专利名称：纯化病毒包膜的方法
技术领域：
本发明涉及病毒(例如日本血凝病毒，下文中称为HVJ)包膜的工业纯化方法。纯化的病毒包膜可用作导入生物聚合物如基因等到细胞和活生物内的载体。
背景技术：
为了引入基因到培养的细胞和活组织内用于进行基因功能分析和基因治疗，已开发了多种病毒方法和非病毒方法(MUlligan，Science，260，926-932，1993，和Ledley，Human Gene Therapy，vol.6，1129-1144，1995)。为了导入基因到细胞内，病毒方法通常是有效的。但是，使用病毒载体的方法存在安全性问题，因为存在亲代病毒派生的基因导入及其表达的可能性、免疫原性和宿主基因组结构修饰的可能性。另一方面，使用脂质体等的大多数非病毒方法表现出比病毒方法低的细胞毒性和低的免疫原性。但是，基因导入到培养的细胞和活组织内的效率往往低于用病毒载体。
HVJ为属于副粘病毒属(Paramyxoviridae)的病毒，其具有包膜以及在包膜表面上的血凝素和神经氨酸苷酶。HVJ引起了对融合Ehrlich肿瘤细胞的关注(Okada，Biken Journal，1，103-110，1958)，已进行了细胞膜融合活性(下文中称为融合活性)的分析，并研究了它作为转基因载体的用途。HVJ具有高的免疫原性，并已知能诱导CTL，尤其当大量产生NP蛋白时(Cole G.A.等，Journal of ImmUnology158，4301-4309，1997)。此外，担心宿主抑制蛋白质合成。因此，设计了一种通过用预先经紫外辐射灭活的HVJ融合包括基因或蛋白质的脂质体制备融合颗粒(HVJ-脂质体)的方法，通过这种方法，使到细胞或活生物内的非侵入性基因导入成为可能(美国专利5631237，Dzau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93,11421-11425,1996，和Kaneda等，Molecular Medicine Today，5,298-303,1999)。但是，这种方法是复杂的，因为需要制备病毒和脂质体两种不同的小泡。另外，已阐明HVJ-脂质体的平均直径为HVJ颗粒的平均直径的1.3倍，并表现出降低到不超过单独HVJ十分之一的融合活性。
Kaneda开发了能高效率导入基因到细胞内并表现出高安全性的HVJ载体(WO01/57204)。具体地说，包括HVJ的有包膜病毒的基因组被灭活，生物聚合物如基因等被包括在其包膜内，并使用病毒作为被导入到细胞或活生物内的载体。但是，在这个阶段，还没有确立HVJ包膜的有效纯化方法。
此外，Kaneda开发了一种方法，包括在鸡蛋中产生HVJ，和通过过滤、膜浓缩、超滤、离子交换色谱分离和超滤步骤纯化HVJ(WO03/014338)。但是，由于这种方法在柱之前包括过滤和膜浓缩两个处理步骤，因此物理刺激降低了HVJ的活性，并且因这个阶段的捕获造成的回收率降低是不可避免的。
作为病毒纯化方法，WO96/27677中已开发了使用离子交换树脂和固定化金属亲和树脂的腺病毒纯化方法。但是，由于腺病毒没有包膜，因此这种方法作为有包膜病毒纯化方法不适用。尽管提出了联合使用离子交换树脂和疏水树脂的方法作为腺病毒的纯化方法，但没有公开具体的例子。
尽管WO91/00104公开了通过亲和色谱法纯化有包膜病毒的HN蛋白和F蛋白的方法，但该方法不适用于纯化病毒包膜的方法，病毒包膜为多种蛋白质的集合体。
因此，需要开发能解决上述问题并表现出较高回收率同时保持HVJ活性的有效产生病毒包膜的纯化方法。
发明公开本发明的挑战在于开发一种以较高回收率纯化病毒包膜同时保持病毒融合活性的方法。
包括HVJ的包膜病毒为由几种蛋白质、脂质和糖链组成的结合蛋白质，并通常是粒度为几百纳米的大颗粒。因此，预计它们具有复杂的表面电荷和非常高的疏水性。因此，据说具有高分离能力的最近的色谱法载体由于具有较小的孔尺寸(载体表面上许多孔中一个的孔径)和每个载体小的表面积并被设计来分离相对小的分子，因此不能充分利用HVJ和载体表面之间的各种相互作用。换句话说，为了分离大的强疏水分子如HVJ，需要能允许HVJ在载体内部分布的宽松孔尺寸或足够表面积、允许HVJ结合的官能团之间的足够距离和与足够的结合常数和适宜的离解常数的相互作用。
