le2 Effect of 2,4_Dand NAAwith anther callus induction
[0075] 不同附加物对西瓜愈伤组织诱导率的影响
[0076] 在诱导培养基中添加谷氨酰胺（Gin)，当加入浓度为40mg吨4和100mg?厂1时，无 效愈伤组织诱导率与对照相比较高，差异显著，而两个浓度之间无显著差异，当加入浓度为 40mg? I71时，有效愈伤组织与对照相比较低，但差异不显著，当加入浓度为100mg?L4时， 有效愈伤组织与对照相比稍高，差异也不显著；当加入Gin浓度为70mg吨 4时，无效愈伤组 织诱导率比对照相比，差异达不显著，而有效愈伤组织诱导率显著高于对照，比对照提高了 14. 00%〇
[0077] 由此可见，在诱导培养基中添加添加谷氨酰胺（Gin) 70mg ? I71愈伤组织诱导率达 到最尚。
[0078] 生长环境对西瓜花药愈伤组织诱导的影响
[0079] 由图12、13可以看出，同一品种，不同生长季节，无效愈伤组织诱导率差异较大， 有效愈伤组织诱导率差异较小，总愈伤组织诱导率差异也很明显，3个品种均在露地种植 比大棚栽培的愈伤组织诱导率高。
[0080] 基因型对西瓜花药愈伤组织诱导的影响
[0081] 由表3、4看出，材料不经过低温处理时，3个品种间有效愈伤组织诱导率无显著差 异；而在低温处理ld、2d、3d时，HJ001的有效愈伤组织诱导率显著高于西农8号和大果黑 美人。3个材料经过高温处理的表现同低温处理的表现一致。
[0082] 表3不同品种在低温处理下有效愈伤组织诱导率
[0083] Table3 Different varieties under the low temperature treatment effective callus induction rate
[0084]
表4不同品种在高温处理下有效愈伤组织诱导率
[0085] 近几年的研宄表明，许多因素显著影响花药培养的成功。最重要的是供体植株的 基因型和生长环境。而小孢子发育时期，培养基成分，特别是激素种类和浓度，还有培养条 件，也决定着花药培养是否成功。试验中发现，供体植株的基因型、生长环境、小孢子发育时 期、前期预处理、不同的植物生长调节剂及附加物等均对西瓜花药愈伤组织诱导率产生较 大的影响。
[0086] 小孢子发育时期对西瓜花药愈伤组织诱导的影响
[0087] 能否响应外部的处理，取决于花粉发育的合适时期。从花粉母细胞经减数分裂到 成熟花粉的过程可分为6个时期：单核早期、单核中期、单核后期、有丝分裂期、二核花粉期 和三核花粉期。在茄子小孢子培养的试验中发现，单核期的小孢子会发生分裂现象，并得到 了大量的愈伤组织。茄果类花药培养的最佳时期是单核期到双核期，尤其是单核靠边期，更 适宜花药培养° Karakullukcu 等 "Karakullukcu S, Abak K. Studies on anther culture of eggplant. I. . Determination of the suitable bud stage[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 1993, 17:801-810. "研宄发现以萼片即将开裂前后的花蕾较 为合适，花蕾长22.4-24.7111111，花蕾直径10.8-12.111111。本试验中，以材料"耵001"为例，取 花蕾纵径2-4mm，横径3-4mm，萼片紧贴花瓣，花瓣闭合，呈深绿色，花药颜色呈淡黄色至黄 绿色，镜检时，花粉多为小孢子单核靠边期，有效愈伤组织诱导率和总愈伤组织诱导率均较 高，不同材料稍有差异。这与Sibi M等指出，萼片和花瓣的大小相关性是小孢子处于单核 晚期的形态学标志相吻合，但这种相关性并不是可以适用于所有的基因型[26]。因而，在试 验中，应先通过镜检找到具体试验材料的花粉发育时期再取材。
[0088] 前期处理对花药愈伤组织诱导的影响
[0089] 培养前对花药进行适当的变温处理能显著提高培养效果。低温预处理可提高花粉 活力，对启动小孢子核分裂和愈伤组织形成起促进作用；高温热激可促进细胞对称分裂，改 变小孢子发育方向。因而，预处理是许多作物花药培养的重要环节。
