专利名称：重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法
技术领域：
本发明涉及重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法。
背景技术：
随着工业的发展和农业生产的现代化，土壤-植物-环境系统中重金属污染问题日趋严重。重金属污染不仅降低农作物产量和品质，导致土壤功能和质量的退化，影响农业生产的健康持续发展，而且通过径流和淋洗作用污染地表水和地下水，恶化水文环境，并可能通过直接接触、食物链等途径危及人类的生命和健康。目前我国的农田土壤受重金属的污染比较严重，尤其是镉、铅、锌等重金属的复合污染是个普遍现象，而且镉、铅等重金属的毒性较强，在土壤中无法自我分解而长期存在，因此对环境中的重金属污染的治理应该受到重视。
采用的物理化学修复技术(包括隔离包埋技术，固化稳定技术，化学稳定技术和电动修复技术等)治理重金属污染土壤的，从根本上来说并没有达到清除污染的目的，只是将重金属转移或固定在土壤中，减少重金属进入植物生态系统的量。而且，应用这些物理化学方法的往往耗资巨大，而且所用到的化学药剂还可能造成土壤的二次污染。而植物修复是利用重金属超积累或耐性植物治理土壤污染的一种新的环境生物技术，它是一条费用低廉、无继发污染、节约土地资源、环境友好和可持续发展的绿色新途径。植物修复的关键在于寻找或培育出能够忍耐和超积累一种或多种重金属、生物量较大、适应性较广且繁殖快速的特异种质资源。东南景天(Sedum alfredii Hance)是多年生草本植物，可无性繁殖，有许多分枝，花黄色，生命力较强，广泛分布于华中、华南和华东地区。东南景天是在我国东南部地区一些古老的铅锌矿上首次发现的一种镉、锌超积累植物，同时对铅具有富集作用，因此在这些重金属污染环境的植物修复中具有广泛的应用价值。大量研究证明，作为我国原生的超积累植物，东南景天相比国际上发现的超积累植物遏蓝菜(Thlaspi Caerulencens)具有生物量大，且适应性广、多年生并可以一年多次收割等优点，这对修复我国重金属污染环境具有广阔的应用前景。然而，它是一种野生植物，其种苗繁殖技术方面从无研究报道过。因此，发明该种植物东南景天种苗的繁殖方法，对促进污染环境植物修复技术推广应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法。
本发明的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，有茎段扦插，茎尖组织培养、叶片愈伤组织诱导等三种方案。
方案一重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，采用茎段扦插法，将东南景天剪成3cm以上带腋芽的茎段，直接扦插到到受重金属污染的土壤中，按传统农耕法管理生长，待植物生长至15cm～30cm收割地上部，作为种苗再次被剪成3cm以上带腋芽的茎段，扦插到污染环境的土壤中；或者将东南景天剪成3cm以上带腋芽的茎段，直接扦插到育苗基质或营养液中，按传统农耕法管理生长，得到种苗。
上述的育苗基质是蛭石∶珍珠岩比例为3∶1的基质，或者是有机质基质。
上述的营养液的配方Ca(NO3)2·4H2O 2.00mmol L-1，KH2PO40.10mmol L-1，MgSO4·7H2O 0.50mmol L-1，KCl 0.10mmol L-1，K2SO40.70mmol L-1，H3BO310.00μmolL-1，MnSO4·H2O 0.50μmol L-1，ZnSO4·7H2O 1.0μmol L-1，CuSO4·5H2O 0.20μmolL1，(NH4)6Mo7O240.01μmol L-1，Fe-EDTA 100μmol L-1，营养液的pH为5.5～5.8。
方案二重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，采用茎尖组织诱导分化法，将东南景天消毒后取带有腋芽的0.2～0.4cm茎段，接种到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8的诱导培养基上，将培养瓶放至温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养20-40天后，取出长有簇生芽的叶片或茎尖，选取大芽，转接到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8壮苗培养基上，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养3～8周，得到含有许多2～3cm长幼根的种苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置2～3天后，用自来水洗去培养基后移栽至蛭石∶珍珠岩比例3∶1的基质，或有机质基质中，2～4周得到种苗。
上述的诱导培养基成份是MS培养基+0.1mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L萘乙酸(NAA)，或是MS培养基+0.1mg/L+2.0mg/L萘乙酸(NAA)，或是MS培养基+0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+3.0mg/L萘乙酸(NAA)。
上述的壮苗培养基成份是MS培养基+0.1mg/L激动素(KT)+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+20mg/L腺嘌呤(Ad)。
方案三重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，采用叶片愈伤组织诱导法，将东南景天叶片消毒，切去叶缘、叶脉和叶柄，切成0.2～0.3cm2的小片，接种到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8诱导培养基上，将培养瓶放入温度为±25℃，无光照的培养箱中1～2周诱导愈伤组织，将愈伤组织转移至已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8分化培养基中，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养40～50天，得到3～5cm高带有1cm以上幼根的幼苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置2～3天后，用自来水洗去培养基后移栽至蛭石∶珍珠岩比例3∶1的基质，或有机质基质中，2～4周得到种苗。
