一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，特别涉及一种可以使种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，种苗变异率降低的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]大花蕙兰(Cymbidium hubridum)是以兰属中一些大花型附生种为亲本经过多代杂交选择培育出来的花型大、色彩鲜艳、生长健壮的优良品种群。大花蕙兰姿态优美，叶长碧绿，花姿粗矿，花期长达2-3个月，是极重要的室内观赏植物，是世界著名的“兰花新星”，兼具国兰的幽香典雅和洋兰的丰富多彩，在国际花丼市场十分畅销，深受世界各地人们的喜爱。
[0003]目前，生产上主要以无病毒健壮母株侧芽的茎尖为外植体，通过原球茎和丛生芽途径大量繁殖大花蕙兰种苗。工厂化生产大花蕙兰种苗主要存在以下四个问题:
[0004]一是，采用侧芽的茎尖进行繁殖时，若茎尖组织太大，消毒往往不彻底、消毒成功率极低，同时茎尖组织吸收营养物质较慢，培养期间容易褐化。若茎尖组织太小，生活力大大降低，培养后期易死亡，导致原球茎诱导率较低。
[0005]二是，大花蕙兰增殖阶段原球茎极易变异，玻璃化现象较严重，这种原球茎后期难以分化芽。
[0006]三是，大花蕙兰分化阶段一部分原球茎会逐渐僵化，主要表现为基部假鳞茎会异常肥大，不分化叶，或者即使能分化叶，但叶片较小，不能进一步生长发育，导致原球茎分化的芽变异，产生大量的僵化苗。
[0007]四是，大花蕙兰生根壮苗阶段种苗变异率较高，种苗不够健壮，会产生较多不同类型的变异种苗，比如叶片互生或丛生排列的十字架苗、茎节间过长的竹竿苗。另外，种苗新根缠结比率高，不易分开，不利于后期温室移栽驯化。
【发明内容】
[0008]本发明针对以上缺点，对其进行大规模的技术革新，提供一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，优化外植体消毒方法及外植体选择切割技术，设计高效的诱导、增殖、分化、生根壮苗阶段的培养基配方，从而达到提高茎尖组织消毒成功率、原球茎诱导率；降低原球茎变异率与玻璃化率；降低分化芽变异率；使得种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，根系更加分散与伸展，同时种苗变异率降低的目的。
[0009]为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现:
[0010]一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，包括以下步骤:
[0011]步骤a，外植体的选取，切取大花蕙兰母株基部长出的6_12cm的健壮侧芽；
[0012]步骤b，侧芽消毒，对切取的侧芽进行消毒，切下茎尖组织作为培养的外植体；
[0013]步骤c，原球茎诱导培养，将外植体接种到原球茎诱导培养基上，培养30-60天，诱导得到原球茎；所述诱导培养基的成分包括:花宝3号l_3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，活性炭 0.5-1.5g/L，琼脂 6_8g/L，蔗糖 15_24g/L ；
[0014]步骤d，原球茎增殖培养，将诱导形成的原球茎团切割成小块，每块含3-5个原球茎，接种到增殖培养基中，逐渐形成新的原球茎，反复切割增殖，每30-40天继代转接一次；所述增殖培养基的成分与诱导培养基成分相同；
[0015]步骤e，原球茎分化培养，将增殖阶段形成的原球茎团切割成小块，每块含5-10个原球茎，接种到分化培养基中进行分化培养，原球茎分化出新叶新根；所述分化培养基的成分包括:花宝3号l_3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.4-1.0g/L，TDZ (噻苯隆)0.05-0.15mg/L，活性炭 0.5-1.5g/L，琼脂 5_9g/L，蔗糖 13_26g/L。
[0016]步骤f，生根壮苗培养，切取分化培养后高5-6cm的芽，接种到生根壮苗培养基中进行培养，得到生长健壮的种苗，其中生根壮苗培养基的成分包括:花宝I号l_4g/L，硝酸钾0.7-2.lg/L，七水硫酸亚铁18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30_43g/L，水解酪蛋白2_4g/L，腺嘌呤 0.5-1.5g/L，土豆泥 12_28g/L，香蕉泥 35_65g/L，椰子汁 50_150mL，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂 6-8g/L，蔗糖 14_27g/L。
[0017]进一步，步骤b中，对侧芽进行消毒的方法包括以下步骤:
[0018]将切取的侧芽用流水冲洗干净，层层剥去侧芽外层叶片，切除侧芽基部木质化组织，直到剩下6-8片叶，继续用流水冲洗干净，然后用12%的次氯酸钙消毒15min，用吸水纸吸干表面水分，拿到无菌工作台上进一步消毒；
[0019]继续剥去茎尖外层叶片，直到剩下3-5片叶，然后用5%的次氯酸钙消毒12min，无菌水冲洗3-5次；
[0020]继续剥外层叶片，直到剩下1-2片叶，然后用1%次氯酸钙消毒6min，无菌水冲洗3-5次，用吸水纸吸干表面水分；
[0021]在显微镜下面，小心剥去生长点外层的幼叶，直到露出生长点；
[0022]切下含生长点的茎尖组织，约2_3mm大小，作为培养的外植体。
[0023]进一步，将含生长点的茎尖组织从中心均匀切成4小块(十字切法)，或者2小块(一分为二法)，每块单独接种到诱导培养基中。
