遗传工程猪流感病毒及其应用的制作方法

专利名称：遗传工程猪流感病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明要求于2004年6月1日提交的美国临时申请第60/576,418号的权益，本发明将其引入作为参考。
1.发明领域本发明一般性地涉及拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒，以及这种减毒病毒在疫苗和药物制剂中的用途。本发明特别涉及猪NS1基因被修饰以减弱或消除NS1基因产物对细胞IFN反应的拮抗能力的减毒猪流感病毒。这些病毒在体内复制，但表现出降低的毒力和增强的减毒性，因此适合用于活病毒疫苗和药物制剂。
2.背景技术2.1流感病毒含包被的反义基因组单链RNA的病毒家族可分为具有非分段基因组的组群(副粘病毒科、棒状病毒科、纤状病毒科(Filoviridae)和博尔纳病病毒(BornaDisease病毒))，或者具有分段基因组的其它组群(正粘病毒科、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙粒样病毒科(Arenaviridae))。以下详述并用在本发明实施例之中的正粘病毒科家族包括流感病毒A型、B型和C型，以及索戈托(Thogoto)病毒、多理病毒(Dhori)病毒和传染性鲑鱼贫血病毒。
流感病毒体由内部的含单链RNA基因组的核糖核蛋白核心(螺旋形核壳体)和外部的被基质蛋白(M1)内联的脂蛋白包膜组成。流感病毒A型的分段基因组由8种(C型流感为7种)线形、负极性、单链RNA分子组成，单链RNA编码7种多肽，包括RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；从含脂质的包膜伸出的两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)、核输出蛋白(NEP)；以及促凋亡因子PB1-F2。基因组的转录和复制在核内进行，通过在质膜上出芽装配。在混合感染中这些病毒可以发生基因重排。
流感病毒通过HA吸附在细胞膜糖蛋白和糖脂的唾(液)酸寡糖上。病毒体内吞后，在细胞内涵体中发生HA分子的构象变化，该内涵体促进膜的融合，由此引发脱壳。核壳体移至核，在核中病毒mRNA被转录。病毒mRNA通过独特的机制来转录，其中病毒核酸内切酶从细胞异源mRNA中剪切5′帽状末端，该帽状末端随后作为引物通过病毒转录酶转录病毒RNA模板。转录产物在距离其模板末端15-22碱基处终止，在那里寡(U)序列作为添加多poly(A)结构的信号。在这样产生的8种病毒RNA分子中，6种为单顺反子信使，它们被直接翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白、PB2、PB1和PA的蛋白质。其它的两种转录子进行剪接，每种产生两种mRNA，这些mRNA在不同的阅读框内被翻译产生M1、M2、NS1和NEP。通过使用可供选择地ATG，该PB1片段编码第二种蛋白质非结构性PB1-F2蛋白。换言之，所述8种病毒RNA片段编码11种蛋白9种结构性蛋白和两种非结构性蛋白。流感病毒基因和其蛋白产物的总结如下表I所示。
表I流感病毒基因组RNA片段及其编码分配a
a改写自R.A.Lamb and P.W.Choppin(1983)，Annual Review of Biochemistry，Volume 52，467-506.
b对于A/PR/8/34株c由生物化学和遗传方法确定d由核酸序列分析和蛋白测序确定流感病毒的病原性由多重病毒和宿主因素来调节。在对抗病毒感染的宿主因素中，I型干扰素(IFNα/β)系统是有力的抗病毒先天防御机制的代表，其在真核有机体的进化中相对较早地建立(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4647-55)。该抗病毒IFNα/β系统涉及三个主要步骤(i)检测病毒感染和分泌IFNα/β，(ii)IFNα/β与其受体结合并诱导转录IFNα/β刺激性基因，及(iii)合成抗病毒酶和蛋白。然而，大多数病毒已经获得编码IFNα/β拮抗分子的特异性遗传信息，其有效地阻断IFNα/β抗病毒系统的一个或多个步骤。A型流感病毒在感染的细胞中表达非结构性蛋白NS1蛋白(如下文详述)，该蛋白对抗细胞的IFNα/β反应(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252324-30)。
A型流感病毒基因组含有8种负极性单链RNA片段，编码两种非结构性蛋白质和9种结构性蛋白质。非结构性蛋白NS1富含在被流感病毒感染的细胞中，但在病毒体中没有检测到。NS1是在感染早期出现在核中在病毒周期晚期出现在胞浆中的磷酸蛋白(King等，1975，Virology 64378)。对携带损伤的NS基因的温度敏感性(ts)流感病毒突变株的研究表明，NS1蛋白为转录和转录后调节因子机制，通过该机制病毒可抑制宿主细胞的基因表达和刺激病毒蛋白合成。如同许多其它调节转录后过程的蛋白，NS1蛋白与特定的RNA序列和结构相互作用。已报道，NS1蛋白结合不同种类的RNA，包括vRNA、poly-A、U6 snRNA、病毒mRNA的5′未翻译区域和ds RNA(Qiu等，1995，RNA 1304；Qiu等，1994，J.Virol.682425；Hatada Fukuda 1992，J Gen Virol.733325-9)。在转染细胞中从cDNA表达NS1蛋白与几种作用相关抑制mRNA的核-胞浆转运、抑制前mRNA剪接、抑制宿主mRNA聚腺苷酸化、和刺激病毒mRNA的翻译(Fortes，等，1994，EMBO J.13704；Enami等，1994，J.Virol.681432；de Ia Luna等，1995，J.Virol.692427；Lu等，1994，Genes Dev.81817；Park等，1995，J.Biol Chem.270，28433；Nemeroff等，1998，Mol.Cell.11991；Chen等，1994，EMBO J.182273-83)。特别是，NS1蛋白具有三个结构域，已报道这些结构域在流感病毒感染中具有一些调节功能。氨基末端的73个氨基酸负责与RNA结合(Qian等，1995，RNA 1948-956)，特别是与双链RNA结合，赋予病毒逃逸干扰素α/β反应的能力(Donelan等，2003，J.Virol.7713257-66)。该蛋白的中央部分与真核细胞的翻译起始因子4GI互相作用，促进病毒mRNA相对于宿主mRNA优先翻译(Aragon等，2000，Mol.Cell Biol.206259-6268)。已经证明羧基末端或效应子结构域抑制宿主mRNA的加工，具体地抑制宿主mRNA聚腺苷酸化(Nemeroff等，1998，Mol.Cell 1991-1000)、与mRNA的poly(A)尾结合抑制核输出(Qiu and Krug，1994，J.Virol.682425-2432)和抑制前mRNA的剪接(Lu等，1994，Genes Dev.81817-1828)。
对缺乏NS1基因的人重组流感病毒(ddNS1)的研究表明该病毒只能在例如STAT1-/-小鼠或Vero细胞的IFN缺陷系统中复制；因此NS1蛋白负责拮抗IFN活性(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252324-330)。还表明，NS1蛋白敲除的人流感病毒对小鼠是减毒的(Egorov等，1998，J.Virol.726437-6441)，并且该病毒提供对抗野生型病毒的保护(Talon等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974309-4314)。
2.2猪流感病毒猪流感(SI)是由A型流感病毒引起的猪急性呼吸疾病。其严重性依赖多种因素，包括宿主年龄、病毒株和二次感染(Easterday，1980，Philos Trans R Soc Lond BBiol Sci 288433-7)。A型流感病毒是分段负链RNA病毒，并可以从许多其它种类宿主中分离，包括鸟、人、马、鲸鱼和貂。尽管完整的流感病毒很少能跨越种属障碍，但基因片段可以通过基因重组或基因漂移过程来跨越此障碍。由于猪支持人和鸟的A型流感病毒复制(Kida等，1994，J Gen Virol 752183-8)，因而推定猪作为“混合容器”使得对不同宿主特异的病毒种类之间发生重组从而在种间传播中发挥重要作用(Scholtissek，1994，Eur J Epidemiol 10455-8)。这可以导致产生能够跨越种属障碍传染人类的新流感病毒。目前有三种SI病毒(SIV)亚型在美国的猪中循环H1N1、H3N2和H1N2(Olsen，2002，Virus Res 85199-210；Karasin等，2002，J Clin Microbiol 401073-9；Karasin等，2000，Virus Res 6871-85；Olsen等，2000，Arch Virol 1451399-419；Webby等，2000，J Virol 748243-51；Webby等，2001，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 3561817-28；Zhou，2000，Vet Microbiol 7447-58)。1998年之前，主要的“传统”H1N1 SIV分离自美国的猪(Kida等，1994，J GenVirol 752183-8；Scholtissek，1994，Eur J Epidemiol 10455-8；Olsen等，2000，ArchVirol.1451399-419)。在1998年，SIV的H3N2亚型在美国的多个州被分离。这些病毒由人、鸟和传统的猪病毒之间重组产生，它们进化迅速并引起比传统H1N1 SIV更严重的疾病。
流感病毒的病原性由多重病毒和宿主因素来调节。在对抗病毒感染的宿主因素中，I型干扰素(IFNα/β)系统是有力的抗病毒先天防御机制的代表，其在真核有机体的进化中相对较早地建立(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4647-55)。抗病毒IFNα/β系统涉及三个主要步骤(i)检测病毒感染的和分泌IFNα/β，(ii)IFNα/β与其受体的结合并诱导转录IFNα/β刺激性基因，及(iii)合成抗病毒酶和蛋白。然而，大多数病毒已经获得编码IFNα/β拮抗分子的特异性遗传信息，其有效地阻断IFNα/β抗病毒系统的一个或多个步骤。A型流感病毒在感染的细胞中表达非结构性蛋白NS1蛋白，该蛋白对抗细胞的IFNα/β反应(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252324-30)。
1918年首次报道猪的流感感染并在1930年首次从猪中分离猪流感病毒(Shope，R.E.，1931，J Exp.Med.54373-385)。这些首次分离物是猪A型流感病毒H1N1系的祖先。从1930年至二十世纪九十年代，北美猪的流感几乎无例外地由H1N1猪病毒的感染引起。猪流感模式的显著变化发生在1997年左右，当时检测到未预料到的和实质性增加的H3血清阳性(8％)，并在美国和加拿大从猪中开始分离到了H3N2病毒(Olsen等，2000，Arch.Virol.1341399-1419)。此外，在H3N2病毒和H1N1猪病毒之间的重组导致第二代H1N2重组病毒的检出(Karasin等，2000，J Clin.Microbiol.382453-2456；Karasin等，2002，J.Clin Microbiol.401073-1079)。此外，从加拿大的猪中分离到了鸭来源的鸟H4N6病毒(Karasin等，2000，J.Virol.749322-9327)。除了所述H1N1猪流感病毒的抗原漂移变体，这些新病毒的产生可引起潜在的兽医和人类公共健康问题。
在1998年，猪对其几乎没有免疫性的新猪流感病毒株使得实验中的2400头动物致病。尽管自从1930年仅有一种流感亚型使北美的猪致病，但最近几年里，新流感病毒的快速演变感染了北美的1亿头猪。稳定数年后，北美的猪流感病毒进入进化的快速轨道，每年都产生变体。这不仅对畜牧业产生不好的影响和引起负面经济效应，而且专家们担心这种进化中的猪流感病毒增加了产生在人中传播的新病毒的可能性。幸运的是，这些在北美出现的新猪病毒株至今显示不容易感染人。
2.3减毒病毒通过“杀灭”病毒病原性来制备失活的病毒疫苗，例如通过加热和福尔马林处理，从而使其不能复制。因失活的疫苗不能提供长期持久的免疫，其使用受到限制，因此仅提供有限的保护。制备病毒疫苗的另外可选择性途径涉及使用减毒的活病毒疫苗。减毒病毒能够复制但没有致病性，因而提供更长而持久的免疫并产生较强的保护。然而，制备减毒病毒的传统方法涉及宿主范围内突变株的机会性分离，这些突变株多数是温度敏感的；例如，通过非天然宿主对病毒进行传代，并且选择有免疫原性而不致病的子代病毒。
用于分离和培养以用作疫苗免疫为目的的流感病毒的常规培养基是鸡胚蛋。流感病毒通常于37℃在10-12天龄的胚中生长2-4天。尽管大多数A和B型流感病毒的人原始分离物在胚的羊膜囊生长更好，但2-3代后，病毒变得适应生长在尿囊腔中，该腔可以从鸡蛋外部进入(Murphy，B.R.，和R.G.Webster，1996.Orthomyxo Viruses pp.1397-1445.In Fields Virology.Lippincott-Raven P.A.)。
理论上，重组DNA技术和遗传工程技术应该能提供制备减毒病毒的更好方法，因为可有意将特定的突变工程化到病毒基因组中。然而，病毒减毒所需的基因改变是未知或不能够预测的。通常，多数利用重组DNA技术来工程化病毒疫苗来制备亚单位疫苗，这种亚单位疫苗仅含有在重组病毒载体(例如在牛痘病毒或杆状病毒(baculovirus))中表达的参与免疫应答的病原体蛋白质亚单位。最近，重组DNA技术已经用于尝试制备疱疹病毒缺失突变株或脊髓灰质炎病毒，其模拟天然发现的或已知宿主范围突变株的减毒病毒。直至1990年，负链RNA病毒还不能进行位点特异性操作，因而不能被遗传工程化。
尽管这些病毒只具有免疫原性而没有致病性从而是有益的，但它们难以在用于制备疫苗的传统培养基中繁殖。此外，减毒病毒可能具有过于缓和的毒力特性，以至于不能使宿主产生足以应对后续感染的免疫反应。
