一种重金属低积累的转基因植物的培育方法
【专利摘要】本发明涉及转基因植物的培育，具体提供了一种重金属低积累的转基因植物的培育方法，通过异源表达酵母中重金属外运通道蛋白以培育低积累重金属安全农作物。所述培育方法具体通过根表皮细胞膜特异性启动子驱动酵母Ycf1p基因在农作物根系的细胞膜中异源表达，使得植物能够将进入植物根系的重金属经细胞膜上的金属外向转运蛋白排出到植物体外，获得重金属低积累的农作物，从而达到在重金属污染的土壤上，通过种植低吸收、低积累重金属的作物品种，生产符合安全标准的农产品的目的。其中，所述酵母Ycf1p基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Prp1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
【专利说明】一种重金属低积累的转基因植物的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因植物的培育，具体地说，涉及一种重金属低积累的转基因植物 的培育方法。
【背景技术】
[0002] 在我国，随着工农业生产的发展，土壤重金属污染问题已经越来越突出。土壤是植 物生长需要营养物质的储存库，因而土壤中重金属元素含量的多少在很大程度上决定了农 作物受污染的程度。重金属污染农田的治理是目前国际上难点和热点研究领域之一。科学 家们利用固定、过滤、离子交换及不溶化固定等多种理化学方法，试图净化重金属污染的土 壤，但这些技术的应用需要高价的装备和技术。况且像农耕土壤一样，污染轻微且污染面积 大的地方很难实际应用。近几年，对于重金属污染农田治理的研究工作主要集中在用于植 物修复的超级累植物筛选，这些植物大部分是野生的，生长速度慢，生物量低，修复时间长， 田间应用存在不确定性和种植难度。实际生产中投入到重金属污染土壤中的超积累植物的 净化效果远不如实验室条件下取得的效果。鉴于我国实际国情，将大面积中-轻度污染的 农田停止农作，进行长时间的植物修复或其它成本昂贵工程修复显然是不现实的。2006S. Herbette等人提出了污染安全的品种pollution-safecultivars(PSCs)的概念。即生长 在受污染的土壤，特定污染物在食用部分的积累水平足够低，符合质量标准，可供安全食用 的品种。面对农田资源的日趋减少和土壤重金属镉污染愈加严重的现状，筛选和培育低吸 收、低积累土壤中重金属的作物基因型，特别是利用基因工程培育低量积累重金属的作物 品种已成为保障农产品安全生产的主要研究方向。近年来，污染安全品种吸引了研究者和 育种公司更大的关注和兴趣。
[0003] 大多数重金属是植物非必需的微量元素，对植物有很强的毒性。超过一定的量会 抑制植物细胞生长，抑制氧化磷酸化，引发氧化胁迫，影响光合作用，损伤核仁和影响质膜 ATP酶的活力。一些植物通过诱导形成螯合肽、金属硫蛋白、植物应激蛋白等抵御重金属毒 害，也有的植物则通过细胞壁固定、液泡分隔、腺体分泌等途径来抵御毒害。植物的代谢产 物与重金属形成复合体后储藏在细胞内的液泡中，抑制毒性发作。
[0004] 基因是决定植物对土壤重金属吸收积累特性的最重要因素，低积累植物对重金属 的排斥机制通常认为包括两个方面，一是减少根部对重金属的吸收；二是重金属在根部通 过区室化保存，从而限制向地上部转移。但植物耐受、转运和富集镉是一个复杂的过程，涉 及转运蛋白家族、螯合蛋白家族、抗氧化系统等多个方面的参与。目前，植物中可以应用于 遗传改良基因工程的，对重金属排斥机制其主要的金属转运蛋白和关键调控因子仍未见报 道。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种重金属低积累的转基 因植物的培育方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重金属低积累的转基因植物的培育方 法，包括如下步骤：
[0007] (1)重组表达载体的构建：
[0008] 将酵母Ycflp基因克隆到农杆菌植物双元表达载体上，在限制性内切酶的作用下 连接含有Prpl启动子的T载体，得到在Prpl启动子驱动下表达Ycflp基因的表达载体；
[0009] (2)转基因植株的构建：
[0010] 将所得表达载体转入植物愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的培养液进行转化， 转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因阳性 植株；