上述的诱导培养基成份是MS培养基+1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
上述的分化培养基成份是MS培养基+NAA 2.0mg/L萘乙酸(NAA)，或是MS培养基+2.0mg/L萘乙酸(NAA)+0.1mg/L激动素(KT)+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+20mg/L腺嘌呤(Ad)。
本发明所说的MS培养基组成见表1。
本发明的有益效果在于本发明取重金属超积累植物东南景天的茎段、茎尖、叶片进行培养繁殖，由于繁殖时直接选取东南景天的茎段、茎尖、叶片拓宽了东南景天繁殖的取材范围，培养繁殖中每个环节易于操作，并能够实施监控，移栽成活率高，繁殖方法快速，高效，为大面积地修复重金属污染土壤提供了条件。
本发明目的是通过茎段扦插、茎尖组织培养，叶片愈伤组织诱导等方法，快速得到重金属超积累植物东南景天种苗，用于重金属污染环境的植物修复。
具体实施例方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1将取自铅锌矿上重金属超积累东南景天剪成约4cm带腋芽的茎段，直接扦插到上海1亩受重金属污染的蔬菜地中，覆盖遮阳网4天，并每2天上午浇水，待扦插茎段直立后移去遮阳网，每周浇水2次保持土壤湿润，除草，在生长120天后植物生长至近20cm左右，并带有较多分支，分支长度约8cm左右，割取地上部后，保留含有约2cm左右地上部的植物在土壤中，每周浇水2次，添加尿素和菜籽饼，使植物保持生长旺盛，120天后再次收割。将收割获得的地上部茎段，再次剪成作为种苗再次被剪成约4cm带腋芽的茎段扦插到污染土壤中繁殖。
实施例2将取自铅锌矿上重金属超积累东南景天剪成约4cm带腋芽的茎段，扦插到用水清洗过的蛭石∶珍珠岩比例为3∶1的基质中，覆盖遮阳网一周后，并每3天浇水，待扦插茎段直立后移去遮阳网，每周浇水2次保持基质湿润，在生长约1月后，得到约10cm左右的粗壮的东南景天种苗，移栽至富阳受重金属严重污染的土壤中生长，除草，生长约4月后收割地上部，保留含有约5cm左右地上部的植物在土壤中，进行日常田间管理，半年后再次收割。
实施例3将取自铅锌矿上重金属超积累东南景天剪成约3cm带腋芽的茎段，插到水中，1周后长出1cm左右的幼根，换上1/4浓度的pH为5.8的营养液(配方为Ca(NO3)2·4H2O 2.00mmol L-1，KH2PO40.10mmol L-1，MgSO4·7H2O 0.50mmol L-1，KCl 0.10mmol L-1，K2SO40.70mmol L-1，H3BO310.00μmol L-1，MnSO4·H2O 0.50μmolL-1，ZnSO4·7H2O 1.0μmol L-1，CuSO4·5H2O 0.20μmol L-1，(NH4)6Mo7O240.01μmolL-1，Fe-EDTA 100μmol L-1)培养3天，换上1/2浓度的pH为5.8的营养液(配方同上)培养3天，此后换上全浓度的pH为5.8的营养液(配方同上)培养，每3～4天更换一次营养液，培养15天后得到长约12cm的带有少量分支的种苗，移植到污染土壤中生长。以上培养过程中用通气泵使营养液保持24小时通气。
实施例4将取自铅锌矿上重金属超积累东南景天用自来水清洗干净，用70％乙醇浸泡10秒，再用1％(w/v)升汞浸泡10分钟，倒掉升汞后用无菌水清洗3次后，得到无菌苗后在超净工作台上取带有腋芽的0.3cm茎尖，接种到已高压灭菌并冷却后的150ml玻璃培养瓶装的50ml pH为5.8诱导培养基，其中50瓶的诱导培养基组成份MS培养基+0.1mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L萘乙酸(NAA)，50瓶诱导培养基成份为MS培养基+0.1mg/L+2.0mg/L萘乙酸(NAA)，50瓶诱导培养基基成份为MS培养基+0.1mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)+3.0mg/L萘乙酸(NAA)，每瓶接种3个茎尖，将培养瓶放至温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养25天后，取出长有簇生芽的叶片或茎尖，选取大芽，转接到已灭菌的玻璃培养瓶装的50ml的壮苗培养基上，壮苗培养基是pH为5.8的MS培养基+0.1mg/L激动素(KT)+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+20mg/L腺嘌呤(Ad)，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养6周，得到含有许多2～3cm长幼根的种苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置3天后，用水洗净根部培养基，分别移栽至蛭石∶珍珠岩比例3∶1的基质和有机质基质中，4周后得到粗壮的地上部约5cm种苗。
实施例5将取自铅锌矿上重金属超积累东南景天用自来水清洗干净，用70％乙醇浸泡10秒，再用1％(w/v)升汞浸泡10分钟，倒掉升汞后用无菌水清洗3次后，得到无菌苗后在超净工作台上将叶片，切去叶缘、叶脉和叶柄后切成0.2cm2的小片，接种到已高压灭菌并冷却后的150ml玻璃培养瓶装的50ml pH为5.8诱导培养基上，诱导培养基成份为MS培养基+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，将培养瓶放入温度为±25℃，无光照的培养箱中10天后得到愈伤组织，将愈伤组织转移至已灭菌的玻璃培养瓶装的50ml pH为5.8分化培养基中，其中30瓶分化培养基的成份为MS培养基+NAA 2.0mg/L萘乙酸(NAA)，30瓶分化培养基的成份为MS培养基+2.0mg/L萘乙酸(NAA)+0.1mg/L激动素(KT)+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+20mg/L腺嘌呤(Ad)，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养40天，得到3cm高带有1cm以上幼根的幼苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置2～3天后，用水洗去培养基后分别移栽至蛭石∶珍珠岩比例3∶1的基质和有机质基质中，4周后得到粗壮的地上部约5cm种苗。
