一种用于西瓜花药愈伤组织诱导的培养基及利用该培养基诱导西瓜花药愈伤组织的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及西瓜花药愈伤组织诱导方法和用于诱导的培养基，具体涉及一种用于 西瓜花药愈伤组织诱导的培养基及利用该培养基诱导西瓜花药愈伤组织的方法。
【背景技术】
[0002] 花药培养是获得单倍体的有效途径。目前，通过花药培养获得高配子胚胎发生的 作物，主要在谷物、十字花科和一些茄科类作物上。花药培养诱导单倍体受很多因素的影 响，如：诱导培养基，小孢子发育时期，前期处理，培养条件，供体植株生长状态，基因型等。 早在1981年，薛光荣等在西瓜品种"琼酥"上，成功诱导出花粉植株，随后又在"周至红"西 瓜品种上，获得了花粉植株，但其愈伤组织诱导率及分化频率均较低，在育种上难以利用， 没有得到推广；袁万良"YUAN Wanliang，FU Ruiming，LEI Baolin. The preliminary report of watermelon anther culture[J] ? Shanxi Agricultural Sciences,1995, (1):29-30. 袁万良，付润民，雷保林等.西瓜花培试验初报[J].陕西农业科学，1995,（1) :29-30."、 魏瑰"WEI Ying. The effects of low-temperature pretreatment on anther callus induction [J]. Agricultural Science and Technology, 1999，（9): 34-36?魏瑰?低温预 处理对西瓜花药诱导愈伤组织的影响[J].甘肃农业科技，1999,（9) :34-36. "等研宄，使西 瓜花药培养的愈伤组织诱导率有所提高，但没有后续报道，对愈伤组织的质量也无明确说 明；缑艳霞''[GOU Yanxia. The technology research of watermelon anther culture [D]. Hangzhou，Zhejiang University，2006.缑艳霞.西瓜花药离体培养技术研宄[D].杭州： 浙江大学，2006. "李娟"[13] LI Juan. The study of watermelon anther and microspore culture [D].Yaan, Sichuan Agricultural University, 2006?李娟?西瓜花药和小抱子培 养研宄[D].雅安：四川农业大学，2008. "等对西瓜花药和小孢子培养进行了研宄，但未取 得显著成效。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于西瓜花药愈伤组织诱导的培养 基及利用该培养基诱导西瓜花药愈伤组织的方法，提出了一种适宜的西瓜花药有效愈伤组 织诱导方法，为西瓜花药培养再生技术体系的建立奠定基础。
[0004] 本发明的技术方案是：一种用于西瓜花药愈伤组织诱导的培养基，所述培养基是 在MS培养基的基础上添加NAA、6-BA、KT和Gln，所述NAA、6-BA、KT和Gin的浓度分别为 0? 2-1. Omg ? L \2. Omg ? L ^l. Omg ? L 1和 40_100mg ? L 丄。
[0005] 本发明的进一步改进包括：
[0006] 培养基是在MS培养基的基础上添加NAA、6-BA、KT和Gln，所述NAA、6-BA、KT和 Gin 的浓度分别为 1. Omg ? L i、2. Omg ? L Omg ? L 1和 100mg ? L 工。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述的培养基诱导西瓜花药愈伤组织的方 法，包括以下步骤：取单核靠边期花蕾，低温处理2d-3d，接种于所述培养基上，高温预培养 2-3d〇
[0008] 所述的单核靠边期花蕾选取时间为晴天早上6 :00-8:00。
[0009] 所述的单核靠边期花蕾选自5-6月份花蕾纵径2-4mm，横径3-4mm，萼片紧贴花瓣， 花瓣闭合，呈深绿色，花药颜色呈淡黄色至黄绿色。