培养物上清液含各种除HVJ之外的杂质。但是，它们中的大多数为比HVJ小的分子或粒子。由于目前大多数色谱法载体具有对小尺寸分子侧的选择性，因此它们不能适当地从培养物上清液中分离HVJ。因此，需要考虑适用于HVJ的纯化方法。本发明人在尝试解决上述问题中进行了广泛研究。结果，建立了包括疏水色谱法、优选疏水色谱法和阴离子交换色谱法和/或凝胶过滤色谱法联合的纯化方法。
也就是说，作为解决问题的手段，本发明提供一种具有高回收率并同时保持病毒包膜的细胞融合活性的有效纯化病毒包膜的方法。本发明的主题涉及(1)一种纯化病毒包膜的方法，包括使用疏水色谱法，(2)(1)的方法，其中上述疏水色谱法的官能团为弱疏水基，(3)(1)或(2)的方法，其中上述疏水色谱法的官能团为低聚乙二醇基或苯基，(4)(1)-(3)的方法，其中上述疏水色谱法的官能团为低聚乙二醇基，(5)(1)-(4)的方法，其中上述疏水色谱法与离子交换树脂色谱法和/或凝胶过滤色谱法联合，(6)(5)的方法，其中离子交换色谱法和疏水色谱法联合，(7)(5)或(6)的方法，其中离子交换树脂用于第一次色谱法，疏水树脂用于第二次色谱法，(8)(5)-(7)的方法，其中离子交换色谱法为阴离子交换色谱法，(9)(5)-(8)的方法，其中离子交换色谱法为弱阴离子交换色谱法，(10)(5)-(9)的方法，其中离子交换色谱法的官能团为二乙基氨基丙基(DEAP)，(11)(5)-(10)的方法，其中离子交换色谱法的官能团被低密度取代(Low Sub)，(12)(1)-(11)的方法，其中色谱法的缓冲液具有7-9的pH，
(13)(1)-(12)的方法，其中色谱法的缓冲液具有7.8-8.5的pH，(14)(5)-(13)的方法，其中离子交换色谱法的缓冲液含氯化钠或氯化钾，(15)(5)-(14)的方法，其中离子交换色谱法中的样品吸收用缓冲液含0.01-150mM的氯化钠，(16)(5)-(15)的方法，其中离子交换色谱法中的样品吸收用缓冲液含30-70mM的氯化钠，(17)(5)-(16)的方法，其中离子交换色谱法中的冲洗用缓冲液含150mM-250mM的氯化钠，(18)(5)-(17)的方法，其中离子交换色谱法中的冲洗用缓冲液含190-230mM的氯化钠，(19)(5)-(18)的方法，其中离子交换色谱法中的洗脱用缓冲液含100mM-1000mM的氯化钠，(20)(5)-(19)的方法，其中离子交换色谱法中的洗脱用缓冲液含290-330mM的氯化钠，(21)(1)-(20)的方法，其中疏水色谱法的缓冲液含硫酸铵、硫酸钠或氯化钠，(22)(1)-(21)的方法，其中疏水色谱法中的吸收用缓冲液含1.0M-2.5M的硫酸铵，(23)(1)-(22)的方法，其中疏水色谱法中的吸收用缓冲液含1.8-2.2M的硫酸铵，(24)(1)-(23)的方法，其中疏水色谱法中的冲洗用缓冲液含1.0-1.6M的硫酸铵，(25)(1)-(24)的方法，其中疏水色谱法中的冲洗用缓冲液含1.2-1.5M的硫酸铵，(26)(1)-(25)的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.01-1.5M的硫酸铵，(27)(1)-(26)的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.6-1.0M的硫酸铵，(28)(1)-(27)的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含亲水性有机溶剂，
