[0026] 实施例3构建pAAV-IRES-ZsGreen腺相关病毒表达载体
[0027] pAAV-IRES-ZsGreen载体构建以质粒pLVX-IRES-ZsGreen (深圳百恩维生物科技 有限公司）为模板，PCR方法扩增IRES-ZsGreen，在上游引物IZF中引入Hindlll和Spel， 下游引物IZR中引入Bglll，设计PCR引物序列如下：
[0028]IRES-ZsGreen-F(IZF) :5, -GTGCAAGCTTACTAGTCTAGTGCCCCTCTCCCT-3，（SEQID NO. 1)
[0029]IRES-ZsGreen-R(IZR) :5'-CTAGAGATCTTTCAGGGCAAGGCGGAG-3'（SEQIDNO. 2)
[0030] 琼脂糖凝胶回收1283bp的目的条带。用Hindlll和BglII双酶切胶回收产物及 载体质粒 PAAV-MCS (Stratagene公司），用连接酶将具有黏性末端的两个酶切产物连接后， 转化感受态DH5 a (TAKARA)菌株，Amp平板筛选阳性克隆，用Hindlll和Bglll双酶切鉴 定，鉴定正确的重组克隆进行测序验证，验证正确的质粒标记为pAAV-IRES-ZsGreen (详细 操作步骤参见：陈如意.hIL-2与ZsGreen双基因共表达腺相关病毒的包装及鉴定[J].浙 江中医药大学学报，2014, 38 (7) :875-880)。
[0031] 实施例4肿瘤特异性腺相关病毒包装系统病毒包装
[0032]本发明使用HEK293细胞、人肝癌细胞〇fepG2)、人肺癌细胞（A549)、MCF-7 (人乳 腺癌细胞）和支气管气道上皮细胞株（NHBEC)(上述细胞均购自中科院上海细胞库），分别 转染构建的肿瘤特异性腺相关病毒包装系统。各细胞包装腺相关病毒详细步骤方法均参照 下述293细胞包装步骤。
[0033] 1、293细胞的复苏
[0034] ①设置温度为37-42 °C的水浴；
[0035] ②查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞，迅速丢入水浴锅中并 快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解；
[0036] ③将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀 后离心，1000rpm/min，5min;
[0037] ④去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混勾沉淀后，转入6cm培养皿；
[0038] ⑤将培养皿平稳放入37°C、5% 0)2和95%相对湿度的培养箱中培养。
[0039] 2、AAV包装和浓缩
[0040] ①质粒扩增
[0041] 构建好的AAV载体及包装、辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于lug/ul，A260/280 在1. 7-1. 8间方可用以包毒。使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。
[0042] ②传293细胞
[0043] 将培养293细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4°C冰箱取出的0.25%胰酶，使 其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部 晃下，加入3mL 37°C水浴中预热的10% DMEM，用10mL移液管进行吹打，吹打6-8次，不留死 角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。 之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混勾后的细胞于1. 5mL eppendorf管 中，加入450ul 10% DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。传代当天 记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75 ;若第三天转染，铺350-400万/T75。 每瓶T75加10mL 10%DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90%满即可进行转染。
[0044] ⑨脂转染HEK293细胞
[0045] 采用脂质体转染法将phTERT-Helper、pHKII-AAV-RC和pAAV-IRES-ZsGreen共转 染HEK293细胞。转染体系及试剂使用Lipofectamine? 2000(invitrogen公司），转染详 细步骤参照转染说明书。转染体系如下：
[0046]
[0047] ④AAV病毒收毒
[0048] 1)准备一个干冰乙醇浴和37°C水浴；
[0049] 2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培 养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；
[0050]3) 1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1mlPBS 重悬；
[0051] 4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C水浴中反复转移，冻融四次。
[0052] ⑤AAV病毒浓缩
[0053] 1) 10, 000g离心去除细胞碎片，将离心上清液转移到一个新离心管中；
[0054] 2)将两次收集的上清混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质；
[0055] 3)加入1/2体积的1M NaCl，10% PEG8000溶液，混合均匀，4°C过夜；
[0056] 4) 12000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用 0. 22um滤器过滤除菌；
[0057] 5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)，合上管 盖，颠倒几次以充分混合，在37°C孵育30分钟；
[0058] 6)用0.45ym过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒，保存-80°C。
[0059] 3、病毒滴度测定
[0060] 铺8个六孔板的HEK293细胞，每孔板的接种细胞数量为2xl0 5个/孔，培养12h 后，分别加入5ul浓缩得到的AAV病毒。48h后，以流式细胞仪检测细胞GFP标记阳性率，病 毒滴度按（TU/ml) = (2X105X细胞eGFP+率）/病毒原液体积计算，其结果见图2。
[0061] 结果显示，本发明公开的腺相关病毒包装系统能够在肿瘤细胞中正常表达，包装 出腺相关病毒，而在正常细胞中表达量极低。因此，本发明公开的腺相关病毒包装系统具有 肿瘤细胞靶向性，为研究溶瘤腺相关病毒治疗肿瘤奠定了基础，对生物治疗肿瘤具有极大 的促进作用。
[0062] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在于：该包装系统中腺相 关病毒增殖必须的辅助腺病毒Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因受端粒逆转录酶（hTERT)启 动子的有效控制，包装质粒的Rep基因受己糖激酶II (HKII)启动子的有效控制。2. 根据权利要求1所述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在 于该包装系统由以下质粒构成： (1) hTERT启动子调控的腺相关病毒辅助质粒Adv-hTERT-Ep-Ela (2) HKII启动子调控的腺相关病毒包装质粒pHKII-AAV-RC (3) 腺相关病毒表达载体质粒。3. 根据权利要求1或2所述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特 征在于采用三质粒共转染法转染细胞包装腺相关病毒。4. 根据权利要求3所述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在 于所述的共转染方法是电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质或病毒 介导的转染方法。5. 根据权利要求3所述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在 于所述的共转染方法是脂质体转染法。6. 根据权利要求3所述的一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统，其特征在 于所述的细胞为J1EK293细胞、人肝癌细胞（HepG2)、人肺癌细胞（A549)和支气管气道上皮 细胞（NHBEC)中的任意一种。
【专利摘要】本发明公开了一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统。该包装系统中腺相关病毒增殖必须的辅助腺病毒E1a、E1b、E2a、E4和VARNA基因受端粒逆转录酶(hTERT)启动子的有效控制，包装质粒的Rep基因受己糖激酶II(HKII)启动子的有效控制，该腺相关病毒包装系统只能在同时具有hTERT活性和HKII活性的靶细胞中表达，这种修饰后的腺相关病毒包装系统具有极高的肿瘤细胞靶向性。其为研究溶瘤腺相关病毒奠定了基础，对生物治疗肿瘤具有极大的促进作用。
【IPC分类】C12N15/863
【公开号】CN105039404
【申请号】CN201510364217
【发明人】周勇, 温平, 申友锋, 唐秋月, 何燕, 刘兰兰, 向垚艮, 何久香
【申请人】重庆高圣生物医药有限责任公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日