hsa-miR-21 *的长期有效表达,从而促进/抑制血管hsa-miR-21 *的表达。并且发现 SHR大鼠的血压受到明显调控，重组腺相关病毒能介导的hsa-miR-21 *表达明显减低大鼠的血压水平,并且改善心脏功能。而anti-hsa-miR-21 *则明显升高动物血压水平,进一步支持hsa-miR-21 *的降血压作用。所以，本发明的第一个目的是提供分别含有hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21*的
重组腺相关病毒。本发明的第二个目的是提供分别含有hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的重组腺相关病毒的包装和制备过程。本发明的第三个目的是提供利用分别含有hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的重组腺相关病毒治疗和处理高血压的动物实验方法和主要结果。
四

摘要

不同MicroRNA治疗对SHR大鼠尾动脉血压的影响(*表示与相同时间点control组相比，ρ < O. 05)。说明书

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。其中图IA显示了自发性高血压大鼠血压水平尾动脉监测Wistar大鼠和SHR大鼠血压O表示与相同时间点Wistar大鼠相比，P < O. 05)；图IB自发性高血压大鼠主动脉中hsa-miR-21 *的表达情况实验终点时，不同组别大鼠主动脉中hsa-miR-21 *的表达情况(*表示与Wistar大鼠相比，ρ < O. 05)。图2 显不了 hsa-miR-21 *的序列(取自 miRBase)。图3 是显不 ρAAV-D (+)—miR-21 *和 pAAV_D (+) _anti_miR_21 *的质粒构成。图4是纯化后的病毒转染细胞后荧光显微镜观察GFP(绿色显示的是转染成功的细胞)，其转染效率可达90%以上。图5是real-time PCR检测不同处理的SHR大鼠主动脉中hsaniR-21 *的表达情况(* 表不与 control 组相比，ρ < O. 05)。结果显不 rAAV-miR-21 * 和 rAAV-anti-miR-21 *可明显调控SHR大鼠主动脉hsa-miR-21 *表达(前者升高hsa-miR-21 *表达水平，后者降低 hsa-miR-21*水平)。图6A是SHR大鼠尾动脉血压情况尾动脉血压监测明确不同MicroRNA治疗对SHR大鼠尾动脉血压的影响(*表示与相同时间点control组相比，p < O. 05),结果显示rAAV-miR-21 *可明显降低SHR大鼠尾动脉血压，而rAAV-anti_miR-21 *则明显升高动物血压。图6B是SHR大鼠尾动脉心脏功能情况=Millar导管检测不同处理的SHR大鼠心脏收缩能力(*表示与相同时间点control组相比，p < O. 05),结果显示rAAV-miR-21 *可明显改善SHR大鼠心脏功能。
本发明中的重组腺相关病毒rAAV-miR-21*于2011年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心；地址中国，武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC No :V201123。 五具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I自发性高血压大鼠主动脉miRNA表达的筛查I.本实验采用4周龄自发性高血压大鼠(SHR)及对照大鼠(Wistar)，饲养8周，监测大鼠尾动脉血压。结果显示SHR的基础血压明显高于正常对照大鼠，并且随着周龄增力口，SHR大鼠的血压水平不断上升(图1A)。2.实验终点时(周)，常规提取大鼠主动脉RNA 每IOOmg组织中加入Iml TRIZOL试剂，电动匀浆器匀浆。室温下放置5min后，力口入O. 2ml氯仿,混勻后室温下放置5min, 4°C 12, OOOg离心15min。将上层水相转移至新Ep管中，加入O. 5ml异丙醇,混勻后室温下放置IOmin, 4°C 12, OOOg离心lOmin。弃上清,加入Iml 75%乙醇，混匀后4°C 7，500g离心5min。弃上清，空气干燥沉淀5min，加入20 μ IDEPC处理水，55-60°C水浴IOmin溶解RNA。获得的RNA溶液保存于_80°C。3.紫外吸收法测定RNA浓度及纯度按照BioPhotometer plus (Eppendorf)仪器使用说明进行操作,测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。根据260nm处读值获得RNA浓度，以A260/A280的比值判定RNA纯度。4.变性琼脂糖凝胶电泳Ig琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60°C，加入IOml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12. 3M)。取3yg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μ g/mL·加热至70°C孵育5min使样品变性。上样于胶孔中，5_6V/cm电压下电泳至溴酹兰指示剂进胶至少2-3cm，紫外透射光下观察并拍照。5.采用广州锐博公司miRNA检测试剂盒对hsa_miR-21 *的表达进行检测miRNAs 逆转录逆转录引物(RT Primer Mix)配置miRNA-21* RT Primer I μ IU6RT Primer I μ I