表1 MS培养基组成成份
权利要求
1.重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征是采用茎段扦插法，将东南景天剪成3cm以上带腋芽的茎段，直接扦插到到受重金属污染的土壤中，按传统农耕法管理生长，待植物生长至15cm～30cm收割地上部，作为种苗再次被剪成3cm以上带腋芽的茎段，扦插到污染环境的土壤中；或者将东南景天剪成3cm以上带腋芽的茎段，直接扦插到育苗基质或营养液中，按传统农耕法管理生长，得到种苗。
2.根据权利要求1所述的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征在于所说的育苗基质是蛭石∶珍珠岩比例为3∶1的基质，或者是有机质基质。
3.根据权利要求1所述的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征在于所说的营养液的配方Ca(NO3)2·4H2O 2.00mmol L-1，KH2PO40.10mmolL-1，MgSO4·7H2O 0.50mmol L-1，KCl 0.10mmol L-1，K2SO40.70mmol L-1，H3BO310.00μmol L-1，MnSO4·H2O 0.50μmol L-1，ZnSO4·7H2O 1.0μmol L-1，CuSO4·5H2O0.20μmol L-1，(NH4)6Mo7O240.01μmol L-1，Fe-EDTA 100μmol L-1，营养液的pH为5.5～5.8。
4.重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征是采用茎尖组织诱导分化法，将东南景天消毒后取带有腋芽的0.2～0.4cm茎段，接种到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8诱导培养基上，将培养瓶放至温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养20-40天后，取出长有簇生芽的叶片或茎尖，选取大芽，转接到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8壮苗培养基上，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养3～8周，得到含有许多2～3cm长幼根的种苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置2～3天后，用水洗去培养基，移栽至蛭石∶珍珠岩比例3∶1的基质，或有机质基质中，2～4周得到种苗。
5.根据权利要求4所述的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征在于所说的诱导培养基组成是MS培养基+0.1mg/L6-苄氨基嘌呤+1.0mg/L萘乙酸，或是MS培养基+0.1mg/L+2.0mg/L萘乙酸，或是MS培养基+0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤+3.0mg/L萘乙酸。
6.根据权利要求4所述的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征在于所说的壮苗培养基组成是MS培养基+0.1mg/L激动素+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+20mg/L腺嘌呤。
7.重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征是采用叶片愈伤组织诱导法，将东南景天叶片消毒，切去叶缘、叶脉和叶柄，切成0.2～0.3cm2的小片，接种到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8诱导培养基上，将培养瓶放入温度为±25℃，无光照的培养箱中1～2周诱导愈伤组织，将愈伤组织转移至已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8分化培养基中，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养40～50天，得到3～5cm高带有1cm以上幼根的幼苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置2～3天后，用水洗去培养基，移栽至蛭石∶珍珠岩比例3∶1的基质，或有机质基质中，2～4周得到种苗。
8.根据权利要求7所述的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征在于所说的诱导培养基是pH为5.5～5.8的MS培养基+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸。
9.根据权利要求7所述的重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征在于所说的分化培养基是MS培养基+NAA 2.0mg/L萘乙酸，或是MS培养基+2.0mg/L萘乙酸+0.1mg/L激动素+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+20mg/L腺嘌呤。
全文摘要
本发明涉及重金属超积累植物东南景天种苗繁殖方法。该方法通过取重金属超积累植物东南景天的茎段、茎尖或叶片进行培养繁殖，不仅取材范围宽，而且培养繁殖中每个环节易于操作，并能够实施监控，移栽成活率高，繁殖方法快速，高效，为大面积地修复重金属污染土壤提供了条件。
文档编号A01G1/00GK1973617SQ200610155240
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者杨肖娥, 金晓芬, 冯英, 吴春勇, 刘勇军 申请人:浙江大学