由于结合病毒的受体不同，人流感病毒不能在鸟中有效复制，反之亦然。相反，猪对人和鸟病毒的感染格外敏感，因为猪具有在人和鸟流感病毒中都存在的受体型。因而，推测猪是人鸟病毒重组体的“混合容器”宿主，并且有几个研究支持此理论。参见例如，Shu等，1994，Virology 202825-33；Scholtissek，1990，Med.Principles Pract.265-71；Zhou等，1999 J Virol.738851-6。这种混合有利于新的人流感病毒株的产生，引发流感全面流行。
失活或“杀灭”流感病毒制剂是目前在美国批准的仅有的流感疫苗。将病毒疫苗替代病毒病原体被“杀灭”的失活病毒疫苗的可选择的途径涉及利用能够复制但不致病的减毒活病毒疫苗。鼻内给药的活疫苗相对其失活的对应疫苗具有优越性。首先，现在认为活疫苗可改善交叉反应性细胞介导的细胞毒作用以及体液抗体反应，提供比失活疫苗更好的保护(Gorse and Belshe，1990，J.Clin.Microbiol.282539-2550；和Gorse等，1995，J.Infect.Dis.1721-10)。其次，活疫苗具有鼻内给药的优越性，避免了肌肉内注射失活佐剂疫苗偶尔引起的肿胀和肌肉疼痛。这些活疫苗被报道不仅能够诱导抗同型流感病毒的体液反应而且能够诱导交叉反应性细胞介导的细胞毒作用。活疫苗的其它优越性包括易于鼻内给药、诱导粘膜免疫、更长的持久性免疫和成本效率。这些是潜在的猪流感疫苗的重要考虑因素。
因此，亟需由此技术产生用于预防猪流感病毒感染的新的更有效的疫苗和免疫原性制剂。
3.发明概述本发明提供拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒、制备这种减毒猪流感病毒的方法、以及这种病毒在疫苗和药物制剂中的应用。这种疫苗能够产生免疫反应并形成免疫性，但不致病或很少引起和/或较少引起严重症状，即该病毒具有降低的毒力。因此它们是活疫苗理想的候选。而且，该减毒病毒可诱导具有其它体内生物学后果的有力的IFN反应，提供对抗后续感染性疾病的保护和/或诱导抗肿瘤反应。因此，该减毒病毒可以在药物中使用来预防和治疗其它感染性疾病和/或IFN可治疗性疾病。
本发明部分基于申请人的发现，即经工程化在NS1基因中含有或包含缺失的猪流感病毒相对于野生型猪流感病毒具有减弱的复制性，如被感染的猪肺病灶较少、在支气管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度降低、鼻擦拭签检测的病毒减少。惊奇的是，与小鼠模型中观察到的人流感病毒的结果相反，NS1蛋白的长度不与猪流感病毒的减毒性相关。申请人发现，对于猪流感病毒，具有最短NS1蛋白的突变株病毒减毒是最少的。换言之，与含有较长缺失的NS1基因的猪流感病毒或野生型猪流感病毒比较，含较短缺失的NS1基因的猪流感病毒表现较高的体内减毒。申请人进一步发现重组猪流感病毒体外抑制IFN产生的能力受损，并且它们在10天的含胚鸡蛋、MDCK细胞、PK-15细胞或猪体内模型中不象其亲代重组株一样有效地复制。不意欲受任何猪流感病毒NS1缺失突变株的体内作用机制的理论或结实的限制，推测是由NS1蛋白的表达水平、诱导有力的细胞IFN反应的能力和拮抗这种反应的能力受损引起这种病毒减毒特征。然而，这种病毒的有益特征并不能全归因于其对细胞干扰素反应的作用。事实上，其它与NS1相关的活性改变，例如，改变前mRNA剪接，对mRNA聚腺苷酸化、含poly(A)mRNA的核-胞浆转运、和刺激病毒蛋白合成的抑制，都可能有助于通过在猪流感病毒NS1基因中诱导突变来实现所需的减毒表型。
本发明的减毒猪流感病毒包括猪流感病毒NS1基因的突变，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力。在一个实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含有猪流感病毒NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验、组织培养感染剂量50(TCID50)、蛋感染剂量50(EID50)等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。可供选择地，可在无血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培养基生长的细胞(例如，猪细胞、MDCK细胞等)中增殖病毒。
在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括包含猪流感病毒NS1基因突变的基因组，该突变减弱了NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。
用于本发明的猪流感病毒可选自具有所需表型(即拮抗细胞IFN反应的能力受损)的天然发生株、变体或突变株；诱导突变的病毒(例如，通过暴露在诱变剂下产生的病毒，反复传代和/或在非许可宿主中传代)；重组体；和/或遗传工程化病毒(例如，利用“反向遗传学”和基于质粒的无辅助(helper-free)技术)。具有所需干扰素拮抗表型的天然发生株、变体和突变株、重组体和/或遗传工程化的病毒可以根据在下文所述的其它试验的细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中的差别生长来选择。在某些实施方案中，本发明的猪流感病毒为遗传工程化病毒。在其它的实施方案中，本发明的猪流感病毒是非天然发生株、变体和突变株和/或重组体。
在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含猪流感NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，或者当病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞产生蚀斑时，通过对猪BALF或猪细胞上清液进行血细胞凝集试验测定，。在一个实施方案中，将本发明减毒猪流感病毒的生长与具体标准或参照比较，例如与野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比较。根据这些实施方案，减毒病毒可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如，外源病原体或肿瘤抗原的抗原决定簇。优选地，该非猪流感病毒序列不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，不将编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列工程化到猪流感病毒中。
本发明提供包括在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3或至少4种或更多突变的基因组的减毒猪流感病毒，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因，并有助于或导致(直接或间接)病毒的减毒和/或病毒拮抗细胞干扰素反应的能力受损。在一个实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3或至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因并导致NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力减弱，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过血细胞凝集试验测定。
在具体的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在2个、3个、4个或更多个猪流感病毒基因中含至少2、至少3、至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因并导致NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力减弱，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下时(例如在MDCK细胞中)，在感染后约2至0天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过血细胞凝集试验测定。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在2个、3个、4个或更多个猪流感病毒基因中含至少2、至少3、至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因并导致该病毒的减毒，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下(例如在MDCK细胞中)，感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过血细胞凝集试验测定。根据这些实施方案，所述减毒病毒具有受损的干扰素拮抗表型并可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如，外源病原体的抗原决定簇(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇、以及非病毒性猪病原体的抗原决定簇，例如细菌包括但不限于布鲁氏菌(Brucella suis)，以及寄生虫包括但不限于蛔虫(Ascaris suum)、鞭虫(Trichuris suis)的抗原决定簇，或肿瘤抗原例如癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原决定簇、癌抗原-50(CA-50)、与乳腺癌相关的癌抗原15-3(CA15-3)、癌症相关抗原(CAA)、黑素瘤抗原以及黑素瘤相关抗原100、25和150)。优选地，所述非猪流感病毒序列(异源序列)不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽和肽的核酸序列优选不被工程化到猪流感病毒中。
猪流感病毒NS1基因中的突变包括(或者，由以下组成)任何导致所需表型(即，拮抗细胞干扰素反应的能力受损)的突变。可包括在或引入猪流感病毒NS1基因中的突变类型的实例包括但不限于缺失、替代、插入以及上述的组合。一种或多种突变可位于整个NS1基因的任意处，即，在调控区、非编码区和/或编码区(例如，氨基末端和/或羧基末端或之间的某些地方)。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在氨基末端含有突变(例如，缺失或取代)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在羧基末端含有突变(例如，缺失或取代，优选缺失)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在猪流感病毒NS1基因中含有突变的的基因组，该突变导致自NS1羧基末端缺失5、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、100、105、110、115、119、120、121、125、130、135、140、145、146、147、148、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基，或者自NS1羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、90-160、100-160或105-160、90-150、5-75、5-50或5-25氨基酸残基。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在猪流感病毒NS1基因中含突变的的基因组，该突变导致除了氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60外，其它所有NS1基因产物的氨基酸残基都缺失，其中氨基末端氨基酸为序号1。根据这些实施方案，减毒猪流感病毒优选是遗传工程化的。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒为TX/98/del 126、TX/98/del 99或TX/98/del 73。
本发明的减毒猪流感病毒可以是表达异源序列的嵌合病毒。优选地，该异源序列不是改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，优选地，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列不被工程化到猪流感病毒中。在某些实施方案中，嵌合病毒表达肿瘤抗原。在其它的实施方案中，嵌合病毒表达外源病原体的抗原决定簇。
具有所需表型的减毒猪流感病毒本身可做为疫苗、药物制剂或免疫原性制剂的活性成分。可供选择地，该减毒猪流感病毒可用作重组制备的疫苗或免疫原性制剂的载体或“骨架”。为此，“反向遗传学”技术或无辅助(helper-free)质粒方法可用于在可作为“亲代”株的减毒猪流感病毒中进行工程化突变或引入外源抗原决定簇。以这种方式，疫苗可以被设计成针对株变体进行免疫，或者可选择地针对完全不同的感染因子或疾病抗原进行免疫(例如，肿瘤抗原)。例如，该减毒猪流感病毒可被工程化以表达其它预先选定株的中和性抗原表位。可选择地，其它病毒的抗原决定簇可被构建到该减毒猪流感病毒中。可选择地，非病毒感染病原体(例如，寄生虫，细菌，真菌)的抗原决定簇抗能够被构建到该猪流感病毒中。
在特定的实施方案中，重组技术可用于将来自亲代的猪流感病毒株减毒表型(天然突变、诱导突变病毒或遗传工程化病毒)转移到不同的病毒株(野生型病毒、天然突变株、诱导突变病毒或遗传工程化病毒)。根据此实施方案，“反向遗传学技术”或无辅助(helper-free)质粒方法可以被用来在可以用作“亲代株”的减毒猪流感病毒中工程化突变或引入外源抗原决定簇。