RNase free H2O 78 μ I逆转录反应体系RNA template 2 μ gRT Primer Mix 4 μ IRNase free H2O up to 19 μ I以上体系混匀后，瞬时离心，70°C孵育IOmin后，冰育2min，再加入以下试剂2 X TS reaction buffer 25 μ ITS enzyme 2. 5 μ I·
RNase free H2O 3. 5 μ I逆转录反应程序420C 60min，70°C IOmin ;停止后 4°C备用，产物保存于-20°C。miRNAs real-time PCR 反应体系2XSYBRGreen Mix 9μ IRT product 2 μ ImiRNA Forward Primer 2 μ ImiRNA Reverse Primer 2 μ IRNase-free H2O 5 μ I反应程序95°C 30sec—(95°C IOsec—60°C 20sec—70°C lsec) X40cycles—Melting Curve结果显示SHR大鼠主动脉中的miR-21*的含量为对照正常Wistar大鼠主动脉中的2. 84倍(图1B) ο实施例2重组腺相关病毒的构建1.插入片段合成依据hsa-miR-21 *的碱基序列(图2)，分别设计并合成表达hsa_miR-21 *及反向互补hsa-anti-miR-21 *的两条反向互补链，并用TE溶解。序列如下hsa-miR-21 * 上游引物5，GATCCacagcccatcgactggtgttgTTCAAGAGAcaacaccagtcgatgggctgtCCGC 3’下游引物3，GtgtcgggtagctgaccacaacAAGTTCTCTgttgtggtcagctacccgacaGGCGCCGG 5’hsa-anti-miR-21 * 上游引物5，GATCCcaacaccagtcgatgggctgtTTCAAGAGAacagcccatcgactggtgttgCCGC 3’下游引物3，GgttgtggtcagctacccgacaAAGTTCTCTtgtcgggtagctgaccacaacGGCGCCGG 5’2.按照说明书中体系及温度进行反应Nuclease-Free Water 36 μ IAnnealing Buffer for DNA Oligos(5X) 10 μ IDNA oligo Α(50μΜ) 2μ I
DNA oligo B (50 μ Μ) 2μ I9(TC 3min，37°C lhr，4°C 保存。3.载体酶切采用BamH I和Not I对真核表达载体pAAV_D (+)在37°C下双酶切2hr，体系如下IOXK Buffer I μ IBSA I μ IBamH I I μ I Not I I μ IρAAV-D (+) 2 μ IddH20 14 μ I4.琼脂糖凝胶电泳胶回收用I %的琼脂糖电泳凝胶电泳双酶切产物，然后使用TaKaRa公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O回收双酶切产物，具体操作步骤如下I.制作IXTAE缓冲液琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳；2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶；3.称量胶块重量，计算胶块体积，切碎胶块；4.向胶块中加入3倍体积的胶块融化液DR-I Buffer, 75°C加热融化胶块；5.向胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇；6.将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上；7.将上述操作5的溶液转移至Spin Column中，12, OOOrpm离心Imin,弃滤液；8.将 500 μ I 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12, OOOrpm 离心 30sec，弃滤液；9.将 700μ1 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30sec,弃滤液;10.重复操作步骤9 ；11.将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12，OOOrpm 离心 Imin ;12.将Spin Column安置于新的I. 5ml的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入25μ I的60°C预热的Elution Buffer,室温静置Imin ；13. 12, OOOrpm 离心 Imin 洗脱 DNA。5.载体连接I.用T4连接酶连接回收的pAAV-D⑴载体和合成的DNA片段，按照下述反应体系16 °C孵育过夜10xT4DNA 连接酶2.5 μΙ
