专利名称：一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及微生物培养基和微生物发酵工艺；更具体的，本发明涉及一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。
背景技术：
近年来随着海洋药物的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视，褐藻胶便是其中之一。褐藻胶又称褐藻酸钠，是从海带、马尾藻、巨藻中提取的天然高分子多糖聚合物，主要由两种糖醛酸单体聚合而成。褐藻胶具有广泛的应用价值，褐藻胶降解物具有很强的生物活性，以酶法降解褐藻胶为代表的生物降解取代传统的化学降解已成为趋势。褐藻胶裂解酶通过β -消去机制催化褐藻胶的降解在非还原端C4，5间形成不饱和双键，根据作用底物的不同可分为甘露糖醛酸裂解酶(EC4. 2. 2. 3)和古罗糖醛酸裂解酶(EC4. 2. 2. 11)。褐藻胶裂解酶可降解藻类细胞壁制备原生质体，用于藻类基础研究，也可用于研究Fucus细胞壁的发育，甚至作为解聚酶系统的一部分用来研究固氮菌的动力学。另外，褐藻胶裂解酶本身具有一定的药用价值，褐藻胶裂解酶能降解绿脓杆菌的细胞膜，恢复病原菌对抗生素的敏感性，用于辅助治疗绿脓杆菌引起的慢性感染，用其治疗肺部囊性纤维化一直是研究褐藻胶裂解酶的重要目标之一。因此褐藻胶裂解酶的研究生产有着深远的理论意义和应用价值。近年来，随着褐藻胶裂解酶越来越多的应用于医药、食品、化工、农业、分子生物学、海洋生物学等领域，褐藻胶裂解酶日益成为海洋生物资源研究开发的竞争热点。目前国内外对褐藻胶低聚糖的研究工作主要集中在1、褐藻胶酵解工艺的研究；2、特定褐藻胶低聚糖分子片段的提取和纯化；3、褐藻胶低聚糖的生理活性的开发和应用等方面。迄今为止， 国内外市场均未见有褐藻胶裂解酶制剂的产品，也没有生产性的酶解褐藻胶产物的产品。中国海洋大学从马尾藻表面分离得到一株产生高效胞外褐藻胶裂解酶的海洋弧菌Vibrio sp. QY102，其产生的褐藻胶裂解酶活性高、pH稳定范围广，甘露糖醛酸活性高于古罗糖醛酸活性，具有重要的开发应用价值。然而原始菌株在现有培养条件下的产酶量较低，且国内外鲜有关于原始菌株产褐藻胶裂解酶的发酵研究的报告。建立褐藻胶裂解酶的发酵工艺对于大规模生产褐藻胶裂解酶并促进其在工农医等领域的应用十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。在本发明的第一方面，提供一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法，该方法包括将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中培养，待海洋弧菌生长到对数生长期末期时，每1-6小时添加褐藻胶O. 2_6g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶，至发酵结束。在一个优选例中，所述的海洋弧菌是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌。
在另一优选例中，所述的海洋弧菌选自海洋弧菌Vibrio Sp.QY102，海洋弧菌 Vibrio sp. QY101,海洋弧菌 Vibrio sp. QY103。在另一优选例中，每2-5小时添加褐藻胶O. 3_4g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。在另一优选例中，每3-4小时添加褐藻胶O. 5_3g/L(较佳地,为lg/L)。在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有可溶性淀粉3_7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氢钾l_3g/L，七水硫酸镁O. 06-0. 20g/L,氯化钠 20-50g/L,混合于水(较佳地，为去离子水)中。在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有可溶性淀粉4_6g/L，蛋白胨3-5. 5g/L，酵母提取物I. 5-4g/L，磷酸二氢钾I. 5-2. 5g/L，七水硫酸镁O. 08-0. 15g/L，氯化钠30-50g/L，混合于水中。在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有可溶性淀粉4.5-5. 5g/L， 蛋白胨4-5g/L，酵母提取物I. 8-3g/L，磷酸二氢钾I. 5_2g/L，七水硫酸镁O. 08-0. 12g/L，氯化钠40-45/L，混合于水中。在另一优选例中，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。在另一优选例中，所述的海洋弧菌生长到对数生长期末期为菌体生长到0D_值 3. 5-4. 5 (较佳地为4. O)的时期。在另一优选例中，初始培养时，培养基的pH值是5±1 (较佳地5±0. 5 ;较佳地 5±0· 2)。在另一优选例中，初始培养之后的整个培养过程不再调节pH值。在另一优选例中，将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中的接种量为3 10% (v/v),如 5% (ν/ν) ο在另一优选例中，将按照OD6tltl为2±0. 2的海洋弧菌种子液接种到以淀粉为碳源