本发明提供免疫个体的方法，包括给予含有减毒猪流感病毒和生理学上有效的赋形剂的疫苗制剂，该减毒猪流感病毒在猪流感NS1基因中含有减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力的突变。在一个实施方案中，本发明提供了包括给予有效量本发明疫苗制剂的方法。在某些实施方案中，所给予的疫苗制剂的剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu或约104至约5×106pfu。在其它实施方案中，所给予的疫苗制剂的剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
本发明提供了包括本发明减毒猪流感病毒的免疫原性制剂和包括给予个体本发明免疫原性制剂用于诱导免疫反应的方法，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状，或者不适(其中该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明免疫原性制剂的诱导免疫反应的方法，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状，或者不适(其中该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)。在某些实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu或约104至约5×106pfu，或者约104至约107pfu。在具体实施方案中，给予个体的免疫原性制剂含有减毒猪流感病毒的浓度为约104至约107pfu/ml。在其它实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
在个体中诱导有力的IFN反应的减毒猪流感病毒也可用于药物制剂中，以预防或治疗感染和IFN可治疗性疾病例如癌症。在这方面，可以改变该减毒猪流感病毒的趋向性，将病毒在体内施用(in vivo)或体外转移再回输(ex vivo)使之靶向所期望的靶器官、组织或细胞。利用此方法，可在靶点局部诱导IFN反应，从而避免系统性IFN治疗的副作用或使之最小化。为此目的，可将该减毒猪流感病毒工程化以表达对靶器官、组织或细胞受体特异的配体。
本发明提供包括给予个体本发明的药物制剂来预防、控制或治疗个体(例如，猪)的猪流感病毒感染外的其它感染或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体(例如，猪)猪流感病毒感染外的其它感染或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在某些实施方案中，给予个体的药物制剂剂量为约102至约1012、约102至约1010、约102至约108、约103至约109、约103至约107、约104至约108、约104至约5×106、约104至约107或约104至约1012pfu。在具体实施方案中，给予个体的药物制剂含有减毒流感病毒的浓度为约104至约1012pfu/ml。在其它实施方案中，药物制剂的给药剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
本发明提供包括给予个体本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体癌症的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体癌症的方法。在某些实施方案中，该药物制剂包括含有肿瘤抗原的猪流感病毒。在某些实施方案中，给予个体的药物制剂的剂量为约102至约1012pfu、约102至约1010pfu、约102至约108pfu、约103至约109pfu、约103至约107pfu、约104至约108pfu、约104至约5×106pfu或约104至约1012pfu。在其它实施方案中，该药物制剂的给药剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
申请人已经证明，干扰素拮抗活性受损的减毒猪流感病毒体内复制产生的滴度低于用野生型猪流感病毒所测的滴度，但该滴度足以诱导免疫和细胞因子反应。因此，减弱但不消除所述猪流感病毒的IFN拮抗活性的突变对于疫苗、免疫学和药物制剂是优选的。可选择这样的病毒在常规和非常规培养基中生长，并具有中等毒力。
本发明提供含有(或者，包含)本发明猪流感病毒的细胞。在具体实施方案中，细胞含有/包含遗传工程化的猪流感病毒。在某些实施方案中，细胞中含有的减毒猪流感病毒被工程化以编码来自另一病原体(例如，另一种病毒)的抗原决定簇或肿瘤抗原。根据此实施方案，该减毒猪流感病毒的基因组可以包括至少一种来自不同病毒的片段。任何细胞都可以含有或包括本发明的减毒猪流感病毒，或被该病毒感染，这些细胞包括但不限于MDCK细胞、PK细胞、Vero细胞、原代人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞株、HeLa细胞和猪胚胎肾细胞RES。在优选的实施方案中，所述细胞为猪细胞或猪细胞株。在某些实施方案中，所述细胞(例如，猪细胞或猪细胞株)为干扰素缺陷的。
在某些其它实施方案中，本发明的猪流感病毒被包含在10天、6-9天、6-8天、6-7天龄的含胚鸡蛋中。在具体实施方案中，该病毒被包含在这样的蛋的尿囊腔中。在另一具体实施方案中，该病毒被包含在这样的蛋的羊膜腔中。
本发明包括用培养基例如细胞、细胞株和含胚蛋来增殖本发明的减毒猪流感病毒。在一个实施方案中，本发明提供制备疫苗产品和药物产品的方法，包括在培养基中增殖本发明的减毒猪流感病毒，并收集子代病毒，其中培养基为细胞、细胞株或含胚蛋。在某些实施方案中，培养基为IFN缺陷系统。示例的IFN缺陷系统包括但不限于早期含胚蛋(例如，6-10天、6-9天、6-8天或6-7天龄的含胚疋)和IFN缺失的细胞株(例如VERO细胞或例如STAT1敲除的遗传工程化细胞株)。含胚蛋或用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸、核酶等)预处理的细胞株也可用作IFN缺陷系统。此外，IFN系统缺陷的蛋，例如，由STAT1阴性的鸟特别是家禽包括但不限于转基因鸡、鸭或火鸡生的蛋，可用作IFN缺陷系统。
3.1术语这里所用术语“约”或“大约”当与数字联用时，指所用数字的1％、5％或10％内的任何数字。
这里所用短语NS1的“氨基末端”指猪流感病毒NS1蛋白的从氨基末端氨基酸残基(氨基酸残基1)至氨基酸残基115、氨基酸残基1至100、氨基酸残基1至75、氨基酸残基1至50、氨基酸残基1至25或氨基酸残基1至10。
当猪流感病毒NS1蛋白的氨基末端是氨基酸残基1至氨基酸残基115、氨基酸残基1至100、氨基酸残基1至75、氨基酸残基1至50或氨基酸残基1至25时，这里所用短语NS1的“羧基末端”分别指猪流感病毒NS1蛋白的氨基酸残基116至羧基末端氨基酸残基、氨基酸残基101至羧基末端氨基酸残基、氨基酸残基76至羧基末端氨基酸残基、氨基酸残基51至羧基末端氨基酸残基或氨基酸残基26至羧基末端氨基酸残基。从羧基末端的缺失可包括自NS1羧基末端的5、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基的缺失。
这里所用术语“细胞因子受体调节剂”指调节细胞因子受体磷酸化、与细胞因子受体相关的信号转导途径活化和/或特定蛋白例如细胞因子的表达的试剂。这种试剂可直接或间接调节细胞因子受体磷酸化、与细胞因子受体相关的信号转导途径活化和/或特定蛋白例如细胞因子的表达。因此，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于细胞因子、细胞因子片段、融合蛋白和与细胞因子受体或其片段免疫特异性结合的抗体。此外，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于肽、多肽(例如，可溶性细胞因子受体)、融合蛋白和与细胞因子受体或其片段免疫特异性结合的抗体。
这里所用术语“有效量”指治疗(例如，预防性试剂或治疗试剂)的量，该量足以减轻和/或改善不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、其它感染(例如，另一种病毒感染)、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可用做载体来介导针对与所述不适相关的特定抗原的免疫反应))的严重程度和/或持续时间、预防不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、其它感染(例如，另一种病毒感染)、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可用做载体来介导针对与所述不适相关的特定抗原的免疫反应))的进展、引起不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状，其它感染(例如，另一种病毒感染)、或IFN可治疗性疾病)的康复、防止一种或多种与不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、其它感染(例如，另一种病毒感染)、或IFN可治疗性疾病)相关的症状复发、发展或发生，降低猪流感病毒的滴度，或增强或改善另一种治疗性试剂(例如，预防或治疗试剂)的预防或治疗作用。
这里所用术语“抗原决定簇”指在动物，优选哺乳动物，最优选猪中具有抗原或免疫原活性的多肽或蛋白的位点或片段。具有免疫原活性的抗原决定簇是引发动物抗体反应的多肽或蛋白的位点或片段。具有抗原活性的抗原决定簇是用本领域所属技术人员熟知的任何方法例如免疫分析所确定的、与抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白的位点或片段。
这里在描述蛋白质性试剂的情况下所使用的术语“片段”指包含肽、多肽或蛋白质氨基酸序列的至少2个连续的氨基酸残基、至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基或至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，全长蛋白质的片段保留了全长蛋白的活性，例如IFN拮抗活性。在另一实施方案中，全长蛋白质的片段不保留全长蛋白质的活性，例如IFN拮抗活性。
这里在描述核酸的情况下所使用的术语“片段”指包含编码肽、多肽或蛋白的核酸序列的至少2个连续的核苷酸、至少5个连续的核苷酸、至少10个连续的核苷酸、至少15个连续的核苷酸、至少20个连续的核苷酸、至少25个连续的核苷酸、至少30个连续的核苷酸、至少35个连续的核苷酸、至少40个连续的核苷酸、至少50个连续的核苷酸、至少60个连续的核苷酸、至少70个连续的核苷酸、至少80个连续的核苷酸、至少90个连续的核苷酸、至少100个连续的核苷酸、至少125个连续的核苷酸、至少150个连续的核苷酸、至少175个连续的核苷酸、至少200个连续的核苷酸、至少250个连续的核苷酸、至少300个连续的核苷酸、至少350个连续的核苷酸或至少380个连续的核苷酸的核酸。在优选的实施方案中，核酸片段编码的肽或多肽保留全长蛋白的活性，例如IFN拮抗活性。在另一实施方案中，全长蛋白质的片段不保留全长蛋白质的活性，例如IFN拮抗活性。
这里所用短语“异源序列”指任何通常不是天然存在或与所关注的核酸或蛋白质、多肽或肽序列不天然相关的核酸序列或蛋白质、多肽或肽序列。例如，“异源序列”可指来自不同种属的序列。
这里所用术语“联合”(或“组合”)指使用超过一种治疗(例如，多于一种预防试剂和/或治疗试剂)。术语“联合”的使用不限制给予有不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状，另一种感染(例如，另一种病毒感染)或IFN可治疗性疾病)的个体治疗性试剂(例如，预防性试剂和/或治疗试剂)的顺序。可以在给予具有不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状，另一种感染(例如，另一种病毒感染)或IFN可治疗性疾病)的个体第二治疗性试剂(例如，第二预防或治疗试剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)给予第一治疗(例如，第一预防性试剂或治疗试剂)。
这里所用短语“干扰素拮抗活性”指降低或抑制细胞干扰素免疫反应的蛋白质或多肽，或其片段、衍生物或类似物。特别是，具有干扰素拮抗活性的蛋白或多肽，或其片段、衍生物或类似物(例如，猪流感病毒NS1)降低或抑制干扰素表达和/或活性。在具体实施方案中，短语“干扰素拮抗活性”指降低或抑制细胞干扰素免疫反应的猪流感病毒蛋白或多肽，或其片段、衍生物或类似物。具有干扰素拮抗活性的猪流感病毒蛋白或多肽可优选地影响一种或两种类型干扰素(IFN)的表达和/或活性。在一个实施方案中IFN-α的表达和/或活性被影响。在另一实施方案中，IFN-β的表达和/或活性被影响。在一个实施方案中，IFN-γ的表达和/或活性被影响。在某些实施方案中，在有IFN活性的系统(IFN-competent systems)例如野生型细胞或动物中在相同条件下，与对照(例如，PBS或无干扰素拮抗活性的蛋白质)相比，具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽等使IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多。在某些实施方案中，在有IFN活性的系统中，在相同条件下，与对照(例如，PBS或无干扰素拮抗活性的蛋白质)相比，具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽等使IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性降低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍、约1至约10倍，或约1至约5倍，或约40至约80倍，或者1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