[0010] 所述的低温处理包括：取花蕾，用自来水冲洗3次，再用湿纱布包裹好，置于4°C下 处理，然后，在无菌操作台上，将预处理后的花蕾投到75%的酒精中消毒30s，再用0. 1%的 HgCl2消毒8分钟，最后用无菌水冲洗3-5次；消毒完成后，把无菌的花蕾用无菌的刀子镊子 剥开，取出花药，接种在诱导培养基上培养。
[0011] 所述的高温预培养包括：把接种后的花药分别放入35°C恒温培养箱内培养2d。
[0012] 本发明还提供了一种上述的培养基在西瓜花药愈伤组织诱导中的应用。
[0013] 所述的应用中的西瓜是HJ001、西农8号和大果黑美人。
[0014] 本发明以"HJ001"（杂交种）、西农8号、大果黑美人为试验材料，分别进行不同低 温预处理时间、不同高温预培养时间、植株生长调节剂、不同附加物、不同基因型、不同生长 环境和取材时期对西瓜花药愈伤组织诱导的影响，统计不同处理的有效愈伤组织诱导率和 无效组织诱导率。经4°C低温处理2d-3d，有效愈伤组织诱导率达到18.33%;高温预培养 2d-3d，有效愈伤组织诱导率达到14% ;NAA的诱导效果较2,4-D好；在培养基上添加谷氨酰 胺（Gin) 100mg吨―1有效愈伤组织诱导率分别达到19. 00%和20. 33%;在5月下旬6月初， 采集的花蕾活力较高，花蕾纵径2-4mm，横径3-4mm，萼片紧贴花瓣，花瓣闭合，呈深绿色，花 药颜色呈淡黄色至黄绿色时多为小孢子单核靠边期，不同品种间稍有差异；3个品种的有 效愈伤组织诱导率和总愈伤组织诱导率有较大差异，差异最大达到16%和46. 34%。在晴 天早上6:00-8:00，取单核靠边期花蕾，低温处理2(1-3(1，接种在]^+隱41.011^，17 1+6-842.0111 g ? L-i+KTl. Omg ? P+GLN 100mg ? L-1高温预培养2d-3d，有效愈伤组织诱导率最高。
【附图说明】
[0015] 图1是小孢子活力检测结果图。
[0016] 图2是小孢子单核期镜检图。
[0017] 图3是低温处理时间对西瓜有效愈伤组织诱导率的影响结果图。
[0018] 图4是低温处理时间对西瓜无效愈伤组织诱导率的影响结果图。
[0019] 图5是高温处理时间对西瓜有效愈伤组织诱导率的影响结果图。
[0020] 图6是高温处理时间对西瓜无效愈伤组织诱导率的影响结果图。
[0021] 图7是白色、棉絮状愈伤组织。
[0022] 图9是质地坚硬紧密的愈伤组织。
[0023] 图8是黄色质地疏松的愈伤组织。
[0024] 图10是质地坚硬紧密的愈伤组织。
[0025] 图11是不同浓度附加物对于西瓜愈伤组织诱导率的影响。
[0026] 图12是不同生长季节对西瓜有效愈伤组织诱导率的影响结果图。
[0027] 图13是不同生长季节对西瓜无效愈伤组织诱导率的影响结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明做详细说明。
[0029] 本发明一种用于西瓜花药愈伤组织诱导的培养基，所述培养基是在MS培养基的 基础上添加NAA、6-BA、KT和GLN，所述NAA、6-BA、KT和GLN的浓度分别为0. 2-1.Omg?L' 2.Omg?L-1、1.Omg?L-1和40-100mg?L―1。作为本发明的优选实施例，所述培养基是在MS培 养基的基础上添加NAA、6-BA、KT和GLN，所述NAA、6-BA、KT和GLN的浓度分别为1.Omg吨' 2.Omg?L'I.Omg?L1和 100mg?L、
[0030] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述的培养基诱导西瓜花药愈伤组织的方 法，包括以下步骤：取单核靠边期花蕾，低温处理2d-3d，接种于所述培养基上，高温预培养 2-3d〇
[0031] 所述的单核靠边期花蕾选取时间为晴天早上6 :00-8:00。所述的单核靠边期花蕾 选自5-6月份花蕾纵径2-4mm，横径3-4mm，萼片紧贴花瓣，花瓣闭合，呈深绿色，花药颜色呈 淡黄色至黄绿色。
[0032] 所述的低温处理包括：取花蕾，用自来水冲洗3次，再用湿纱布包裹好，置于4°C下 处理，然后，在无菌操作台上，将预处理后的花蕾投到75%的酒精中消毒30s，再用0. 1%的 HgCl2消毒8分钟，最后用无菌水冲洗3-5次；消毒完成后，把无菌的花蕾用无菌的刀子镊子