DNA 片段0.3 pmol
载体片段0.03 pmol
T4 DNA连接酶1 μΙ
ddhbOup to 25 μΙ2.全量(25 μ I)加入至100 μ I DH5 α感受态细胞中，冰中放置30min ；3. 42°C加热45sec后，再在冰中放置Imin ；4.加入500 μ I无抗生素LB培养基，37°C IOOrpm振荡培养60min ；5.在Amp+的LB平板培养基上培养，挑选白色单克隆菌落鉴定。6.质粒小提挑取单克隆菌落，加入到3ml Amp+的LB液体培养基中，37°C 280rpm振荡培养过夜。使用北京全式金公司EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒,具体操作步骤如下I.取I. 5ml过夜培养的细菌10，OOOg离心lmin，尽量吸尽上清；2.加入250 μ I无色溶液RB (含RNase Α)，震荡悬浮细菌沉淀；3.加入250 μ I蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4_6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液；4.加入350 μ I黄色溶液NB，轻轻混合5_6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min ；5. 15, OOOg离心5min,小心吸取上清加入吸附柱中；6. 15, OOOg 离心 lmin,弃流出液；7.加入650 μ I溶液WB, 15，OOOg离心lmin,弃流出液；8. 15，OOOg离心2min，彻底去除残留的WB ;9.将吸附柱置于新Ep管中，在柱中央加入20μ I 70°C预热的ΕΒ，室温静置lmin ;10. 10，OOOg 离心 lmin，洗脱 DNA，洗脱出的 DNA 于-20°C保存。7.质粒鉴定采用双酶切和测序对所构建的质粒进行鉴定，得到真核表达质粒pAAV-D (+)-miR-21 *和 pAAV-D(+)-anti_miR-21 *，其结构如图 3 所示。8.质粒大提准备IL的无菌锥形瓶，加入300ml无菌LB培养基，加氨苄青霉素溶液至终浓度为100 μ g/ml。分别加入 50 μ I 所需质粒(pXX9、pheIper、pAAV-D (+)、pAAV-D (+) -miR-21 *和pAAV-D (+) -anti-miR-21 *)，280rpm, 37°C过夜培养。按照 OMEGA 公司 E.Z.N.A Endo-FreePlasmid Maxi Kit说明书操作,提取质粒,具体步骤如下I.室温下5000g离心IOmin收集细菌；2.弃培养基，加入10ml Solution I/RNase A混合液，漩涡震荡完全重悬；3.重悬混合液中加入10ml Solution II,轻轻颠倒混勻10-15次后，室温放置2min ；4.加入5ml冰浴的Buffer N3,并温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；5.将HiBind柱套在收集管中，加入5ml Buffer GPS，室温静置3-lOmin，5，000g离心5min，弃滤液，将柱子重新放回收集管中；6.将细菌裂解液倒入针筒过滤器中，静置2min，插入并推动活塞，收集过滤的裂解液；7.过滤裂解液中加入1/10体积的ETR，颠倒7_10次后，冰浴IOmin ；8. 42°C水浴5min后，室温5，OOOg离心5min，转移上清液至新离心管，加入O. 5倍体积无水乙醇，混匀后室温静置2min ；9.转移混合液至已激活HiBind柱中，室温5，OOOg离心5min,弃去滤液；10.将结合柱重新装回收集管，加入IOml HB Buffer，室温5，OOOg离心5min，弃去 滤液；11.将结合柱重新装回收集管，加入15ml DNA Wash Buffer，室温5，OOOg离心5min,弃去滤液；12.重复上一步骤；13.弃去滤液,结合柱重新装回收集管,6，OOOg离心15min ;14.取出结合柱，65°C干燥IOmin ;15.结合柱装入新离心管，加入7CTC预热的l_3ml Endotoxin free ElutionBuffer,室温静置2min后，6，OOOg离心5min以洗脱DNA。9. rAAV介导的病毒包装293T细胞生长至90%，钙磷转染前l_2hr，每个培养皿换新鲜培养基(含血清)12-15ml，在50ml离心管内先加入氯化钙(CaCl2)，再加入质粒，形成Ca-DNA混合液，充分混匀，向Ca-DNA混合液中缓慢滴加2XHEBS BUFFER,形成Ca-DNA-P混合液，一边加2XHEBS一边振荡离心管，充分混匀形成钙磷颗粒。8-12hr后，换18-20ml无血清培养基，72hr后，吸弃培养基，用PBS洗3遍，每个培养皿中加入Tris+NaCl (pH 8. 5) 1ml，用刮匙刮取细胞，收集于干净离心管，-80°C冻存。10.病毒纯化将冻存于_80°C的细胞取出，在37°C解冻溶解，反复冻融4次，8，OOOg离心15min，