这里所用短语“IFN缺陷系统”或“IFN缺失培养基”指不产生IFN或产生低水平IFN(即，在相同的条件下与有IFN活性的系统比较，IFN表达减少5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)、对IFN没有反应或反应效率低、和/或由IFN诱导的一种或多种抗病毒基因的活性缺失的系统，例如细胞、细胞株和动物例如猪、小鼠、鸡、火鸡、兔子、大鼠等。
这里所用短语“IFN诱导性表型”指这样的表型，病毒相对于野生型病毒显示增加的细胞干扰素反应，该表型典型地抑制或减少细胞干扰素介导的反应。
这里所用短语“IFN可治疗性病症”、“IFN可治疗性疾病”以及类似短语指可通过给予IFN(IFN-α，β，γ或其任意组合)来预防、治疗、控制或改善的不适。如果猪流感病毒感染其它物种，则IFN可治疗的病症不限于猪。猪的IFN可治疗病症的实例包括但不限于口蹄疫、猪嗜血杆菌肺炎(PHP)、以及由例如胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)、溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(P.multocida)、睡眠嗜血杆菌(H.somnus)以及A.suis感染所引起其它病症。
这里就IFN拮抗活性所用的短语“中间”表型指这样的表型，其可激发较强的免疫反应，但同时是减毒的，因为具有中间表型的病毒不能克服宿主的IFN反应。特别地，与野生型病毒相比，中间表型能够刺激免疫反应并抑制/降低IFN仅至其允许较少的病毒复制轮次或病毒颗粒数量的程度，这可以用本领域熟知的技术来测定(例如，通过较低的空斑滴度或血细胞凝集试验来测定)。
这里在描述病毒的情况下所使用的术语“分离的”指来自单一亲代病毒的病毒。可利用本领域所属技术人员公知的常规技术来分离病毒，这些技术包括但不限于基于空斑纯化(plaque purification)和限制性稀释(limiting dilution)的技术。
这里所用术语“控制”指个体从治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)中获得的有益效果，其不能治愈所述疾病。在某些实施方案中，给予个体一种或多种治疗(例如，一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)来“控制”疾病从而防止所述疾病进展或恶化。
这里所用短语“感染复数”或“MOI”指每个被感染细胞的平均病毒数量。MOI由加入的病毒数量(加入的ml×PFU)除以加入的细胞数量(加入的ml×细胞/ml)测得。
这里在描述含有或包含非猪流感病毒序列的猪流感病毒的情况下所用短语“非猪流感病毒”指任何包含与猪流感病毒异源(即未发现与猪流感病毒天然相关)的序列(例如，核酸或氨基酸序列)的流感病毒株或分离株。
这里所用短语“NS1基因”指在流感病毒中编码非结构性蛋白(NS1)的基因。NS1是由分段的A型流感病毒基因组和其它病毒编码的8种分子之一。“猪流感病毒NS1基因”是从猪流感病毒分离的NS1基因。代表性的猪NS1基因可在公共序列数据库例如Genbank中找到，包括但不限于Genbank编号AJ293939(A/swine/Italy/13962/95(H3N2))和Genbank编号AJ344041(A/swine/Cotesd′Armor/1121/00(H1N1))。“NS1基因产物”指由NS1基因编码的基因产物(例如，RNA或蛋白)。如果是蛋白质，该NS1基因产物是全长的并具有野生型NS1的活性(例如，来自流感病毒A/swine/Texas/4199-2/98的基因产物)。“猪流感病毒NS1基因产物”指由猪流感病毒NS1基因编码的基因产物(例如，RNA或蛋白)。如果是蛋白质，该猪流感病毒NS1基因产物是全长的并具有野生型猪流感病毒NS1的活性，例如，来自A/swine/Texas/4199-2/98。
这里所用术语“防止”和“预防”指通过给予个体治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)或者给予联合治疗性试剂(例如，预防性试剂或治疗性试剂的组合)来抑制不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适，或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的发展和发生，或者预防不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适，或者IFN可治疗的不适)的一种或多种症状的复发、发生或发展。
这里所用术语“预防性试剂”指任何可用于预防不适或其症状(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的试剂。优选地，预防性试剂是已知可以用于或已经用于或正在用于预防或阻止猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的发生、发展、进展和/或严重程度的试剂。
这里所用术语“预防有效量”指治疗(例如，预防性试剂)的量，该量足以预防不适或其症状(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的发展、复发或发生，或者增强或改善另一种疗法(例如，预防性试剂)的预防效果。
这里在描述病毒时所用的短语“纯化的”指基本上不含细胞材料和培养基(病毒从这些细胞或培养基中分离)的病毒。“基本上不含细胞材料”的描述包括病毒与细胞(该病毒从其中分离或重组产生)的细胞组分分离的病毒制剂。因此，基本上不含细胞材料的病毒包括含有的细胞蛋白质(这里也称为“杂质蛋白质”)低于约30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制剂。该病毒也基本上不含培养基，即培养基占病毒制剂的体积低于约20％、10％或5％。可利用本领域所属技术人员公知的常规方法来纯化病毒，包括但不限于层析或离心。
这里所用术语“个体”或“患者”可以相互替代使用。这里所用术语“个体”指动物(例如，鸟、爬行动物和哺乳动物)，优选哺乳动物包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，个体或患者被猪流感病毒感染。在某些实施方案中，哺乳动物为0至6月、6至12月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁。在优选的实施方案中，个体或患者为猪。在某些实施方案中，猪为0至6月、6至12月、1至5岁、5至10岁或10至15岁。猪的自然寿命为10-15年。
这里所用的“猪流感病毒”指引起猪流感的来自正粘病毒家族的A型或C型流感病毒。正粘病毒有三类A型、B型和C型，仅A型和C型流感病毒感染猪。猪流感病毒的亚型包括H1N1、H1N2、H3N2和H3N1。H9N2和H5N1可以在猪中发现。在某些实施方案中，猪流感病毒为分离自猪的流感病毒。在优选的实施方案中，猪流感病毒含有猪NS1基因。可在例如Genbank的公共数据库中找到代表性的猪NS1基因，其包括但不限于Genbank编号AJ293939(A/swine/Italy/13962/95(H3N2))和Genbank编号AJ344041(A/swine/Cotesd′Armor/1121/00(H1N1))。猪流感病毒变体的实例包括但不限于A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Car-olina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wiscon-sin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。
这里所用术语“协同的”指比任何两种或更多种单独治疗(例如，一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)的相加作用更有效的治疗(例如，预防或剂治疗性试剂)组合。治疗性试剂组合(例如，预防性试剂或治疗性试剂的组合)的协同作用使得可以给予不适的个体(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))更少量的一种或多种治疗性试剂(例如，一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)和/或更低频率地给予所述治疗性试剂。使用较低剂量的治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)和/或施用治疗性试剂的频率减少能够降低与给予个体所述治疗性试剂相关的毒性，但不降低所述治疗性试剂预防或治疗不适(例如，猪流感病毒感染或其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的效力。此外，协同作用可提高治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)预防或治疗不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的效力。最后，治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)组合的协同作用可避免或减少与使用任何单一治疗性试剂相关的不良反应或不期望的副作用。
这里所用术语“T细胞受体调节剂”指调节T细胞受体磷酸化、与T细胞受体相关的信号转导途径的活化和/或特定蛋白质例如细胞因子的表达的试剂。这种试剂可直接或间接地调节T细胞受体的磷酸化、与T细胞受体相关的信号转导途径的活化和/或特定蛋白质例如细胞因子的表达。T细胞受体调节剂的实例包括但不限于与T细胞受体免疫特异性结合的肽、多肽、蛋白质、融合蛋白和抗体或其片段。此外，T细胞受体调节剂的实例包括但不限于与T细胞受体的配体免疫特异性结合的蛋白质、肽、多肽(例如，可溶性T细胞受体)，融合蛋白和抗体或其片段。
这里所用术语“治疗有效量的”指治疗的量，该量足以减少不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适(例如，流感导致的流产、抑郁、食欲不振、厌食、呼吸困难、肌痛、下颌下淋巴结肿大)、猪流感病毒感染外的其它感染或其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的严重程度，缩短不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的持续时间，降低猪流感病毒或其它病毒的滴度，减少其它病原体的数量，改善不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的一种或多种症状，防止不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适，猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状，或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的发展，使不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))康复，或者增强或改善另一种治疗性试剂的治疗效果。
这里所用术语“治疗”可以是任何能够用于预防、治疗、控制或改善不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的具体抗原的免疫反应))的方案、方法、组合物、剂型和/或试剂。在某些实施方案中，所用术语“治疗”指所属本领域技术人员公知用于预防、治疗、控制或改善猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的生物治疗、支持治疗和/或其它治疗。
这里所用术语“治疗”指任何用于预防、治疗、控制或改善不适或其症状(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的试剂。优选地，治疗性试剂是已知可以用于、或已被用于或正在用于预防、治疗、控制或改善猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的试剂。
这里所用术语“处理”指通过给予一种或多种治疗(包括但不限于，给予一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)根除或控制猪流感病毒的复制或非猪流感病毒病原体(例如，病毒)的复制、降低猪流感病毒或猪流感病毒外其它病毒的复制、降低病原体的数量、降低或改善不适(猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善一种或多种症状。
这里所用术语“肿瘤抗原”指可被免疫T细胞或抗体识别的肿瘤细胞上的分子。肿瘤抗原包括那些仅在肿瘤细胞上表达的抗原(肿瘤特异性抗原)以及在正常细胞上存在但在肿瘤细胞上优势或异常表达的的分子(肿瘤相关抗原)。肿瘤抗原的实例包括但不限于肉瘤抗原、前列腺癌抗原、纤维肉瘤抗原、自主分化抗原例如癌胚抗原、或由恶性细胞表达的分化抗原包括但不限于癌胚抗原例如结肠癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白、移行细胞膀胱癌175kDa小鼠抗原的人抗原性对应物或功能等同物、黑素瘤相关抗原p97或GD3，以及人肺癌分化抗原例如L6和L20。
这里所用短语“野生型猪流感病毒”指流行的、天然循环的并引起典型疾病爆发的猪病毒类型。野生型猪流感病毒的实例包括但不限于A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/NorthCarolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Onta-rio/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tenne-ssee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisc-onsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98及A/Swine/Wisconsin/14094/99。
4.


