一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒 包装系统。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一，目前临床治 疗方法主要是采用放射治疗及化学疗法。然而，有些恶性肿瘤对放射治疗不敏感，对化疗易 产生耐药性，而且这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞 而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖 于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也取决于该特异性标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
[0003] 端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞每分裂一次，端粒就会缩短， 当端粒缩短至一定程度时会导致细胞死亡。而当细胞发生恶变时，其端粒酶被激活，使肿 瘤细胞分裂所致端粒的缩短进一步延长，从而维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡获得永 生，最终导致肿瘤细胞不断增值，因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生及发展过程中其关键作 用。端粒酶在大约90%肿瘤细胞均阳性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，因此端粒 酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记。到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成：1)RNA组分 (hTERC) ;2)端粒酶结合蛋白（TEP1) ;3)端粒逆转录酶（hTERT)。最近研究表明端粒逆转录 酶（hTERT)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒逆转录 酶呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。
[0004] 正常细胞的能量主要来源于葡萄糖，氧供应充足的情况下正常的细胞组织主要通 过糖酵解和线粒体呼吸两个步骤，将葡萄糖氧化成二氧化碳和水，为细胞生物活动提供能 量，氧供应不足的时候依靠糖酵解供应能量。恶性肿瘤细胞即使在氧供应充足的条件下，仍 然有高的糖酵解比例是恶性肿瘤能量代谢方面的一个特异性的表现，80年前OttoWarburg 在肝癌细胞中首先发现这个现象，该现象被称为Warburg效应。己糖激酶是糖酵解和能 量代谢的调节者，恶性肿瘤细胞中己糖激酶II (HKII)表达增高。HKII是目前研究最多 的肿瘤细胞糖酵解酶。Ko等人通过动物实验显示，HKII药物抑制剂（3-BrPA)局部和全 身用药可杀灭大部分肝移植瘤和肺转移瘤，但对癌周正常肝组织和其他主要脏器无损害 作用，抑制HKII对化疗耐药的肿瘤细胞同样有明显的杀伤作用（Ko YH，Pedersen PL， Geschwind JF. Glucose catabolism in the rabbit VX2tumor model for liver cancer ： characterization and targeting hexokinase[J]. Cancer Lett. 2001，173(1) :83_91)〇 HKII在恶性肿瘤中的高度表达，是恶性肿瘤的生物学特征，也是肿瘤生存的需要。
[0005] 近年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们已完成了多个病毒全 部基因组的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病 毒基因进行改造，改造后的病毒对肿瘤细胞的感染、复制增殖和溶解细胞的能力有效增强， 而对正常细胞这种能力减弱甚至消失，因此这种病毒能在肿瘤细胞内进行选择性复制。目 前研究最深入的溶瘤病毒包括I型单纯疱疹病毒-l(HSV-l)和腺病毒（ADV)等。腺相关病 毒（AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒，AAV具有安全性好、 宿主范围广、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转载 体之一，但是其在溶瘤方面的应用研宄还未见有报道。
[0006] 构建重组AAV需要有AAV ITR序列（倒转末端重复序列）、Rep和Cap基因、宿主 细胞和辅助病毒。目前在基因治疗研究中所用的AAV载体多数由2型AAV改造而来，AAV-2 的ITR序列中包含了复制、包装、拯救及整合的信号；外源基因表达盒可完全取代AAV的编 码序列，Rep和Cap基因产物则可由另一个质粒反式提供；AAV复制常用的辅助病毒为腺病 毒，而腺病毒的辅助功能由Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因提供。
【发明内容】
[0007] 本发明利用端粒酶和糖酵解作为肿瘤细胞的特异性标记，采用三质粒共转染法转 染细胞包装腺相关病毒，其中Adv-hTERT-Ep-Ela辅助质粒携带有腺相关病毒增殖必须的 辅助腺病毒Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因，pHKII-AAV-RC包装质粒携带有腺相关病毒 增殖必须的Rep和Cap基因，表达载体质粒携带有腺相关病毒复制必须的ITR序列。同 时，应用端粒逆转录酶（hTERT)启动子来调控Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因，己糖激酶 II (HKII)启动子来调控Rep基因，从而使该腺相关病毒包装系统只能在同时具有端粒逆转 录酶（hTERT)活性和己糖激酶II (HKII)活性的靶细胞中表达，这种修饰后的腺相关病毒包 装系统具有极高的肿瘤细胞靶向性。
[0008] 本发明公开的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于：该 包装系统中腺相关病毒增殖必须的辅助腺病毒Ela、Elb、E2a、E4和VARNA基因受端粒逆 转录酶（hTERT)启动子的有效控制，包装质粒的R印基因受己糖激酶II(HKII)启动子的有 效控制。
[0009] 上述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于该包装系统 由以下质粒构成：
[0010] (1) hTERT启动子调控的腺相关病毒辅助质粒Adv-hTERT-Ep-Ela ;
[0011] (2)HKII启动子调控的腺相关病毒包装质粒pHKII-AAV-RC
[0012] (3)腺相关病毒表达载体质粒。
[0013] 上述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于采用三质粒 共转染法转染细胞包装腺相关病毒。
[0014] 上述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于所述的共转 染方法是电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质或病毒介导的转染方 法。
[0015] 上述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于所述的共转 染方法是脂质体转染法。
[0016] 上述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于所述的包装 细胞为J1EK293细胞、人肝癌细胞（HepG2)、人肺癌细胞（A549)、MCF-7 (人乳腺癌细胞）和 支气管气道上皮细胞（NHBEC)中的任意一种。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明公开腺相关病毒包装系统只能在同时具有端粒逆 转录酶（hTERT)活性和己糖激酶II(HKII)活性的靶细胞中表达，这种修饰后的腺相关病毒 包装系统能在肿瘤细胞中正常表达，包装出腺相关病毒，而在正常细胞中表达极低，具有极 高的肿瘤细胞靶向性；本发明公开的腺相关病毒包装系统为研究溶瘤腺相关病毒奠定了基 础，对生物治疗肿瘤具有极大的促进作用。
【附图说明】
[0018] 图1为pHKII-AAV-RC质粒构建过程图；
[0019] 图2为病毒滴度结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（算三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例1构建hTERT启动子调控的腺相关病毒辅助质粒
[0022] 构建含有端粒逆转录酶基因启动子质粒Adv-hTERT-Ep-Ela(具体方法参见张琪， 一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途，CN1219055C)。
[0023] 实施例2构建HK-II启动子调控的腺相关病毒包装质粒
[0024] 构建含有HK-II启动子质粒pUC-HK-II (由上海生工合成，具体参见MathupalaSP. Glucose catabolism in cancer cells. Isolation, sequence, and aetivity of the promoter for type II hexokinase[J]. BiolChem，1995,270:16918-16925)，用Hindlll单 酶切线性化，并回收pUC-HK-II质粒酶切产物，详细步骤参见（TAKARA胶回收试剂盒）。
[0025] 将pAAV-RC质粒（Stratagene公司）用限制性内切酶Xmal和Xbal双酶 切（TAKARA)，胶回收片段大小4253bp的片段。采用补平连接试剂盒，将pAAV-RC质粒 的酶切回收片段，经连接插入线性化的pUC-HK-II质粒中，测序验证（详细步骤参见 TAKARA，BluntingKination Liagtion(BKL)Kit)，其构建过程如图 2 所示，构建出质粒 pUC-HK-11-AAV-RC，命名为 pHKII-AAV-RC。