将上清放至干净离心管，弃细胞沉淀。用-20°C预冷的无水乙醇与rAAV以3 : I的体积比充分混匀，_20°C冰箱放置2hr后，4°C，13，OOOrpm离心15min，弃上清；乙醇挥发后，加入相应体积Tris+NaCl (pH 8. 5)溶解沉淀。用Millipore小滤器(O. 22 μ m)过滤。11.病毒滴度测定样品处理rAAV病毒液40 μ I蛋白酶 K(20mg/ml) 5 μ I55°C，反应 lhr;酚氯仿异戊醇45 μ I4°C, 12, OOOg 离心 5min 回收水相；氯仿45 μ I4°C，12，000g 离心 5min 回收水相。Real-time PCR Primer I (10 μ m) O. 4 μ I
Primer 2 (10 μ m) 0. 4 μ ISYBR Green I Mix 10 μ IddH20 8. 2 μ ITemplate I μ I
95 °C 30sec—(95 °C 5sec—60 °C 5sec—72 °C 20sec)X40 个循环一MeltingCurve12.病毒转染效率纯化后的病毒转染至293T细胞48小时后，荧光显微镜观察被转染细胞比例，其转染效率可达90%以上(图4)。实施例3表达hsa-miR-21 *的重组腺相关病毒对高血压的治疗作用I. SHR大鼠主动脉miR-21 *表达检测我们采用4周龄的SHR大鼠，通过尾静脉分别注射rAAV-miR-21 *和rAAV-anti-miR-21 *，病毒滴度IX IO11PFU/每只，至实验终点(8周后)时采用real-timePCR法检测SHR大鼠主动脉中miR-21 *的表达情况，结果显示rAAV_miR-21 *处理可明显增加主动脉miR-21 *的表达,而rAAV-anti-miR-21 *处理可明显降低主动脉miR-21 *的表达(图 5)。2. SHR大鼠血压监测每2周测量一次尾动脉血压，结果显示rAAV-miR-21 *处理可明显降低SHR大鼠的收缩压水平，且呈时间依赖趋势，而rAAV-anti-miR-21 *处理可明显升高SHR大鼠的收缩压水平，也呈时间依赖趋势(图6A)。3. SHR大鼠心功能检测实验终点(8周后)时采用心内导管术法检测SHR大鼠心功能，方法如下按照美国Millar Instrument PowerLab 公司文献介绍及 MPVS-300 (MillarPressure-Volume System)仪器说明进行。腹腔注射戍巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠，固定于小动物手术台。颈部正中切口，钝性分离各层组织，暴露右颈总动脉鞘，游离约
I.5cm颈动脉；结扎颈动脉远心端，动脉夹夹闭近心端。将前端带有电极的P-V微导管(SPR-838, Millar Instruments,Houston,TX)经右颈总动脉插入至主动脉,通过压力-容积传导系统(Millar Instruments)连接 PowerLab/4SP A/D converter (ADInstruments,Mountain View, CA)记录信号,动态观察压力波形变化,稳定数分钟后记录动脉波形。将导管送入左心室，调整导管位置，直至稳定出现完整的压力-容积环图形，连续记录压力、容积变化20min，以获得稳态的血流动力学数据。分离右颈静脉，插管，弹丸式注射100 μ I15 %氯化钠，获得parallel volume (Vp)值，随后切开腹部组织,暴露下腔静脉，短暂阻断下腔静脉，获得前负荷减少时血流动力学数据。经pressure-volume analysis软件(PVAN)处理后获得血流动力学数据，观测指标包括心率(heart rate, HR)、左室收缩末压(LV end-systolic pressure, PES)、左室压力最大上升速率(maximal rates of rise ofventricular pressure,dP/dt max)和左室压力最大下降速度(maximal rates of declineof ventricular pressure, dp/dt min)。结果显示rAAV-miR-21 *处理可明显改善SHR大鼠的心脏功能，而rAAV-anti-miR-21 *处理可明显损伤SHR大鼠的心脏功能(图6B)。
权利要求
1.一种用于高血压和/或由高血压导致的各种并发症的基因治疗的重组腺相关病毒，其特征在于该载体系统包括包装质粒pXX9,辅助质粒phelper,真核表达载体pAAV_D (+),并在真核表达载体pAAV_D(+)内分别插入了人类hsa-miR-21 *或anti-hsa_miR-21 *表达序列。
2.如权利要求I所述的重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。