图1A-1B，含NS1突变蛋白的质粒衍生的Sw/Tx/98流感病毒的生成。图1A为野生型和突变的NS流感病毒基因片段的示意图。NS基因片段被修饰从而产生分别编码73、99和126aa的突变NS1基因。NS1突变不影响NEP蛋白的序列。下划线序列被引入形成终止密码子(粗体)。图1B为rWT和NS1缺失突变病毒的RT-PCR分析。利用对所有8个流感病毒片段非编码区特异的引物来扩增流感病毒RNA片段。箭头所指显示NS片段变短。点显示由于内部结合正向引物生成的对应于HA基因片段3′末端的产物。
图2A-2D，组织培养物中质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒的表征。图2A显示在PK-15细胞中野生型和NS1缺失突变株的多周期生长曲线。图2B显示在PK-15细胞中野生型和NS1缺失突变株的单周期生长曲线。图2C显示感染后3天MDCK细胞中的空斑大小。图2D显示病毒蛋白表达的时间过程。在所指示的感染后时间，用rWT和NS1突变的病毒感染(MOI＝2)PK-15细胞并用[35S]Met-Cys标记。将细胞提取物进行SDS-PAGE并通过放射自显影来分析。
图3A-3C，在质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染的PK-15细胞中诱导I型IFN。图3A显示在荧光分析中感染了病毒的细胞分泌IFN的IFN生物分析水平示意图。图3B显示I型IFN合成的时间过程。新鲜的PK-15细胞用UV-灭活的上清液(在感染后不同时间收集)处理24小时，该上清液来自被病毒感染随后用VSV-GFP感染的PK-15细胞。感染后16小时，用荧光显微镜观察表达GFP的细胞，IFN和TNF-α的诱导。图3C显示病毒感染的PK-15细胞中TNF-α、IFN-β-和β-actin-特异性mRNA的RT-PCR分析。
图4A-4C，质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染4周龄猪。图4A显示被质粒衍生的TX/98缺失病毒感染的猪肺组织病理学评分的条形图。在感染后第5天，具有肉眼可见损伤的肺表面的平均百分比(±SEM)。图4B显示在感染后第5天，中细支气管的显微损伤。图4C显示在感染后第5天，支气管肺泡灌洗液的病毒滴度。
图5A-5D，质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染的猪的肺组织病理学检验，200x放大。图5A显示非感染对照猪肺的中等大小细支气管。上皮层完整，周围的肺泡正常。图5B显示由rWT TX/98病毒感染导致的严重急性坏死性细支气管炎和以广泛病灶为特征的间质性肺炎。图5C显示缺失突变株1-99病毒感染早期恢复中的一个正常细支气管和一个损伤细支气管，代表由该病毒感染导致的损伤程度较低。图5D显示1-126病毒接种的猪的肺正常细支气管和周围肺泡。该病毒不导致病灶。
图6A-D，质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染的猪的肺组织病理学检验，200x放大。图6A显示未感染的对照猪肺的较大细支气管上皮层。上皮细胞为高柱状，具有假复层基底核和突出的表面纤毛。图6B显示TX/98 rWT病毒感染猪肺的较大细支气管上皮层。由于上皮细胞坏死和再生性增生导致上皮层完全混乱。图6C显示缺失突变株1-99病毒感染的猪的肺大细支气管和较小支气管气道，表示由该病毒导致的损伤程度较低。图6D显示1-126病毒接种的猪的肺正常上皮层。不产生细支气管损伤。
图7，TX/98/del 126预防免疫的猪的组织病理学。图7显示预防免疫了TX/98/del 126的猪的肺组织病理学评分。对照＝未预防免疫、模拟注射的猪；H3N2＝给每只未预防免疫的猪接种2×105PFU A/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝给每只未预防免疫的猪接种2×105PFU A/Swine/MN/37866/99；MLV+对照＝用TX/98/del 126预防免疫的，模拟接种的猪；MLV+H3N2＝给每只TX/98/del 126预防免疫的猪接种2×105PFU A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝给每只TX/98/del 126预防免疫的猪接种2×105PFUA/Swine/MN/37866/99。
图8TX/98/del 126-预防免疫的猪的SIV-抗原免疫组织化学。图8显示描述TX/98/del126预防免疫的猪的免疫组织化学评分条形图。对照＝未预防免疫的、模拟接种的猪；H3N2＝给未预防免疫的每只猪接种2×105PFUA/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝给未预防免疫的每只猪接种2×105PFUA/Swine/MN/37866/99；MLV+对照＝用TX/98/del 126预防免疫的、模拟接种的猪；MLV+H3N2＝给TX/98/del 126预防免疫的每只猪接种2×105PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝给TX/98/del 126预防免疫的每只猪接种2×105PFU的A/Swine/MN/37866/99。
图9用H3N2和H1N1SIV感染TX/98/del 126免疫了的猪的肺灌洗液中病毒滴度。图9显示描述TX/98/del 126免疫了的猪的肺灌洗液中病毒滴度的条形图。对照＝未预防免疫的、假接种的猪；H3N2＝给未预防免疫的每只猪接种2×105PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝给未预防免疫的每只猪接种2×105PFU的A/Swine/MN/37866/99；MLV+对照＝用TX/98/del 126预防免疫的、模拟接种的猪；MLV+H3N2＝给TX/98/del 126预防免疫的每只猪接种2×105PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝给TX/98/del 126预防免疫的每只猪接种2×105PFU的A/Swine/MN/37866/99。病毒的检测限度为101.5TCID50/ml。
5.发明详述本发明提供拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒、制备这种减毒猪流感病毒的方法，以及这种病毒在疫苗和药物制剂中的用途。这种疫苗能够产生免疫反应并产生免疫性，但不引起疾病或引起较少和/或不太严重的症状，即该病毒的毒力降低。因此它们是活病毒疫苗理想的候选者。此外，该减毒猪流感病毒可诱导有力的IFN反应，这种反应具有其它体内生物学后果，提供对抗后续感染性疾病的保护和/或诱导抗肿瘤反应。因此，该减毒猪流感病毒可以在药学上使用来预防和治疗其它感染性疾病和/或IFN可治疗性疾病。
本发明部分基于申请人的以下发现工程化使NS1基因含有缺失的猪流感病毒相对于野生型猪流感病毒其复制受损，例如被感染的猪有较少肺损伤、在支气管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度降低、鼻擦拭签检测到的病毒减少。惊奇的是，与观察到的小鼠模型中人流感病毒的结果相反，NS1蛋白的长度不与猪流感病毒的减毒水平相关。申请人发现，对于猪流感病毒，具有最短NS1蛋白的突变病毒减毒最小。换言之，与NS1基因含有较长缺失的猪流感病毒或野生型猪流感病毒相比，NS1基因含较短缺失的猪流感病毒表现较高的体内减毒。申请人进一步发现重组猪流感病毒体外抑制IFN产生的能力受损，并且它们在10天含胚鸡蛋、MDCK细胞、PK-15细胞或体内猪模型中不象其亲代重组株一样有效复制。不意欲受任何猪流感病毒NS1缺失突变株的体内作用机制的理论或解释的限制，推测这种病毒的减毒特征是由其NS1蛋白的表达水平、诱导有力的细胞IFN反应的能力、以及拮抗这种反应的能力受损所引起。然而，这种病毒的有益特征并不能单一地归因于其对细胞干扰素反应的作用。事实上，其它与NS1相关的活动(例如改变前mRNA剪接、抑制细胞mRNA聚腺苷酸化、抑制含poly(A)mRNA的核-胞浆转运、刺激病毒蛋白合成)的改变，可有助于通过在猪流感病毒NS1基因中引入突变来实现所需的减毒表型。
本发明减毒猪流感病毒包括猪流感NS1基因的突变，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力。在一个实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含有猪流感病毒NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验、蛋感染剂量(EID50)、组织培养感染剂量(TCID50)等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。可选择地，可在无血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培养基生长的细胞(例如，猪细胞、MDCK细胞等)中增殖病毒。在一个实施方案中，将本发明的减毒猪流感病毒的生长与具体的标准或参考比较，例如，与野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比较。
在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含猪流感NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、10、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验、蛋感染剂量(EID50)、组织培养感染剂量(TCID50)等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。可选择地，可在无血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培养基生长的细胞(例如，猪细胞、MDCK细胞等)中增殖病毒。
具有所需表型的减毒猪流感病毒本身可做为疫苗、药物制剂或免疫原性制剂的活性成分。可选择地，该减毒猪流感病毒可用作重组制备疫苗或免疫原性制剂的载体或“骨架”。为此，“反向遗传学”可用来在作为“亲代”株的减毒猪流感病毒中进行工程化突变或引入外源抗原决定簇。以这种方式，疫苗可以被设计成针对病毒株变体进行免疫，或者可供选择地针对完全不同的感染因子或疾病抗原(例如，肿瘤抗原)进行免疫。例如，该减毒猪流感病毒可被工程化以表达其它预先选定的病毒株的中和性抗原表位。可选择地，其它病毒的抗原决定簇可被构建到该减毒猪流感病毒中。可选择地，非病毒感染病原体(例如，寄生虫、细菌、真菌)的抗原决定簇抗能够被构建到该猪流感病毒中。
本发明提供包括给予本发明疫苗制剂以预防免疫个体的方法。在一个实施方案中，本发明提供了包括给予个体有效量的本发明疫苗制剂的方法。在某些实施方案中，给予个体的疫苗制剂剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu或约104至约5×106pfu。在其它实施方案中，所给予的疫苗制剂剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在其它实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu或约104至约5×106pfu。在另外一些实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
本发明提供了包含本发明的减毒猪流感病毒的免疫原性制剂和包括给予个体本发明免疫原性制剂来诱导免疫反应，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染以外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者下述不适(该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明免疫原性制剂来诱导免疫反应，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染以外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者下述不适(该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的方法。在某些实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu或约104至约5×106pfu，或者约104至约107pfu。在其它实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
在个体中诱导有力的IFN反应的减毒猪流感病毒也可用于药物制剂中，以预防或治疗其它感染或IFN可治疗性疾病例如癌症。在这方面，可以改变该减毒猪流感病毒的趋向性，将病毒在体内施用(in vivo)或体外转移再回输(ex vivo)使之靶向所期望的靶器官、组织或细胞。利用此方法，可在靶点局部诱导IFN反应，从而避免系统性IFN治疗的副作用或使之最小化。为此目的，可将该减毒猪流感病毒工程化以表达对靶器官、组织或细胞受体特异的配体。