[0011] 其中，所述酵母Ycflp基因的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示，Prpl启动子的核 苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0012] 进一步地，所述步骤（1)具体为：
[0013] 用内切酶SacI与Sail将Ycflp克隆到中间载体pGEM-5Z上得到pYcflp_5Z，将 pYcf lp_5Z用Sail和Spel酶切后，回收Ycf lp基因片段，再经T4连接酶连接到经Sail和 Spel酶切后的植物表达载体pCAMBIA1301上，再由BamHI酶切表达载体pCAMBIA1301和含 有Prpl启动子的T载体，连接后得到在根表皮细胞膜特异启动子Prpl驱动下的以潮霉素 为筛选标记的表达载体pCAMBIA1301-pRPl-Ycflp。
[0014] 本发明还提供了一种用于培育重金属低积累的转基因植物的载体，所述载体含有 酵母Ycflp基因与根表皮细胞膜特异启动子Prpl ;
[0015] 其中，所述酵母Ycflp基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，根表皮细胞膜特异 启动子Prpl的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0016] 本发明还提供了一种含有前述载体的工程菌。
[0017] 本发明还进一步提供了酵母Ycflp基因在培育重金属低积累的转基因植物中的 应用，具体为：
[0018] 将酵母Ycflp基因克隆到农杆菌植物双元表达载体上，在限制性内切酶的作用下 连接含有Prpl启动子的T载体，得到在Prpl启动子驱动下表达Ycflp基因的表达载体； [0019] 将所得表达载体转入植物愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的培养液进行转化， 转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因阳性 植株，所得转基因阳性植株通过表达酵母Ycflp基因，能够将通过主动运输和被动运输进 入植物根系的重金属经细胞膜上的金属外向转运蛋白排出到植物体外，从而达到降低植物 体重金属含量的目的。
[0020] 本发明所述培育方法可以应用于任何能够进行转基因的农作物中，在本发明的具 体实施方式中，以水稻为例实施本发明的技术方案。
[0021] 为了更好地提高污染土壤的生产力，优选所述植物为水稻。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明从提高污染土壤的生产力和保证农产品安全生产的角度入手，通过根表皮 细胞膜特异性启动子驱动酵母Ycf lp基因在农作物根系的细胞膜中异源表达，使转基因植 物获得对特定重金属的耐受性和排斥力。本发明方法为培育重金属低积累、高耐性、生长量 大的作物品种提供重要的应用和理论依据，也为提高污染土壤的生产力和保证农产品安全 生产提供了有效的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明所述pCAMBIA1301-pRPl_Ycflp表达载体图谱。
[0025] 图2为本发明实施例1中所述转基因水稻不同株系Ycflp基因southern杂交结 果。
[0026] 图3为本发明实施例1中所述转基因水稻不同株系Ycflp基因RT-PCR及northern 杂父结果。
[0027] 图4为本发明实施例1中不同转基因株系中水稻籽粒中重金属镉的含量。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0029] 实施例1重组载体的构建
[0030] 用内切酶SacI与Sail将Ycflp克隆到中间载体5Z上得到pYcflp_5Z，将p Ycflp-5Z用Sail和Spel酶切后，回收的Ycflp基因片段，T4连接酶连接到经Sail和Spel 酶切后的植物表达载体PCAMBIA1301上，由BamHI酶切表达载体和含有Prpl启动子的T载 体，链接后得到得到了在Prpl根表皮细胞膜特异启动子驱动下的以潮霉素为筛选标记的 表达载体pCAMBIA1301-pRPl-Ycflp(见图1)，用Quick柱大量提取质粒，用于水稻农杆菌转 化实验。
[0031] 实施例2转基因植株的构建
[0032] 1、转基因植物受体的准备