[0024]进一步，所述诱导培养基和增殖培养基的成分包括:花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，活性炭lg/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
[0025]进一步，所述分化培养基的成分包括:花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L, TDZ0.lmg/L，活性炭 lg/L，琼脂 7g/L，鹿糖 20g/L。
[0026]进一步，生根壮苗培养基的成分包括:花宝I号l_4g/L，硝酸钾0.7-2.lg/L,七水硫酸亚铁18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30_43mg/L，水解酪蛋白2_4g/L，腺嘌呤
0.5-1.5g/L，土豆泥 12-28g/L，香蕉泥 35_65g/L，椰子汁 100ml/L，活性炭 0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，鹿糖 14-27g/L。
[0027]优选的，生根壮苗培养基的成分包括:花宝I号2g/L，硝酸钾1.5g/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭lg/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
[0028]总之，本发明的有益效果为:
[0029]本发明提供的大花蕙兰组织培养方法，首先，增殖阶段，采用本发明配制的培养基，能显著降低原球茎变异率、玻璃化率。
[0030]分化阶段，采用本发明配制的培养基，能显著降低分化芽的变异率，减少僵化苗数量。
[0031]生根壮苗阶段，采用本发明配制的培养基，可使种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，根系更加分散与伸展，同时降低种苗变异率。
[0032]进一步，采用本发明的消毒方法及外植体选择切割技术可以提高茎尖组织消毒成功率，同时增加茎尖组织与培养基接触面积，促进营养物质吸收，降低褐化率，提高原球茎诱导率。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
[0034]实施例1
[0035]诱导培养基和增殖培养基的成分如下:
[0036]花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，活性炭lg/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L0
[0037]实施例2
[0038]诱导培养基和增殖培养基的成分包括:
[0039]花宝3号lg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.5g/L，活性炭0.5g/L，琼脂6g/L，蔗糖15g/Lo
[0040]实施例3
[0041]诱导培养基和增殖培养基的成分包括:
[0042]花宝3号3g/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.5g/L，活性炭1.5g/L，琼脂8g/L，蔗糖24g/Lo
[0043]实施例4
[0044]分化培养基的成分包括:
[0045]花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，TDZ0.lmg/L,活性炭lg/L，琼脂7g/L，鹿糖 20g/L。
[0046]实施例5
[0047]分化培养基的成分包括:
[0048]花宝3号lg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.4g/L，TDZ0.05mg/L，活性炭0.5g/L，琼脂 5g/L，鹿糖 13g/Lo
[0049]实施例6
[0050]分化培养基的成分包括:
[0051]花宝3号3g/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.0g/L，TDZ0.15mg/L，活性炭1.5g/L，琼脂 9g/L，鹿糖 26g/L。
[0052]实施例7
[0053]生根壮苗培养基的成分包括:
[0054]花宝I号2g/L，硝酸钾1.5g/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠37.3g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭 lg/L，琼脂 7g/L，鹿糖 20g/L。
[0055]实施例8
[0056]生根壮苗培养基的成分包括:
[0057]花宝I号lg/L，硝酸钾0.7g/L，七水硫酸亚铁18mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30mg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.5g/L，土豆泥12g/L，香蕉泥35g/L，椰子汁50ml/L，活性炭 0.5g/L，琼脂 6g/L，鹿糖 14g/Lo
[0058]实施例9
[0059]生根壮苗培养基的成分包括:
[0060]花宝I号4g/L，硝酸钾2.lg/L,七水硫酸亚铁32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠43mg/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.5g/L，土豆泥28g/L，香蕉泥65g/L，椰子汁150ml/L，活性炭1.5g/L，琼