3.如权利要求I所述的重组腺相关病毒为分别表达人类hsa-miR-21*或anti-hsa-miR-21 *的重组腺相关病毒，其特征在于 1)pXX9:为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列； 2)phelper:为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了感染性复制所需序列，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量； 3)pAAV-D(+):真核表达载体，所用的是CMV启动子，有较强的表达效率，其含有多克隆位点，可以连接不同的目的基因；本发明PAAV-D (+)分别连接hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *表达序列(pAAV-D (+)-miR-21 *和 pAAV-D (+)-anti-miR-21 * );该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因。
4.如权利要求I所述的重组腺相关病毒是分别表达hsa-miR-21*和anti-hsa-miR-21* 的重组腺相关病毒 rAAV-miR-21 *和 rAAV-anti-miR-21 '
5.如权利要求I所述的重组腺相关病毒为分别插入重组腺相关病毒表达载体的人类hsa-miR-21 *和反义anti-hsa-miR-21 *表达序列,其特征在于该序列由人工设计、化学方法合成。
6.该发明为一种药物制剂组合物，其特征在于它包括有效量的权利要求I所述的分别表达人类hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的两种重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。
8.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于该重组腺相关病毒是分别表达人类hsa-miR-21 *和 anti-hsa-miR-21 * 的重组腺相关病毒 rAAV-miR-21 *和 rAAV-anti-miR-21ο
9.一种制备分别表达人类人类hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的重组腺相关病毒的方法，其特征在于 1)提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列pXX9质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的序列一Phelper质粒； 2)提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pAAV-D(+)，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并分别插入hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *表达序列，分别形成重组质粒 pAAV_D (+) _miR_21 *和 pAAV_D (+) _anti_miR_21 * ； 3)将步骤2)中获得的 pAAV-D (+) -miR-21 *和 pAAV_D (+) -anti-miR-21 *分别与 pXX9、phelper质粒共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度； 4)将步骤3)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入高血压动物体内，检测其生物学活性。
10.根据权利要求书9所述的方法，其特征在于在步骤3)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法；真核表达载体pAAV-D(+)所含启动子为CMV启动子；用乙醇纯化，用real-timePCR法检测滴度。
全文摘要
本发明涉及能调控人类miRNA-21＊的重组腺相关病毒重组体(rAAV-miRNA-21＊/rAAV-anti-miRNA-21＊)的构建和制备方法，更具体地说涉及hsa-miR-21＊及反义序列hsa-anti-miR-21＊的克隆及含hsa-miR-21＊和hsa-anti-miR-21＊的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。hsa-miR-21＊长21nt，为非编码RNA，利用化学合成法构建pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊表达质粒，利用三种质粒磷酸钙共转染法包装制备含目的片段的重组腺相关病毒并纯化，其中pAAV-D(+)-miR-21＊明显自发性高血压大鼠的血压水平、同时改善心脏功能。因此，确定含hsa-miR-21＊表达序列的重组腺相关病毒成为用于高血压及其他相关疾病的临床治疗药物的可能性。
文档编号C12N15/864GK102965347SQ20121006922
公开日2013年3月13日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者汪道文, 陈琛, 王峰, 杨盛兰, 马飞 申请人:汪道文, 陈琛, 王峰