(29)(28)的方法，其中亲水性有机溶剂为多元醇或低级醇，(30)(28)或(29)的方法，其中多元醇为乙二醇，(31)(28)-(30)的方法，其中乙二醇的浓度为0.01-50％，(32)(28)-(31)的方法，其中乙二醇的浓度为2-10％，(33)(28)-(32)的方法，其中乙二醇的浓度为3-7％，(34)(1)-(33)的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含表面活性剂，(35)(1)-(34)的方法，其中上述表面活性剂为Tween 80或Triton X，(36)(1)-(35)的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.001-1％的Tween 80，(37)(1)-(36)的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.01-0.1％的Tween 80，(38)(1)-(37)的方法，其中在疏水色谱法中，通过从吸收过程中的温度降低温度不小于5℃来引起样品吸收后的洗脱，(39)(38)的方法，其中洗脱过程中的温度在(室温-5)℃-4℃的范围内，(40)(1)-(39)的方法，其中在疏水色谱法中，通过升高吸收用缓冲液的pH不小于0.5来引起样品吸收后的洗脱，(41)(40)的方法，其中洗脱过程中的pH在6-10的范围内，(42)(1)-(41)的方法，其中在疏水色谱法后进行凝胶过滤色谱法，(43)(1)-(42)的方法，其中凝胶过滤色谱法的载体为琼脂糖，(44)(1)-(43)的方法，其包括加入二价金属离子到用于凝胶过滤色谱法的缓冲液内，(45)(44)的方法，其中二价金属离子为钙或镁，(46)(44)或(45)的方法，其中二价金属离子的浓度为0.1-10mM，(47)(44)-(46)的方法，其中二价金属离子的浓度为1-2mM，(48)(1)-(47)的方法，其中病毒隶属于选自线状病毒科、布尼病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、正粘病毒科、反录病毒科、嗜肝DNA病毒科、呼肠病毒科和δ病毒科中的科，
(49)(1)-(48)的方法，其中病毒选自埃博拉出血热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、天花病毒、牛痘病毒、风疹病毒、SARS病毒(人冠状病毒)、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、猪瘟病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、日本血凝病毒(HVJ)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、腮腺炎病毒、RS病毒、拉沙病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、1型人T细胞白血病病毒(HTLV-1)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼肠病毒和丁型肝炎病毒，(50)(1)-(49)的方法，其中病毒为HVJ，(51)(1)-(50)的方法，其中病毒包膜为减毒或灭活病毒包膜，(52)(1)-(51)的方法，其中病毒包膜为灭活病毒包膜。
另外，通过本发明纯化的病毒包膜可广泛用作导入低分子或高分子化合物到细胞或活生物内的载体。例如，如WO2004/039406中公开，包括化疗药，并可使用包膜作为抗癌药。此外，如WO2004/046353所示，任何核酸可被包裹，并且包膜可用于筛选目标基因或蛋白质。
附图简述
图1显示了柱1的阴离子交换色谱图(实施例1)。
图2显示了柱2的疏水色谱图(实施例1)。
图3显示了柱3的凝胶过滤色谱图(实施例1)。
图4显示了纯化的HVJ包膜的SDS聚丙烯酰胺电泳图(实施例3)。
道1分子量标记，道2来自细胞的HVJ(还原)，道3来自鸡蛋的HVJ(还原)，道4细胞衍生的HVJ(未还原)，道5鸡蛋衍生的HVJ(未还原)。
实施发明的最佳方式当用在本说明书中时，“基因导入”是指以导入的基因可保持其功能的方式导入所需的天然、合成或重组基因或基因片段到活生物中或体外的靶细胞内。在本发明中导入的基因或基因片段包括DNA、RNA或核酸，其为它们的合成类似物，具有特定的序列。此外，当用在本说明书中时，基因转移、转染用于表示相同的含义(概念)。
