欧亚类禽型h1n1猪流感病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种欧亚类禽型H1N1猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。本发明通过序列多重比对，针对欧亚类禽型H1N1猪流感病毒、甲型H1N1(2009)猪流感病毒、经典型H1N1猪流感病毒及人源H1N1猪流感病毒的保守基因片段，设计出特异性强的检测欧亚类禽型H1N1猪流感病毒的引物和探针，用于实时荧光RT-PCR检测。实验结果表明使用本发明所提供的试剂盒检测欧亚类禽型H1N1猪流感病毒，特异性高，对病毒RNA检测灵敏度可达4.6×10-7ng/反应，不仅可以对待测猪群的鼻腔拭子、肺脏，气管等组织样品进行检测，还可检测鸡胚尿囊液，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，可成为欧亚类禽型H1N1猪流感病毒疫病诊断和流行病学调查的有用检测工具。
【专利说明】欧亚类禽型H1N1猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定欧亚类禽型HlNl猪流感病毒实时荧光检测方法及试剂盒。 本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 猪流感（Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道 传染病。世界各地流行猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV)包括3种主要的亚 型：H1N1、H3N2和H1N2亚型，其中又包括不同的基因型：经典型HlNl[Classical swine HlNl influenza A virus, (CS)HlNl]、人源 HlNl 流感病毒[Human HlNl influenza A virus, (hu)HlNl]、欧亚类禽型 HlNl[Eurasian avian-like swine H1N1，（EA)H1N1]、甲型 HlNl流感病毒[pandemic (HlNl) 2009, pHlNl/2009]、人源H3N2、基因重排的H3N2以及多基 因型的H1N2亚型等。SIV自发现以来，已经在我国猪群内建立了稳定的遗传谱系。猪流感 病毒能导致猪的呼吸道疾病，以高发病率和低死亡率为特征，是严重影响养猪业发展的一 种重要的传染病。猪的呼吸道上皮具有人流感病毒和禽流感病毒的受体，被认为是流感病 毒的"混合器"。研宄表明，不同亚型流感病毒感染同一宿主后，可以发生基因片段的重排， 通过基因重排有可能产生高致病性毒株和高传播能力毒株。我国是动物流感高发国家，动 物与人接触频繁，动物流感病毒在一定条件下可以跨越种间屏障传播给人，并可能适应人 作为宿主，进一步可能造成人际之间的传播。猪是禽、猪、人流感病毒共同易感宿主，被认为 是人流感病毒和禽流感病毒的混合器，这些病毒在猪体内可发生基因重排。猪流感病毒HA 受体结合位点（RBS)具有与人、禽流感病毒受体相同的结合特异性，决定了 SIV不仅可感染 猪，同时也具有感染禽和人类的能力。我国多种亚型的流感病毒以及同一个亚型、不同基因 型病毒协同共存的流行状况为病毒进一步在猪体内发生基因变异或基因重配提供了有利 条件与重要场所。Hl亚型猪流感病毒曾经是人间流感大流行毒株的供体。1986年至今全 世界共有6例人感染（EA)HlNl流感病毒报道，其中我国2010年与2012年分别有两例人感 染（EA)HlNl事件，目前尚未在人群中引起大的流行；但有研宄报道称人群中抗体水平不足 以抵抗（EA)HlNl病毒攻击。2005年至今，在我国猪群中可持续性监测到（EA)HlNl流感病 毒，目前与PH1N1/2009流感病毒一起共同流行于我国猪群当中，为流行范围最广泛的优势 毒株。同时，我国猪群中也出现了（EA)HlNl与pHlNl/2009病毒发生基因重排产生的重组病 毒，这些病毒的流行对我国养猪业发展造成了巨大的经济损失的同时，也对人类的生命和 健康造成了严重的威胁，因此，建立一种针对欧亚类禽型（EA)HlNl亚型猪流感病毒的检测 试剂盒，既可满足猪群流感病毒监测的需要，又可为人间流感大流行的预警提供一种有效 的检测方法。目前SIV诊断方面也有大量的研宄报道，但研宄内容仅限于通用型基因检测 和亚型检测，根据我国SI流行病学调查情况，目前我国猪群中存在（EA)HlNl、pHlNl/2009、 (〇5)11謂1及〇111)11謂1等不同谱系的111亚型51￥，其中出4)11謂1、？11謂1/2009为优势毒株， 但是目前没有完全可区分（EA)HlNl和pHlNl/2009荧光定量PCR诊断方法。本研宄建立的 荧光定量PCR旨在为我国猪群中存在的（EA)HlNl快速鉴别诊断提供方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种鉴定欧亚类禽型HlNl猪流感病毒实时荧光检测方法及 试剂盒。
[0004] 本发明的一种欧亚类禽型HlNl猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征 在于包括一对特异性引物和荧光探针，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成，所述 特异性引物和荧光探针序列如下：
[0005] 上游引物：5' -CTCAGCAAGTCATACACAA-3' ；（SEQ ID NO. 1)
[0006] 下游引物：5' -CTGGTAGAGGGITTGITG-3' ；（SEQ ID NO. 2)
[0007] 特异性探针：5' -F - CACCACCCTCCGACCGACAG - Q-3'，其中F为荧光报告基团，Q为 荧光淬灭基团（SEQ ID NO. 3)。
[0008] 在本发明中，优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物， DNA聚合酶，逆转录酶以及RNA酶抑制剂，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常 识，可根据需要选用。
[0009] 在本发明中，优选的，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
[0010] 在本发明中，优选的，所述试剂盒中还包括欧亚类禽型HlNl猪流感病毒基因的 DNA标准品，所述标准品的核苷酸序列如下所示：