本发明提供包括给予本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体的猪流感病毒感染以外的其它感染、或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病、或者由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予有效量的本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体的猪流感病毒感染以外的其它感染、或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病、或者由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在某些实施方案中，给予个体的药物制剂剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu、约104至约5×106pfu、或约104至约1012pfu。在其它实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。
本发明提供包括给予本发明药物制剂以预防、控制或治疗个体癌症的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予有效量的本发明药物制剂以预防、控制或治疗个体癌症的方法。在某些实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为约102至约108pfu、约103至约107pfu、约104至约5×106pfu或约104至约1012pfu。在其它实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。
申请人已经证明，干扰素拮抗活性受损的减毒猪流感病毒在体内复制产生的滴度低于用野生型猪流感病毒所测得的滴度，但该滴度足以诱导免疫的和细胞因子反应。因此，减弱但不消除该猪流感病毒的IFN拮抗活性的突变对于疫苗制剂是优选的。可选择这样的病毒在常规和非常规培养基中生长，并具有中等毒力。
本发明提供含有(或者，包含)本发明猪流感病毒的细胞。在具体实施方案中，细胞含有/包含遗传工程化的猪流感病毒。在某些实施方案中，细胞中含有的减毒猪流感病毒被工程化以编码来自另一病毒的抗原决定簇或肿瘤抗原。根据此实施方案，该减毒猪流感病毒的基因组可以包括至少一个来自不同病毒的片段。任何细胞都可以含有或包含本发明减毒猪流感病毒，或被该病毒感染，这些细胞包括但不限于MDCK细胞、PK细胞、Vero细胞、原代人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞株、HeLa细胞和猪胚胎肾细胞RES。在优选的实施方案中，所述细胞为猪细胞或猪细胞株。在某些实施方案中，所述细胞(例如，猪细胞或猪细胞株)为干扰素缺陷的。
本发明包括用培养基例如细胞、细胞株和含胚蛋来增殖本发明的减毒猪流感病毒。在一个实施方案中，本发明提供制备疫苗、免疫原性制剂和药物制剂的方法，包括在培养基中增殖本发明的减毒猪流感病毒，并收集子代病毒，其中培养基为细胞、细胞株或含胚蛋。在某些实施方案中，培养基为IFN缺陷系统。示例性的IFN缺陷系统包括但不限于早期含胚蛋(例如，6-10天、6-9天、6-8天或6-7天龄的含胚蛋)、IFN缺失的细胞株(例如VERO细胞或遗传工程化细胞株例如STAT1敲除的细胞)。含胚蛋或用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸、核酶等)预处理的细胞株也可用作IFN缺陷系统。此外，IFN系统缺陷的蛋，例如由STAT1阴性的鸟特别是家禽包括但不限于转基因鸡、鸭或火鸡生的蛋，可用作IFN缺陷系统。
5.1IFN拮抗活性改变的突变株的产生根据本发明，可选择并使用任何IFN拮抗活性降低的突变猪流感病毒或病毒株。在一个实施方案中，可选择拮抗细胞IFN反应的能力受损的天然存在的突变株或变体、或自然发生的猪流感病毒突变株。在另一实施方案中，可以通过将病毒暴露于诱变剂例如紫外线辐射或化学诱变剂、或者通过多次传代和/或在非许可宿主中传代产生突变的猪流感病毒。可在差异生长系统中筛选来选择IFN拮抗剂功能受损的那些突变株。因为A型猪流感病毒具有分段基因组，通过重组可将该减毒表型转移至具有所需抗原的另一株中(即，通过减毒病毒和所需株的共感染，并选择表现两种表型的重组体)。在具体实施方案中，本发明的猪流感病毒并非天然存在的病毒。在另一具体实施方案中，本发明的猪流感病毒为遗传工程化病毒。在另一具体实施方案中，本发明不包括在NS1基因中具有天然发生的突变的猪流感病毒。在另一实施方案中，本发明不包括在NS1基因中有突变的已知猪流感病毒。在具体实施方案中，本发明的猪流感病毒包含来自人流感病毒的全部和部分NS1基因。
利用“反向遗传学”方法可将突变工程化到猪流感病毒中。以此方式，赋予减毒表型的天然的或其它突变可被工程化到疫苗株中。例如，可以通过工程化实现猪流感病毒IFN拮抗活性的基因编码区(即，猪流感病毒的NS1)的缺失、插入和取代。也可考虑猪流感病毒IFN拮抗活性的基因非编码区的缺失、插入和取代。为此，可工程化使那些负责转录、复制、多聚腺苷酸化和/或包装IFN拮抗活性基因的信号发生突变。这种突变(例如启动子的突变)可下调猪流感病毒IF拮抗活性基因的表达。可使启动子发生突变，例如通过启动子穿梭(promotershuffling)(例如，B型流感病毒启动子))突变，或在NS1基因的非编码区发生突变。可调节猪流感病毒IFN拮抗活性基因的表达(即，猪流感病毒NS1基因)的猪流感病毒基因突变也在可用于本发明的病毒范围内。
本发明还提供包括包含NS1基因片段突变的基因组的猪流感病毒，该突变可以不导致IFN拮抗活性改变或IFN诱导表型，但引起病毒功能改变和减毒表型，例如，改变对含poly(A)的mRNA核输出的抑制、改变对前mRNA剪接的抑制、通过dsRNA螯合(sequestering)改变对PKR活化的抑制、对病毒RNA翻译作用的改变、和改变对宿主mRNA多聚腺苷酸化的抑制(例如，参见Krug inTextbook of Influenza，Nicholson等编.1998，82-92，以及其中引用的文献)。
反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA，该重组RNA包含猪流感病毒RNA的非编码区，该非编码区对病毒聚合酶的识别和产生成熟病毒体所需的包装信号是必需的。从重组DNA模板合成重组RNA并与纯化的病毒聚合酶复合体在体外重建来形成重组核蛋白(RNP)，该核蛋白可用于转染细胞。如果在转录体外或者体内合成的RNA时存在病毒聚合酶蛋白，会实现更有效的转染。合成的重组RNP可被恢复至感染性病毒颗粒中。上述技术公开在1992年11月24日批准的美国专利第5,166,057号；1998年12月29日批准的美国专利第5,854,037号；1996年2月20日公开的欧洲专利公开EP 0702085A1；美国专利申请系列号09/152,845；1997年4月3日公开的PCT国际专利公开WO97/12032；1996年11月7日公开的WO96/34625；欧洲专利公开EP-A780475；1999年1月21日公开的WO 99/02657；1998年11月26日公开的WO 98/53078；1998年1月22日公开的WO 98/02530；1999年4月1日公开的WO 99/15672；1998年4月2日公开的WO 98/13501；1997年2月20日公开的WO 97/06270；以及1997年6月25日公开的EPO 780 475A1中，本发明将上述每一篇全部引入作为参考。
也可采用无辅助质粒技术来工程化减毒猪流感病毒。对于无辅助质粒技术的描述参见，例如国际专利公开WO 01/04333；美国专利第6,649,372号；Fodor等，1999，J.Virol.739679-9682；Hoffmann等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA976108-6113；及Neumann等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969345-9350，本发明将这些文献全部引入作为参考。
反向遗传学方法或无辅助质粒技术产生的减毒病毒可用于本发明所述的疫苗、免疫原性制剂和药物制剂。反向遗传学技术或无辅助质粒技术也可用于将其它突变工程化到对疫苗制剂、免疫原性制剂和药物制剂重要的其它病毒基因中，即，有用的疫苗株变体的抗原决定簇可被工程化到减毒猪流感病毒中。可选择地，完全外源的抗原决定簇，包括来自其它病毒或非病毒病原体的抗原可被工程化到减毒株中。例如，非相关病毒的抗原、寄生虫抗原、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原可被工程化到减毒株中，例如猪增殖和呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇；以及非病毒病原体的抗原显性基因，例如细菌包括但不限于布鲁氏菌(Brucella suis)和寄生虫包括但不限于蛔虫(Ascaris suum)、鞭虫(Trichuris suis)的抗原决定簇；或肿瘤抗原例如癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原决定簇、癌抗原-50(CA-50)、与乳腺癌相关的癌抗原15-3(CA15-3)、癌症相关抗原(CAA)、黑素瘤抗原以及黑素瘤相关抗原100、25和150)。可供选择地，体内改变病毒趋向性(tropism)的抗原决定簇可被工程化到本发明的嵌合减毒病毒中。
在具体实施方案中，可以联合使用反向遗传学技术或无辅助质粒技术和重组技术对具有猪流感病毒所需抗原决定簇的减毒病毒进行工程化。例如，减毒猪流感病毒(通过例如反向遗传学技术、无辅助质粒技术或其组合生成的)和携带所需疫苗抗原决定簇的株(通过例如自然选择、诱导突变、通过反向遗传学技术、无辅助质粒技术或其组合生成的)可被共转染至允许分段基因组重组的宿主。可以随后选择既表现减毒表型又表现所需抗原决定簇的重组体。在具体实施方案中，可使用重组技术从亲代猪流感病毒株(天然突变株、诱导突变的病毒或遗传工程化病毒)中将减毒表型转移至不同病毒株(野生型病毒、天然突变株、诱导突变的病毒或遗传工程化病毒)。
在具体实施方案中，本发明提供包含猪流感病毒NS1基因含有突变的基因组的减毒猪流感病毒，该突变降低NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力。根据此实施方案，该减毒猪流感病毒优选被遗传工程化。
本发明的减毒猪流感病毒可具有以下特征中的一种或多种或以下特征的任意组合通过标准的干扰素分析测定，诱导干扰素活性的能力水平比野生型猪流感病毒(例如A/Swine/Texas/4199-2/98)低例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％；当在相同的条件下生长时(例如，以MOI为0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10接种，在PK细胞、PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13细胞或SJPL细胞中生长，并在MDCK细胞中分析)，病毒滴度比野生型猪流感病毒(例如A/Swine/Texas/4199-2/98)低1至50、2至25、2至10或者3至7倍；当从感染的猪BALF中分离、用MDCK细胞进行空斑试验时，病毒滴度比野生型猪流感病毒(例如，A/Swine/Texas/4199-2/98)低1至10倍、1至5倍、5-10倍、10至500倍、20至250、20至100或40至80倍；或者引起感染的猪肺损伤的能力降低。
在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含含有猪流感NS1基因的突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、ILC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、或约1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过对猪BALF或猪细胞上清液进行血细胞凝集试验测定，或者病毒在MDCK细胞产生蚀斑测定。在一个实施方案中，将本发明减毒猪流感病毒的生长与具体标准或参照比较，例如与野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比较。根据这些实施方案，减毒病毒可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如外源病原体或肿瘤抗原的抗原决定簇。优选地，该非猪流感病毒序列不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，不将编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列工程化到猪流感病毒中。