当用在本说明书中时，“基因载体”、“转基因载体”和“病毒包膜载体”是指在病毒包膜中具有被包裹的外源基因的载体。用于转基因载体制备的病毒可为野生型病毒或重组病毒。
在本发明的一个方面中，要使用的病毒隶属于选自线状病毒科、布尼病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、正粘病毒科、反录病毒科、嗜肝DNA病毒科、呼肠病毒科和δ病毒科中的科。
优选地，病毒选自埃博拉出血热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、天花病毒、牛痘病毒、风疹病毒、SARS病毒(人冠状病毒)、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、猪瘟病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、日本血凝病毒(HVJ)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、腮腺炎病毒、RS病毒、拉沙病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、1型人T细胞白血病病毒(HTLV-1)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼肠病毒和丁型肝炎病毒。
更优选地，病毒为HVJ。
当用在本说明书中时，“灭活的病毒”是指具有灭活的基因组的病毒。灭活的病毒是缺陷性的。优选地，通过UV处理或用烷基化试剂的处理进行灭活。
当用在本说明书中时，“减毒的病毒”是指即使在感染宿主后也不会表现或很难表现致病性的病毒。
当用在本说明书中时，“外源基因”是指包括在转基因载体中的核酸序列，其来源于病毒之外的来源。在本发明的一个方面中，外源基因可操作地连接到适合于表达由转基因载体导入的基因的调节基因(例如转录所需的启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化(Poly A)附加信号以及翻译所需的脂质体结合位点、起始密码子、终止密码子等)上。在本发明的另一个方面中，外源基因不合用于表达外源基因的调节序列。在本发明的又一个方面中，外源基因为寡核苷酸或诱饵(decoy)核酸。尽管转基因载体中含的外源基因用DNA或RNA的核酸分子表示，但要被导入的核酸分子可含核酸类似物分子。转基因载体中包括的分子种类可为单基因分子种类或多于一个的不同基因分子种类。
在本说明书中，“HVJ”和“日本血凝病毒”用于指相同的含义(概念)。
在本说明书中，“HAU”指能聚集鸡红细胞0.5％的病毒活性，其中1 HAU相当于差不多24百万个病毒粒子(Okada，Y等，BikenJournal 4，209-213，1961)。
可单独用疏水色谱法进行本发明的纯化方法。优选地，使用疏水色谱法和离子交换色谱法和/或凝胶过滤色谱法。具体地，包括以下组合中的任何一种。
(1)疏水色谱法(2)疏水色谱法和离子交换色谱法的组合(没有特定的顺序)(3)疏水色谱法和凝胶过滤色谱法的组合(没有特定的顺序)(4)疏水色谱法、离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法的组合(没有特定的顺序)最优选地，使用三步骤柱色谱法。由于第三步骤旨在脱盐和浓缩，因此该步骤可根据需要应用。用于色谱法的缓冲液的pH通常为7-9。pH优选为7.8-8.5。
通常，阴离子交换色谱法可用于柱1。理论上，几乎任何阴离子交换剂(DEAP、Q、QAE、DEAE等)都可使用(DEAP；二乙基氨基丙基，Q；季胺，QAE；季氨基乙基，DEAE；二乙基氨基乙基)。优选的具体例子包括具有DEAP的ANX-琼脂糖4FF(GE AmershamBiosciences K.K.，Cat.No.17-1286-01)。这种交换剂为专用于捕获高分子的载体，因为它具有较大的孔尺寸，DEAP基团的丙基变成间隔基，载体和官能团之间的距离被伸长。通过实现ANX-琼脂糖4FF LowSub的官能团的低密度，具有对大分子而不是小分子的选择性。这是因为复合官能团通常通过色谱法的相互作用结合到蛋白质的一个分子上。由于通常的色谱法载体结合有大量过量的官能团，因此产生极高的密度环境。由于载体具有缠绕串结构，因此它能提供对可在空间上结合到更大数量点上的低分子有利的环境。换句话说，ANX-琼脂糖4FF具有对于高分子得到改善的官能团位空间。对于用于离子交换色谱法的缓冲液，可使用pH为6-9的缓冲液，例如，可提到Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等。