的培养基中。在另一优选例中，种子培养是在30°C，175r/min摇床培养10 12h ;按照菌体浓度OD6tltl约为2. O的所述种子液接种到发酵罐中，接种量为3 10% (ν/ν)。在另一优选例中，培养条件为30±2°C，350±100r/min，通气O. 2_2vvm(较佳地， 1±0· 3vvm)，罐压 O. 02±0· OlMPa0在另一优选例中，在发酵结束后，还包括步骤从发酵培养基中分离或纯化褐藻胶裂解酶。在本发明的另一方面，提供一种培养海洋弧菌的培养基，含有可溶性淀粉3_7g/ L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氢钾l_3g/L，七水硫酸镁O. 06-0. 20g/L，氯化钠 20-50g/L。在另一优选例中，所述的培养基中，各组分混合于水(较佳地，为去离子水)中。较佳地，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。在另一优选例中，所述的培养基中，含有可溶性淀粉4_6g/L，蛋白胨3-5. 5g/L， 酵母提取物I. 5-4g/L,磷酸二氢钾I. 5-2. 5g/L，七水硫酸镁O. 08-0. 15g/L，氯化钠30_50g/ L0在本发明的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于培养海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I、发酵过程每3h添加3g固体褐藻胶的分批发酵的过程曲线，褐藻胶添加总量见实施例I。图2、发酵过程每3h添加Ig固体褐藻胶的分批发酵的过程曲线，褐藻胶添加总量与实施例I相同。图3、发酵过程每3h添加3g固体褐藻胶至发酵结束的分批发酵的过程曲线。图4、普通分批发酵过程曲线，褐藻胶在培养基配制时一次性加入。
具体实施例方式针对现有技术中难以大规模获得褐藻胶裂解酶的技术缺陷，本发明人经过深入的研究，第一次针对褐藻胶裂解酶生产菌株设计了适合大规模发酵的新型培养基，并基于代谢研究开发了新型的发酵工艺。如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了 “包含”、“主要由……构成(制成)”、 “基本上由......构成”、和“由......构成”。如本文所用，所述的“海洋弧菌”是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌；例如选自:海洋弧菌Vibrio Sp.QY102，海洋弧菌Vibrio sp.QYIOl， 海洋弧菌Vibrio Sp.QY103。所述的海洋弧菌产的褐藻胶裂解酶AlyVIII是一种诱导酶。 褐藻胶既可以作为其生长的底物也可以作为其产酶的诱导物。本发明人在深入研究后发现，对于这类海洋弧菌来说，褐藻胶作为碳源相对淀粉来说更易被利用，淀粉也不会阻遏酶表达，在培养基中预加淀粉可以延迟菌体进入衰亡期从而延长菌体的产酶期，并且由于其代谢缓慢而延缓发酵液PH的上升，更有利于菌体生长。因此，本发明人采用以下策略来优化菌体产酶以淀粉为基础碳源支持菌体的生长，待菌体进入对数生长期末期时，菌体浓度已达到一个较高水平(0D_约为4. O)，且菌体活性未出现明显下降，于此开始添加褐藻胶诱导菌体产酶。结果发现，与普通分批发酵相比，酶产量有很大提高。培养基本发明人优化了用于海洋弧菌发酵的培养基，所述的培养基中包含可溶性淀粉、 蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾、七水硫酸镁和氯化钠。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表I所示。表I
权利要求
1.一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，该方法包括将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中培养，待海洋弧菌生长到对数生长期末期时，每1-6小时添加褐藻胶0. 2-6g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶，至发酵结束。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的海洋弧菌是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，每2-5小时添加褐藻胶0.3-4g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以淀粉为碳源的培养基含有可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氢钾l_3g/L，七水硫酸镁0.06-0. 20g/L,氯化钠20-50g/L，混合于水中。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的海洋弧菌生长到对数生长期末期为 菌体生长到OD600值3. 5-4. 5的时期。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，初始培养时，培养基的pH值是5±1。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，培养条件为30±2°C，350±100r/min，通气0.2-2vvm，罐压 0. 02±0. OlMPa0
9.一种培养海洋弧菌的培养基，其特征在于，含有可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/ L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氢钾l_3g/L，七水硫酸镁0. 06-0. 20g/L，氯化钠20_50g/L。
10.权利要求9所述的培养基的用途，用于培养海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。
全文摘要
本发明涉及一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。提供了针对褐藻胶裂解酶生产菌株设计的适合发酵以及高产褐藻胶裂解酶的新型培养基，并提供了利用海洋弧菌高产褐藻胶裂解酶的新方法。
文档编号C12N1/20GK102586216SQ20121006885
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者周久顺, 周祥山, 张元兴, 蔡孟浩 申请人:华东理工大学