[0033] 成熟胚愈伤组织的获取：将成熟种子除去颖壳，在无菌条件下，用70%酒精中浸 泡3-5min，无菌水冲洗3次，在转入质量分数为0. 1 %升汞溶液中浸泡20min，无菌水冲洗 3?5次，用20%的次氯酸钠浸泡20min，其间不断摇晃，可放在摇床中，无菌水冲洗3? 5次，置于无菌滤纸上吸干水份，移入愈伤诱导培养基上，27°C暗培养约三天后去芽，一周 后当盾片膨大，胚乳变软时去掉米粒的胚乳部分，可见黄色愈伤长出，把剥下的胚性愈伤组 织，置于诱导培养基上，15天左右继代一次，继代2-3次后，选择生长迅速、质地松脆、颜色 鲜亮的愈伤组织用于农杆菌转化。
[0034] 2、农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤
[0035] (1)取200 ill感受态细胞，加入1 iig构建好的质粒DNA，液氮中速冻lmin，37°C水 浴5min，然后加入lmlYEB培养基，28°C慢速振荡培养4h ;以10, OOOrpm离心30s，弃上清， 加入0.lmlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于YEB平板上（100iig/mlKan，125iig/mlSm)， 28°C培养约48h。
[0036] (2)挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液（100 yg/mlKan，125 yg/ ml Sm)中，28°C振荡培养过夜；小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。
[0037] (3)将诱导好的愈伤转入新鲜的培养基中，光照培养3天。取摇好的农杆菌，集菌， 用含lOOumol乙酰丁香酮的YEB培养基悬浮并稀释一定倍数。
[0038] (4)将愈伤浸入稀释好的农杆菌悬浮培养基中悬浮20-30分钟。取出愈伤，用滤纸 将多余的菌液吸干，放到共培养培养基上，暗培养3天左右，直到有菌落长出。
[0039] (5)用0. 1M的甘露醇无菌液振荡清洗两次，用500mg/L的头孢霉素液清洗两次，至 上清完全澄清。
[0040] (6)取出愈伤，吸去多余的液体，放在恢复培养基上（500mg/L cef)，暗培养恢复三 天。
[0041] (7)将愈伤转入低浓度抗生素（30mg/L潮霉素）和500mg/L cef的筛选培养基上 筛选一个月左右。
[0042] (8)将愈伤转入高浓度抗生素（40mg/L潮霉素）和500mg/L cef的筛选培养基上 筛选一个月左右。
[0043] (9)将愈伤转入高浓度抗生素（50mg/L潮霉素）和500mg/L cef的筛选培养基上 筛选一个月左右。
[0044] (10)在MS基本培养基+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA的分化培养基见光分化。
[0045] (11)在1/2MS培养基+50mg/L潮霉素的生根培养基上筛选生根。
[0046] (12)在1/2MS转基因水稻幼苗生长培养基上长至3-4叶期且根系较发达时，将小 苗移入小花盆中，外罩塑料袋保温保湿；移至温室练苗5-7d后，去掉塑料袋；一周后移入大 田，直至开花结实。
[0047] 3、转基因阳性植株的筛选
[0048] 具体通过PCR对转基因植株中的Prpl启动子、Ycflp基因和pCAMBIA1301载体上 的HYG筛选基因的阳性率进行检测，初步筛选得到阳性植株S7、S9、S25、S30和S37。通过 RT-PCRSouthern，Northern的方法对初步筛选的转基因植株中的目标基因的整合和表达情 况进行检测，获得稳定表达的阳性株系。Southern结果（见图2)显示不同株系目的基因 Ycflp的插入情况，RT-PCR和Northern结果（见图3和图4)显示不同株系Ycflp基因的 表达强度，其中S7、S9和S37这四个株系，Ycflp基因均有较高的表达水平，S25株系表达 次之，而S30株系水稻中的Ycflp基因基本没有表达。
[0049] 4、检测植株中镉元素的含量
[0050] (1)选择某地的常年监测点进行大田试验，该监测点的土壤镉连续三年监测值平 均值为1. 86mg/kg，超过国家土壤环境质量标准中农林业生产和植物正常生长的土壤镉临 界值1.0mg/kg。将经过消菌处理的不同株系的转Ycflp基因水稻种子直接播种于土中。待 种子发芽一周后，根据幼苗的大小和长势情况间苗，每个处理重复3次并进行随机区组排 列，对筛选到的转基因阳性水稻株系的低积累镉特性在大田进行进一步的验证试验。