对于柱2，通常可使用疏水色谱法。用于疏水色谱法的优选载体的例子包括具有弱疏水性的市售疏水载体，例如，可使用具有醚基、烷基等的疏水载体。尤其是具有醚基的载体是优选的。优选载体的具体例子包括TOSOH CORPORATION制造的醚-TOYOPEARL650M(Cat.No.16173)，其具有低聚乙二醇基作为它的官能团。低聚乙二醇基被认为表现出弱疏水性，因为它在碳链中具有OH基侧链。通常用于疏水色谱法的载体的丁基和苯基表现出对蛋白质太强的结合力，具有高的疏水性。因此，它们防止了蛋白质的充分分离，并降低了回收率。开发这种载体以防止回收率的这种降低。另外，假定TOYOPEARL的疏水性低于其他公司产品的疏水性，因为官能团是通过没有间隔基的方法结合。这从苯基-琼脂糖(有间隔基)和苯基-TOYOPEARL的比较数据可预知。通常，通过具有丁基、苯基等的疏水色谱法纯化病毒是困难的。但是，当官能团具有比通常产品(市售产品)的密度低的密度时，可纯化甚至更小的病毒。对于用于疏水色谱法的缓冲液，可使用pH为6-9的那种，例如，可提到Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Bis-Tris/HCl、Bis-Tris丙烷/HCl、三乙醇胺/HCl、三乙醇胺/乙酸、N-甲基二乙醇胺/HCl、N-甲基二乙醇胺/乙酸、二乙醇胺/HCl、1，3-二氨基丙烷/HCl、哌嗪/HCl、三甲胺/HCl、乙醇胺/HCl、n-甲基吗啉/HCl等。可通过降低缓冲液中硫酸铵的浓度来洗脱结合到低聚乙二醇基上的HVJ。但是，只利用这种洗脱，峰是不尖锐的，需要相当大的液体量以完成洗脱。因此，为了提高溶液的极性，加入亲水性有机溶剂是有效的。可加入亲水性有机溶剂在0.01-50％的范围内。尽管对浓度没有限制，但通常为2％-10％，优选3-7％，最优选5％。对于亲水性有机溶剂，优选使用多元醇或低级醇。对本发明中的低级醇没有限制，只要它为加有一个羟基的C1-6低级烃即可。具体地说，例如，可提到甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等。另外，对多元醇没有限制，只要它为加有不少于2个羟基的C2-6烃即可。具体地说，例如，可提到乙二醇、丙二醇、1，3-丙二醇、甘油等。更优选使用多元醇。最优选使用乙二醇。可加入乙二醇在0.01-50％的范围内。尽管对浓度没有限制，但通常为2％-10％，优选3-7％，最优选5％。乙二醇的加入使峰变尖，洗脱体积变为柱体积的约一半，并且可同时进行纯化和浓缩。此外，在该步骤中，由于在高的硫酸铵浓度下纯化，因此HVJ可彼此结合。为了防止这种结合，向洗脱缓冲液中加入表面活性剂是有效的。可加入表面活性剂在0.001-1％的范围内，优选0.01-0.1％。对于表面活性剂，可使用Tween和Triton X。更优选使用Tween 80。可加入Tween 80在0.001-1％的范围内。优选加入0.01-0.1％的Tween 80。最优选加入0.05％的Tween 80。
此外，凝胶过滤色谱法可通常用于柱3。由于进行该步骤是为了浓缩和脱盐，因此可使用广泛应用的凝胶过滤色谱法。例如，可使用GEAmersham Biosciences K.K.的琼脂糖4FF(Cat.No.17-0149-01)和琼脂糖6FF(Cat.No.17-0159-01)。对于用于凝胶过滤的缓冲液，可使用pH为6-9的缓冲液，例如，可提到Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Bis-Tris/HCl、Bis-Tris丙烷/HCl、三乙醇胺/HCl、三乙醇胺/乙酸、N-甲基二乙醇胺/HCl、N-甲基二乙醇胺/乙酸、二乙醇胺/HCl、1，3-二氨基丙烷/HCl、哌嗪/HCl、三甲胺/HCl、乙醇胺/HCl、n-甲基吗啉/HCl等。该缓冲液可含亲水性有机溶剂，作为可加入的亲水性有机溶剂，可使用类似于上述的那些。