[0011] 5 ' TCCTATCCTAAGCTCAGCAAGTCATACACAAACAATAAGGGAAAGGAAGTGCTTGTAATTTGGGGAG TGCACCACCCTCCGACCGACAGTGACCAACAAA 3'（SEQ ID 勵.4所示）。
[0012] 在本发明中，优选的，所述特异性探针中F与Q的选择为下列组之一 ：F为FAM，Q为 BHQl ;F 为 VIC，Q 为 BHQl ;F 为 TAMRA，Q 为 BHQ2 ;F 为 ROX，Q 为 BHQ2 ;F 为 CY5, Q 为 BHQ3。
[0013] 进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定欧亚 类禽型HlNl流感病毒试剂中的应用。
[0014] 上述特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针的制备方法也属于本发明的保护范围。 该制备方法具体可包括将所述特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针中所述三条单链DNA 分别单独包装的步骤。
[0015] 本发明所提供的特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针可检测不同来源的类禽型 HlNl流感病毒，尤其适合检测欧亚类禽型HlNl猪流感病毒。
[0016] 本发明所提供的特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针用于检测欧亚类禽型HlNl 猪流感病毒的特异性高，对病毒RNA检测灵敏度可达4. 6X KT7ng/反应，不仅可以对待测 猪群的鼻腔拭子、肺脏，气管等组织样品进行检测，还可检测鸡胚尿囊液，操作简单、容易推 广，便于基层操作和应用，可成为欧亚类禽型HlNl猪流感病毒疫病诊断和流行病学调查的 有用检测工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的欧亚类禽型HlNl特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针的特异性 检测结果；
[0018] I :(EA)H1N1 RNA ;2 : (CS)HlNl RNA ;3 :pHlNl/2009、（Hu)HlNl、H1N2、H3N2、H5N1、 H9N2、PRRSV RNA和阴性对照。
[0019] 图2为本发明的欧亚类禽型HlNl特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针敏感性检 测结果；
[0020] 通过对456ng病毒RNA进行10倍梯度稀释至4. 6Xl(T7ng/反应，用于进行敏感性 试验，最低可检测到含量为4. 6 X KTng/反应的病毒RNA。
[0021] I : (EA)HINIRNA 456ng/ 反应；2 :45. 6ng/ 反应；3 :4. 6ng/ 反应；4 :4. 6X KT1ng/ 反应；5 :4. 6X10_2ng/ 反应；6 :4. 6X10_3ng/ 反应；7 :4. 6X10_4ng/ 反应；8 :4. 6X10_5ng/ 反应；9 :4. 6 X 10_6ng/ 反应；10 :4. 6 X KTng/ 反应
[0022] 图3为采用本发明建立的荧光定量RT-PCR方法对临床样品进行检测的结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。应当 理解的是，以下所述的实施例，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的 范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术 方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。下述实施例 中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 下述实施例所使用的病毒毒株信息如表1所示：
[0026] 表1毒株名称及类型
[0027]
【权利要求】
1. 一种欧亚类禽型H1N1猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括一 对特异性引物和荧光探针，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成，所述特异性引物 和荧光探针序列如下： 上游引物：5' -CTCAGCAAGTCATACACAA-3' ； 下游引物：5' -CTGGTAGAGGGITTGITG-3' ； 特异性探针：5' -F-CACCACCCTCCGACCGACAG-Q-3'，其中F为荧光报告基团，Q为荧光淬 灭基团。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合 物，DNA聚合酶，逆转录酶以及RNA酶抑制剂。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
4. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于还包括欧亚类禽型H1N1猪流感病毒基 因的DNA标准品，所述标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述特异性探针中F与Q的选择为下列组 之一：F 为 FAM，Q 为 BHQ1 ;F 为 VIC，Q 为 BHQ1 ;F 为 TAMRA，Q 为 BHQ2 ;F 为 ROX，Q 为 BHQ2 ; F 为 CY5，Q 为 BHQ3。
6. 权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定欧亚类禽型H1N1流感病 毒试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104450955SQ201410641147
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】杨焕良, 陈艳, 陈化兰, 乔传玲 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所