[0051] (2)重金属镉元素含量测定，土壤检测依据GB/T 17141-1997,蔬菜镉含量依据 GB/T 5009. 15-2003,用热电M6原子吸收分光光度计对水稻籽粒和土壤中的镉含量进行检 测。本实施方案供试土壤中镉含量为1. 93mg/kg，同一地块对照株系和转Ycflp基因不同阳 性株系S7、S9、S25、S30和S37水稻籽粒中镉含量分别为0. 0680、0. 0996、0. 0695、0. 0895、 0? 0998 到 0? 705mg/kg.
[0052] (3)从农产品安全的角度评价水稻是否具有较高的镉耐性和较低的积累量，即在 较高的镉污染下能够正常生长且生物量无显著下降，且在植物体内镉含量较低。具体通过 水稻的可食部位低于有关标准《食品中污染物限量GB2762-2012》中规定大米中镉限量标准 是0. 2mg/kg来评价。由本方法获得的水稻株系S7、S9、S25和S37,和对照相比，在超过国 家土壤三级标准的镉污染农田中，表现出对重金属较好的耐受和良好的低积累特性，可以 作为镉污染农田安全生产的备选品种。
[0053] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种重金属低积累的转基因植物的培育方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 重组表达载体的构建： 将酵母Ycflp基因克隆到农杆菌植物双元表达载体上，在限制性内切酶的作用下连接 含有Prpl启动子的T载体，得到在Prpl启动子驱动下表达Ycflp基因的表达载体； (2) 转基因植株的构建： 将所得表达载体转入植物愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的培养液进行转化，转化 后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因阳性植株； 其中，所述酵母Ycflp基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，Prpl启动子的核苷酸 序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（1)具体为： 用内切酶SacI与Sail将Ycflp克隆到中间载体pGEM-5Z上得到pYcflp-5Z，将 pYcf lp_5Z用Sail和Spel酶切后，回收Ycf lp基因片段，再经T4连接酶连接到经Sail和 Spel酶切后的植物表达载体pCAMBIA1301上，再由BamHI酶切表达载体pCAMBIA1301和含 有Prpl启动子的T载体，连接后得到在Prpl启动子驱动下的以潮霉素为筛选标记的表达 载体 pCAMBIA1301-pRPl-Ycflp。
3. -种用于培育重金属低积累的转基因植物的载体，其特征在于，所述载体含有酵母 Ycflp基因与根表皮细胞膜特异启动子Prpl ; 所述酵母Ycflp基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，根表皮细胞膜特异启动子 Prpl的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 含有权利要求3所述载体的工程菌。
5. 酵母Ycflp基因在培育重金属低积累的转基因植物中的应用，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 重组表达载体的构建： 将酵母Ycflp基因克隆到农杆菌植物双元表达载体上，在限制性内切酶的作用下连接 含有Prpl启动子的T载体，得到在Prpl启动子驱动下表达Ycflp基因的表达载体； (2) 转基因植株的构建： 将所得表达载体转入植物愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的培养液进行转化，转化 后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因阳性植株； 所述酵母Ycflp基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，Prpl启动子的核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
【文档编号】C12R1/01GK104450771SQ201410641117
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】栾云霞, 陆安祥, 王纪华, 李成, 付海龙 申请人:北京农业质量标准与检测技术研究中心