此外，向用于凝胶过滤色谱法的缓冲液中和/或最终纯化的制剂中加入二价金属离子作为神经氨酸苷酶的稳定剂是有效的。二价金属离子优选为钙或镁。通常，加入这些金属离子在0.1-10mM的范围内。优选加入它们至1-2mM的浓度。
实施例通过参考实施例在下文中详细说明本发明，实施例不被视为限制性的。
实施例1.通过柱色变谱法纯化HVJ对在漂浮细胞培养体系中产生的HVJ进行离心以进行细胞除去处理。通过3-阶段色谱法纯化得到的细胞培养物上清液。
首先，为了灭活内毒素，在使用前使0.25M氢氧化钠溶液通过每个柱，并在搁置不少于8小时后使用柱。
(1)离子交换树脂色谱法用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)将离心的培养物上清液稀释2倍。使其通过用含50mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)平衡的柱1以允许吸收。对于柱1，使用ANX-琼脂糖4FF Low Sub(GEAmersham Biosciences K.K.制造，Cat.No.17-1286-01)，其为阴离子交换色谱法的载体，装填到BPG200/500空柱(GE AmershamBiosciences K.K.制造)中至直径20cm、高度9cm(3L)。线性流速为96cm/h。此外，使3倍柱体积的平衡缓冲液通过，然后通过使8倍柱体积的含210mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)通过来冲洗柱。为了从柱1洗脱HVJ，使含310mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)通过。此时，由于柱通过溶液在UV 280nm处的吸收增加，因此回收了相应部分。其被用作柱1洗脱馏分。最后，使含2M氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液通过来再生柱1(见图1)。
(2)疏水树脂色谱法然后，向柱1洗脱馏分中加入等体积的4M硫酸铵溶液，得到含2M硫酸铵的溶液。使混合物通过用含2M硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)平衡的柱2以允许吸收。对于柱2，使用醚-TOYOPEARL 650M(TOSOH制造，Cat.No.16173)，其为疏水相互作用色谱法的载体，装填在BPG100/500空柱(GE AmershamBiosciences K.K.制造)中至直径10cm、高度12.5cm(1L)。线性流速为190cm/h。此外，使3倍柱体积的平衡缓冲液通过，然后通过使5倍柱体积的含1.4M硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液通过来冲洗柱。为了从柱2洗脱HVJ，使含0.8M硫酸铵、5％乙二醇和0.05％Tween 80的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)通过。此时，由于柱通过溶液在UV 280nm处的吸收增加，因此回收了相应部分。其被用作柱2洗脱馏分。最后，使5％乙二醇溶液通过来再生柱2(见图2)。
(3)凝胶过滤色谱法此外，使柱2洗脱馏分通过用含150mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)平衡的柱3。对于柱3，使用琼脂糖4FF(GE AmershamBiosciences K.K.制造，Cat.No.17-0149-01)，其为凝胶过滤色谱法的载体，装填到XK50/60空柱(GE Amersham Bioseiences K.K.制造)中至直径5cm、高度40cm(0.8L)。线性流速为120cm/h。在柱洗脱馏分后，使平衡缓冲液通过。此时，由于柱通过溶液在UV 280nm处的吸收增加，因此回收了相应部分。其被用作柱3洗脱馏分。(见图3)。