[0090] 本试验中，经过4°C低温预处理2d-3d和35°C高温条件下预培养2d-3d，花药有 效愈伤组织的诱导率较对照有显著提高，这与李娟的变温处理有相似之处"LI Juan. The study of watermelon anther and microspore culture[D]. Yaan, Sichuan Agricultural UniverSity，2006.李娟.西瓜花药和小孢子培养研宄[D].雅安：四川农业大学，2008. "。 有人认为，愈伤组织是在花药不膨大的情况下产生的，低温处理使花药壁的细胞受到损伤， 失去分裂增殖的活性，但花药内部花粉细胞仍具有活性，进一步诱导时则有可能形成愈伤 组织，所以，继代培养中仍保持色泽淡绿、质地相对紧密的特征。温度的高低以及处理时间 的长短均会对愈伤组织的诱导率产生显著的影响。范适"FAN Shi. The study of eggplant microspore culture[D]. Changsha:Hunan Agricultural University, 2003, 1-33.范 适.茄子小孢子培养研宄[D].长沙：湖南农业大学，2003, 1-33. "等研宄发现，经6天 热激的茄子小孢子群体的膨大率最高、活力最高，愈伤诱导率也显著提高。而刘公社等 则认为高温预培养并非在任何时间都起作用，只在起始培养的24h之内最为敏感[29]; Phippen等用-5°C -10°C的低温处理漂浮在培养基上的小麦花药，发现处理温度越低 或处理时间越长对培养反应的抑制作用很大。Rotino"Rotino G L，Falavigna A and Restaino F.Production of anther-derived plantlets of eggplant[J]. Capsicum Newsletter, 1987. 6:89-90. "研宄发现，热激使小孢子发生从配子体到孢子体的转换，可以 促进启动雄核的发育。这在许多小孢子培养中也得到了证实。
[0091] 试验中还发现，不同预处理的温度和时间对花药培养效果产生的差别较大。不仅 愈伤组织产生的时间不同，愈伤组织质地也不尽相同。在缑艳霞的试验中也表明：在西瓜花 药培养中，经过低温处理的花药愈伤组织从花药中间裂开的淡绿色、质地相对紧密的愈伤 组织，与常温条件下获得的愈伤组织的形成过程相比有很大的差异。不同作物，预处理对花 药培养的影响各异，但都产生了一定的影响，因此，预处理对花药培养的作用机理还有待于 进一步的研宄。
[0092] 植株生长调节物质对西瓜花药培养的影响
[0093] 植物生长调节物质是植物在特定部位产生的微量物质，不但对植物的生长发育 起着十分重要的作用，而且对植物组织培养成功与否也起着决定作用。对于大多数植物 来说，外源生长素对诱导细胞脱分化形成愈伤组织及生长有决定性作用，特别是2,4-D被 认为是启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织的必要条件。但在本试验中，在添加2,4-D的 培养基上，愈伤组织多表现为松散型愈伤组织，而在添加NAA的培养基上，愈伤组织多表 现为白色且质地坚硬紧密的愈伤组织，这与许多报道不太相符合例如Doi H，Takahashi R, Hikage T, et al. Embryogenesis and doubled haploid production from anther culture in gentian(Gentiana triflora)[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture(P CTOC)，2010, 102(1) : 27-33。这是因为2,4-D是一种其它植物激素的拮抗物质，其本身具有 刺激组织形成层活性的作用，虽然在浓度较低时可以促进愈伤组织的形成，但由此产生的 愈伤组织的分化能力却显著降低。而NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩 大，在提高植物愈伤组织发生能力和植株的再生能力上发挥着不可忽视的作用。许多研宄 表明NAA和6-BA结合使用，可显著提高愈伤组织诱导率，且愈伤组织的分化能力也较强，这 和激素间的拮抗作用有一定关系。这与本试验结果相似。
[0094]植株的生长条件对花药愈伤组织诱导的影响
[0095]有报道显示，单倍体的诱导由供体植株的生