本发明提供了包含在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3至少4种或更多突变的基因组的减毒猪流感病毒，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因，并有助于或导致(直接或间接)病毒减毒和/或病毒拮抗细胞干扰素反应的能力减弱。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3、至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因中，并导致NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力减弱，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0时，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98)低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天、或者2、3、5、6、7、8、9、10天，在相同增殖条件下，通过血细胞凝集试验测定。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在2个、3个、4个或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、3、4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS1基因并导致该病毒的减毒，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98)低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，在相同增殖条件下(例如在MDCK细胞中)，通过血细胞凝集试验测定。根据这些实施方案，该减毒病毒具有受损的干扰素拮抗表型并且该病毒可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如外源病原体的抗原决定簇(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇，以及非病毒猪病原体的抗原决定簇，例如细菌和寄生虫)，或肿瘤抗原。优选地，所述非猪流感病毒序列(异源序列)不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽和肽的核酸序列优选不被工程化到猪流感病毒中。
任何导致所需表型的突变(优选地，拮抗细胞干扰素反应的能力受损)都可以被引入猪流感病毒NS1基因中。可包括在或引入猪流感病毒NS1基因的突变类型的实例包括但不限于缺失、替代、插入以及上述的组合。一种或多种突变可位于整个NS1基因的任意处(例如，氨基末端、羧基末端或之间的某些地方)和/或NS1基因的调控因子。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在氨基末端含有突变(例如，缺失或取代)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在羧基末端含有突变(例如，缺失或取代，优选缺失)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在猪流感病毒NS1基因中含有突变的基因组，该突变导致自NS1羧基末端缺失5、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、119、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基，或者自NS1羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、100-160或105-160氨基酸残基。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在猪流感病毒NS1基因中含突变的基因组，该突变导致除了氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60外(其中氨基末端氨基酸为序号1)，其它所有氨基酸残基都缺失。根据这些实施方案，减毒猪流感病毒优选是遗传工程化的。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒为TX/98/del 126、TX/98/del 99或TX/98/del 73。在更优选的实施方案中，该减毒的猪流感病毒是TX/98/del 126。在更加优选的实施方案中，该减毒的猪流感病毒是TX/98/del 99。
本发明的减毒猪流感病毒可以是表达异源序列例如其它疫苗株的抗原的嵌合病毒(例如，利用反向遗传学、重组或无辅助质粒技术)。可选择地，可以利用反向遗传学、重组或无辅助物质粒技术对该减毒流感病毒进行遗传工程化，来表达全外源的抗原决定簇，例如其它感染性病原体的抗原、肿瘤抗原或靶向抗原。在某些实施方案中，该减毒猪流感病毒表达来自其它猪感性因子、非猪感染性因子、猪或其它类型的肿瘤抗原(例如，癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原决定簇、癌抗原-50(CA-50)、癌抗原15-3(CA15-3)、乳腺癌相关抗原、癌症相关抗原(CAA)、黑素瘤抗原，以及黑素瘤相关抗原100、25和150)。在其它实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒可包含来自另一种病毒的片段。因为NS RNA片段在所述8种病毒RNA中是最短的，与其它病毒基因相比，NS RNA可能会包容更长异源序列的插入。再者，所述NS RNA片段指导被感染细胞中高水平蛋白的表达，表明其可以是外源抗原插入的理想片段。示例性序列包括猪增殖和呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇以及非病毒猪病原体(例如细菌包括但不限于布鲁氏菌，以及寄生虫包括但不限于蛔虫(Ascaris suum)、鞭虫(Trichuris suis))的抗原决定基。
优选地，该异源序列不是改变所述病毒减毒表型的核酸序列。因此，优选地，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽、肽的核酸序列不被工程化到该猪流感病毒中。在某些实施方案中，该嵌合病毒表达肿瘤抗原。在其它实施方案中，该嵌合病毒表达外源病原体的抗原决定簇。
5.2减毒猪流感病毒的选择本发明包括选择具有所需表型的猪流感病毒的方法，该病毒即减毒猪流感病毒或具有低IFN活性的(即，在相同的条件下与野生型猪流感病毒例如A/Swine/Texas/4199-2/98相比，降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)或没有IFN拮抗活性的猪流感病毒，无论该猪流感病毒是否获自天然变体、自发变体(即，在病毒增殖中进化的变体)、诱导突变的天然变体、重组体和/或遗传工程化的病毒(参见例如，美国专利第6,635,416号)。在差异生长试验中可以最好地筛选这种病毒，该试验比较病毒在IFN缺失和有IFN活性的宿主系统中的生长。选择在IFN缺失宿主系统中比有IFN活性的宿主系统中生长更好的病毒；优选地，选择与有IFN活性系统相比，在IFN缺陷系统中生长滴度高出至少1个对数、至少2个对数、至少3个对数、或1至50、1至25、1至20、1至10或1至5对数的病毒。IFN缺陷系统的实例包括但不限于，初期含胚卵(例如，6至10天、6至9天、6至8天或6至7天龄含胚卵)、IFN缺失细胞株(例如VERO细胞或遗传工程化的细胞株例如STAT1敲除、PKR敲除等)。用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸、核酶等)预处理的含胚蛋或细胞株，也可用作IFN缺失的系统。此外，IFN系统缺陷的蛋，例如STAT1阴性的鸟特别是家禽(包括但不限于转基因鸡、鸭或火鸡)产的蛋可用作IFN缺陷系统。与6-7、6-8或6-9天龄的蛋相比，对在10天龄蛋中显示至少1至50、1至25、1至20、1至10或1至5指数滴度降低的减毒猪流感病毒可以认为其抑制IFN反应的能力减弱。
为了筛选的目的，可以用IFN短暂缺失的系统代替遗传操作系统。例如，可用抑制IFN生成和/或IFN反应组分的化合物(例如，药物、抗IFN抗体、抗IFN受体抗体、PKR抑制剂、反义分子和核酶等)来处理宿主系统。可在有IFN活性的未处理的对照与IFN缺失处理的系统中比较减毒猪流感病毒的生长。
可以在例如表达IFN和IFN反应组分的多种细胞、细胞株或动物模型系统与IFN或IFN反应组分缺陷的细胞、细胞株或动物模型系统中比较猪流感病毒的生长(通过滴度测定)。可利用本领域公知的用于在细胞株中增殖病毒的技术(参见例如，下述工作实施例)。可以在有IFN活性的细胞株与IFN缺失的遗传工程化细胞株中比较猪流感病毒的生长。
可以利用IFN试验体系(例如，其中由IFN反应性启动子控制报告基因表达的基于转录的分析系统)筛选猪流感病毒。可检测感染细胞和未感染细胞中报告基因的表达来识别有效诱导IFN反应但不拮抗IFN反应的病毒。例如，在干扰素刺激性反应元件(例如，ISG-54K基因的IFN刺激性启动子)的控制下，可工程化测试细胞以瞬时或组成性地表达报告基因例如荧光素酶报告基因或氯霉素转移酶(CAT)报告基因(Bluyssen等，1994，Eur.J.Biochem.220395-402)。用待检测的猪流感病毒感染细胞，并将报告基因的表达水平与未感染细胞或用野生型猪流感病毒感染的细胞比较。报告基因表达水平在待检测猪流感病毒感染后增加说明该猪流感病毒诱导IFN反应。可选择地，可以在待检测的减毒猪流感病毒感染后通过检测IFN依赖性转录的活化来确定对IFN反应的诱导。可以通过本领域公知的技术(例如，Northern印迹、Western印迹、PCR等)分析已知由IFN诱导的基因的表达(例如Mx、PKR、2-5-寡腺苷酸化合成酶、I类主要组织相容性复合体(MHC)等)。IFN反应的诱导也可通过检测用待检测猪流感病毒感染后IFN途径组分的磷酸化状态来确定(例如，IRF-3，其响应双链RNA而被磷酸化)。在对I型IFN响应中，Jak1激酶和TyK2激酶、IFN受体的亚单位、STAT1和STAT2被快速酪氨酸磷酸化。因此，为确定该猪流感病毒是否诱导IFN反应，用待检测的突变病毒感染细胞例如293细胞的细胞，感染后裂解该细胞。从该细胞裂解物的中利用特异性多克隆血清或抗体来免疫沉淀IFN途径组分，例如Jak1激酶或TyK2激酶，而且激酶的酪氨酸磷酸化状态可通过抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹分析来确定(例如，参见Krishnan等.1997，Eur.J.Biochem.247298-305)。猪流感病毒感染后，任何IFN途径组分磷酸化状态的增强都表明该猪流感病毒诱导IFN反应。
此外，待检测猪流感病毒感染后对IFN反应的诱导可通过检测结合特定DNA序列的能力来确定，或检测病毒感染所诱导的转录因子移位，例如，IRF3、STAT1、STAT2等。特别是，响应I型IFN、STAT1和STAT2被磷酸化并从细胞浆中移至细胞核。通过本领域公知的技术例如凝胶电泳迁移率实验、细胞染色等可检测结合特定DNA序列的能力或转录因子的移位。其它可以使用的试验参见美国专利申请第09/829,711号，本发明将其全部引入作为参考。然而，在优选的实施方案中，采用差异生长试验来选择具有所需表型的病毒，因所用的宿主系统(有IFN活性比较IFN缺失)施加了适当的选择压力。
本发明的减毒猪流感病毒任选地在猪细胞(包括原始、次级猪细胞和猪细胞株)中筛选。可采用任何猪流感病毒能够生长的猪细胞。优选的猪细胞包括猪肾脏细胞株、猪睾丸细胞株和猪肺。代表性猪细胞包括但不限于PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13细胞或SJPL细胞。
在相同生长条件下，通过与例如A/Swine/Texas/4199-2/98的野生型猪流感病毒比较，可在猪细胞中筛选本发明的猪流感病毒。与野生型猪流感病毒比较，根据以下特点来挑选减毒猪流感病毒例如较低的生长率、猪感染后较少的肺损伤、支气管肺泡灌洗液(BALF)中降低的病毒滴度、以及鼻擦拭签减少的检出。这种减毒猪流感病毒具有降低的毒力，因为与野生型猪流感病毒相比它们在有干扰素活性的系统中复制能力降低，但可产生免疫反应。
可用野生型猪流感病毒例如A/Swine/Texas/4199-2/98和NS1突变株以特定MOI来感染猪细胞，并且在感染后的特定时间测定上清液中的病毒滴度。可以用0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1或1和10的MOI，或者0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10的MOI感染猪细胞。在一个实施方案中，采用0.001的MOI。感染后约2至10天、3至7天、3至5天或2、3、4、5、6、7、8、9或10天可测定病毒的滴度。在具体实施方案中，可在感染后5天测定病毒滴度。在猪细胞中培养病毒后，可测定上清液中的病毒滴度。可采用任何检测流感病毒滴度的系统。代表性系统如5.7节所述。在具体实施方案中，上清液中的病毒滴度可通过在不同时间点MDCK细胞中的空斑来确定。
本发明的选择系统包括通过确定待测试减毒猪流感病毒感染细胞或蛋的提取物是否能够提供对抗病毒感染的保护活性来检测IFN诱导。更具体地，用待检测的突变猪流感病毒或野生型猪流感病毒感染10天龄含胚鸡蛋组。感染后大约15至20小时，收集尿囊液，并通过测定在组织培养细胞中针对猪流感病毒感染的保护活性的最高稀释来检测IFN活性。
也可以在猪体内评价本发明突变猪流感病毒的致病性。可以使用的试验包括利用本领域公知的方法评估肺叶的肺损伤、鼻擦拭签和测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度。
5.3减毒猪流感病毒的增殖本发明提供了在细胞(例如，猪细胞)、含胚蛋和动物中增殖减毒猪流感病毒的方法。本发明的减毒猪流感病毒可以用允许该病毒生长至一定滴度从而可以根据本发明使用的任何培养基来增殖。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒可在任何下述培养基中增殖该培养基允许该病毒生长至与野生型猪流感病毒株在有IFN活性培养基中测定的滴度相匹配的滴度。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒在IFN缺失的培养基中增殖。用于选择本发明减毒猪流感病毒的培养基不一定用于增殖，反之亦然。
根据本发明的方法，可在细胞(例如，猪细胞)、含胚蛋和动物中生长的减毒猪流感病毒可选自天然存在的株、变体或突变株、诱导突变的病毒、重组体和/或遗传工程化的病毒。本发明的方法包括培养该减毒猪流感病毒，优选利用适合的生长条件(参见例如，下述第6节描述的生长条件)，收集子代病毒。
在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒在猪细胞中增殖。根据此实施方案，猪细胞可以是或可以不是IFN缺失或产生较低水平的IFN。优选的猪细胞包括猪肾脏细胞株、猪睾丸细胞株和肺细胞株。代表性的猪细胞包括但不限于PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、SJPL细胞、NSK细胞、LLC-PKl细胞、LLC-PKlA细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞和PK-2a/CL 13细胞。在另一具体实施方案中，该减毒猪流感病毒在鸡细胞例如来自6天龄含胚蛋的鸡胚纤维母细胞中增殖。
在某些实施方案中，本发明提供在含胚蛋(例如6至14天龄)中增殖本发明减毒猪流感病毒的方法。在其它实施方案中，初期或未成熟的含胚蛋可用来增殖本发明的减毒猪流感病毒。根据本发明，未成熟的含胚蛋包括小于10天龄的蛋，优选6至9天龄的蛋、6至8天龄、6至7天龄或6天龄的蛋。本发明未成熟的含胚蛋还包括人工模拟未成熟的最多或少于10天龄的蛋，这是由生长条件改变导致的，例如改变孵育温度；用药物处理；或导致蛋发育阻滞的任何其它改变，从而与10至12天龄的蛋比较IFN系统没有充分发育。猪流感病毒可在含胚蛋的不同区域增殖，例如，尿囊腔。在某些实施方案中，含胚蛋为鸡蛋。
本发明还包括培养和分离本发明减毒猪流感病毒的方法和IFN缺失培养基。参见例如，美国专利第6,573,079号，其被全部引入作为参考。可用于支持减毒猪流感病毒生长的IFN缺失培养基包括但不限于天然存在的细胞、细胞株、含胚蛋、和IFN缺陷系统例如Vero细胞、初期含胚蛋；工程化为IFN缺失的重组细胞或细胞株，例如来自STAT1敲除、IRF3敲除、IRF7敲除、PKR敲除等的IFN缺失细胞株；来自IFN缺失的鸟特别是家禽(例如鸡、鸭和火鸡)的含胚蛋，这样的家禽包括喂养成为IFN缺失的鸟或转基因鸟(例如，STAT1敲除)。在某些实施方案中，IFN缺失培养基不是Vero细胞和/或不是STAT1缺失细胞株。
宿主系统、细胞、细胞株、蛋或动物可被遗传工程化来表达编码IFN系统抑制剂的转基因，例如，显性-阴性的突变株例如STAT1缺失DNA结合区、反义RNA、核酶、IFN产成抑制剂、IFN信号产生抑制剂和/或由IFN诱导的抗病毒基因的抑制剂。应认识到，喂养或遗传工程化的IFN缺失的动物会有些免疫损伤，应置于受控制的无疾病环境中。因此，应使用适合的手段(包括使用膳食抗生素)限制转基因IFN缺失的动物暴露于感染因子的风险，例如小鼠、喂养的母鸡、鸭、火鸡等禽群。可供选择地，宿主系统例如细胞、细胞株、蛋或动物可用抑制IFN产生和/或IFN途径的化合物来处理，例如，靶向STAT1基因和/或由IFN诱导的抗病毒基因的药物、抗体、反义分子、核酶分子。
本发明包括在IFN拮抗活性改变的细胞和细胞株(天然不具有IFN途径、或具有缺陷的IFN途径、或IFN系统系统有缺陷，例如与野生型细胞比较，IFN表达水平低)中培养和分离猪流感病毒的方法。在具体的实施方案中，本发明包括在来自6天龄含胚蛋的鸡胚纤维母细胞、或Vero细胞、或IFN受损的含胚蛋(例如，6、7或8天龄的含胚蛋的未成熟含胚疋)中培养本发明减毒猪流感病毒的方法。在另一实施方案中，本发明包括在非Vero细胞中培养本发明的减毒猪流感病毒。
本发明提供在遗传工程化的IFN缺失培养基中培养和分离本发明猪流感病毒的方法。本发明包括IFN系统所必需的基因(例如STAT1)突变的转基因猪和鸟类，其可下出IFN缺失的蛋。本发明还包括表达显性基因阴性的转录因子(dominant-negative transcription factors)(例如STAT1缺乏DNA结合区、核酶、反义RNA、IFN生成抑制剂、IFN信号发生抑制剂和IFN诱导的抗病毒基因的抑制剂)的转基因鸟类。
本发明提供重组细胞株和动物特别是猪和鸟类，其中对于IFN合成、IFN途径所必需的一种和多种基因和/或由IFN诱导的抗病毒基因，例如，干扰素受体、STAT1、PKR、IRF3、IRF7等已经被突变(例如，阻断，即“敲除”)。重组动物可以是任何动物(例如小鼠、猪或鸟，例如，鸡、火鸡、母鸡、鸭子等(参见例如，关于转基因鸟类制备的综述Sang，1994，Trends Biotechnol.12415；Perry等，1993，Transgenic Res.2125；Stern，CD.，1996，Curr Top Microbiol Immunol212195-206；和Shuman，1991，Experientia 47897，本发明将每一篇文献全部引入作为参考))。在具体实施方案中，重组动物为猪。这种细胞株和动物可由本领域公知的用于阻断细胞或动物染色体基因的任何方法来制备。这样的技术包括但不限于原核显微注射(Hoppe & Wagner，1989，U.S.专利号4,873,191)；逆转录病毒介导的生殖种系基因转移(Van der Putten等，1985，Proc.Natl.Acad.ScL，USA826148-6152)；胚胎干细胞基因打靶(Thompson等，1989，Cell 56313)；胚胎电穿孔(Lo，1983，Mol Cell.Biol.31803)；和精子介导的基因转移(Lavitrano等，1989，Cell57717)；等。这类技术的综述参见Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.115171，本发明将其全部引入作为参考。
特别是，STAT1敲除动物可通过促进染色体中的STAT1基因和已被生物失活的外源性STAT1基因(优选通过插入异源序列，例如，抗生物素抗性基因)之间的同源重组来制备。在小鼠基因组中用来阻断基因的同源重组方法例如Capecchi(1989，Science 2441288)和Mansour等(1988，Nature 336348-352)所述。
简言之，从作为基因敲除细胞或动物的同一物种的基因组DNA中分离全部或部分STAT1基因组克隆。可以利用本领域公知的任何用于分离基因组克隆的方法来分离STAT1基因组克隆(例如，用来自STAT1序列例如猪的STAT1(Genbank编号AB116564和NM_213769)和Meraz等1996，Cell 84431-442；Durbin等1996，Cell 84443-450所提供序列的探针来探测基因组文库，本发明将其引入作为参考)。一旦分离基因组克隆后，将该克隆的全部或部分引入重组载体中。优选地，被引入部分克隆的载体含有部分STAT1基因外显子，即含有STAT1蛋白编码序列。不与STAT1序列同源的序列，优选正选择性标记例如编码抗生素抗性基因，被随后引入STAT1基因外显子。选择性标志物优选可操作地连接至启动子，更优选组成型启动子。非同源性序列被引入STAT1编码序列的任何将会阻断STAT1活性的位置，例如，已经证明该位置的点突变或其它突变使STAT1蛋白功能失活的位置。例如但不限于，非同源性序列可插入至含全部或部分激酶结构域的STAT1蛋白部分的编码序列(例如，编码该激酶结构域的至少50、100、150、200或250氨基酸的核苷酸序列)。
正选择性标记优选为新霉素抗性基因(neo基因)或潮霉素抗性基因(hygro基因)。启动子可以是本领域公知的任何启动子；例如启动子可以是磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Adr等，1987，Gene 6065-74)，Pol II启动子(Soriano等，1991，Cell64693-701)，或MC1启动子，其为设计用于在胚胎衍生干细胞中表达的合成启动子(Thomas&Capecchi，1987，Cell 51503-512)。使用选择性标记例如抗生素抗性基因使得能够选择已经整合了打靶载体的细胞(例如，neo基因产物的表达赋予对G418的抗性，而hygro基因产物的表达赋予对潮霉素的抗性)。
在优选的实施方案中，用于与载体同源(与非同源相反)重组的负选择性标记被插入STAT1基因组克隆插入的外面。例如，这种负选择性标记为HSV胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)，该基因的表达使细胞对ganciclovir(更昔洛韦)敏感。负选择性标记优选在启动子(例如但不限于PGK启动子、Pol II启动子或MCl启动子)的控制下。
当同源重组发生时，与STAT1基因同源的载体部分以及STAT1基因序列中的非同源插入被整合入染色体的STAT1基因中，并丢失该载体的剩余部分。因此，由于负选择性标记在STAT1基因同源区域的外部，发生同源重组的细胞(或其后代)将不含有该负选择性标记。例如，如果负选择性标记为HSV-tk基因，那么已发生同源重组的细胞不会表达胸腺嘧啶激酶并在ganciclovir暴露后存活。与非同源重组(很可能该负选择性标记也与STAT1序列和正选择性标记一起被整合入基因组)相比，此过程使得能够选择已经发生同源重组的细胞。因此，已经发生非同源重组的细胞很可能表达胸腺嘧啶激酶并对ganciclovir敏感。
制备打靶载体后，用在该打靶载体中有唯一位点的限制性内切酶将其线形化，通过本领域公知的任何方法例如电穿孔将该线形化载体引入胚胎干(ES)细胞(Gossler等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839065-9069)。如果该打靶载体包括正选择性标记和负选择性标记，在选择性培养基中培养来筛选已经发生同源重组的ES细胞。例如，如果选择性标记为neo抗性基因和HSV-tk基因，将细胞暴露于G418(例如，大约300μg/ml)和ganciclovir(例如，大约2μM)。
用于检测基因型的本领域公知的任何技术(例如但不限于Southern印迹分析或聚合酶链式反应)可用于证明阻断的STAT1序列已被同源重组到ES细胞基因组的STAT1基因中。因为STAT1基因组克隆的限制性图谱是公知的，而且STAT1编码序列也是公知的(参见Meraz等1996，Cell 84431，Durbin等.1996，Cell84443-450，本发明将其引入作为参考)，可以确定阻断的和非阻断的等位基因DNA的具体限制性内切片段或PCR扩增产物的大小。因此，通过分析限制性内切片段或PCR产物(它们的大小在阻断的和阻断的STAT1基因中不同)，可确定是否发阻断STAT1基因的同源重组。
具有阻断的STAT1位点的ES细胞可随后通过显微注射被导入胚泡中，然后利用常规技术将该胚泡植入小鼠子宫中。由植入的胚泡发育而来的动物嵌合了阻断的等位基因。嵌合的雄性可与雌性杂交，而且这种杂交可设计成等位基因的生殖系传递与某种皮毛的颜色传递相联系。可通过如上所述的Southern印迹或PCR分析来证实从组织样品中分离的基因组DNA的等位基因生殖系传递。
可使用其产物对干扰素调节重要的任何基因。根据本发明可以使用的其它干扰素途径突变包括Jak1、TyK2激酶缺陷形式或缺乏DNA结合区域的转录因子STAT1和STAT2(参见例如，Krishnan等，1997，Eur.J.Biochem.247298-305)。
为了纯化病毒，通过公知的净化方法例如梯度离心和柱层析，从细胞培养物中去处并从细胞组分中分离减毒猪流感病毒，并可利用本领域所属技术人员公知的方法进行进一步分离，例如空斑试验。
5.4减毒病毒的用途本发明所述减毒猪流感病毒可用作病毒载体制备异源蛋白产物，如美国专利第5,820,871号所述的，本发明将其全部引入作为参考。
本发明的减毒猪流感病毒可以在筛选试验中用于鉴定具有干扰素拮抗功能的病毒蛋白，以鉴定能够对拮抗细胞干扰素反应的能力受损的减毒病毒的复制进行补充的病毒蛋白，本发明的减毒猪流感病毒还可以在筛选试验中用于鉴定抑制干扰素拮抗活性和抑制病毒复制的抗病毒试剂，如美国专利第6,635,416号所述，其本发明将其全部引入作为参考。
本发明的减毒猪流感病毒可用于制备用于诊断性免疫试验、被动免疫治疗和抗独特型的抗体。例如，可将包含含有NS1基因突变和异源序列(例如，肿瘤抗原)的基因组的减毒猪流感病毒施用于个体(例如，猪)以产生抗体，随后分离该抗体用于诊断性免疫试验、被动免疫治疗和抗独特型抗体的制备。所制备的抗体可以通过本领域公知的标准技术来分离(例如，免疫亲和层析、离心、沉淀等)，并用于诊断性免疫试验、被动免疫治疗和抗独特型抗体的制备。被分离的抗体在用于被动免疫之前可对其进行修饰，例如，可以嵌合或人源化该抗体。对于嵌合和人源化抗体的综述参见例如，美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；以及国际
发明者彼得·帕雷斯, 阿道夫·加西亚-塞斯特, 理查德·J·威比, 乔根·A·里希特, 罗伯特·韦伯斯特, 凯利·M·莱格 申请人:纽约大学西奈山医学院, 圣祖德儿童研究医院, 美国政府(美国农业部代表)