向柱3洗脱馏分中加入数量相当于1/4体积的0.5％甲基纤维素，得到含最终浓度为0.1％甲基纤维素的HVJ溶液。使其通过0.45微米的杀菌过滤器。用液氮快速冷冻混合物，并在80℃下保存。因此，可稳定地保存高纯HVJ很长时间。
在用于缓冲液等的主要试剂中，使用的三(羟基甲基)氨基甲烷、氯化钠、氯化钙2-水合物、氯化镁6-水合物、氢氧化钠、乙二醇、硫酸铵和Tween 80为Wako Pure Chemical Industries，Ltd.或Sigma Ltd.制造的特级产品。使用的盐酸为Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造的6N标准产品。作为纯化制剂的稳定剂加入的0.5％甲基纤维素为Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产的那种。为了通过过滤纯化制剂来杀菌，使用孔直径为0.45微米的亲水性过滤器MillipakGamma Gold(Nihon Millipore K.K.)。
对比实施例1.通过膜浓缩和柱色谱法纯化HVJ对在漂浮细胞培养体系中产生的HVJ进行离心以进行细胞除去处理。通过超滤膜浓缩和3-阶段色谱法纯化得到的细胞培养物上清液。
首先，为了灭活内毒素，在使用前使0.25M氢氧化钠溶液通过膜浓缩装置和每个柱，并在搁置不少于8小时后使用它们(通常，搁置约一周，完全根除活细胞和内毒素)。
(1)过滤和膜浓缩使离心的培养物上清液通过1.2μm毫格(milli-grid)过滤器以除去颗粒。使用Pellicon膜浓缩装置将上清液浓缩至600mL。
(2)凝胶过滤色谱法(柱1)使在(1)中得到的浓缩培养物上清液通过用含150mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)平衡的柱1。对于柱1，使用琼脂糖6FF(GE Amersham Biosciences K.K.制造)，其为凝胶过滤色谱法的载体，装填到BPG100/500空柱(GE Amersham Biosciences K.K.制造)中至直径10cm、高度33cm(2.5L)。线性流速为150cm/h。然后使平衡缓冲液通过。此时，由于柱通过溶液在UV 280nm处的吸收增加，因此回收了相应部分。其被用作柱1洗脱馏分。
(3)离子交换树脂色谱法(柱2)然后，使柱1洗脱馏分通过用含150mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)平衡的柱2以允许吸收。对于柱2，使用Q-琼脂糖FF(GE Amersham Biosciences K.K.制造)，其为离子交换色谱法的载体，装填到BPG200/500空柱(GE Amersham Biosciences K.K.制造)中至直径20cm、高度6.5cm(2L)。线性流速为70cm/h。此外，使5倍柱体积的平衡缓冲液通过。为了从柱2洗脱HVJ，使含0.45M氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)通过。此时，由于柱通过溶液在UV 280nm处的吸收增加，因此回收了相应部分。其被用作柱2洗脱馏分。最后，使2M氯化钠通过来再生柱2。
(4)凝胶过滤色谱法(柱3)使柱2洗脱馏分通过用含150mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)平衡的柱3。对于柱3，使用琼脂糖6FF(GE AmershamBiosciences K.K.制造)，其为凝胶过滤色谱法的载体，装填到BPG100/500空柱(GE Amersham Biosciences K.K.制造)中至直径10cm、高度33cm(2.5L)。线性流速为150cm/h。在柱洗脱馏分后，使平衡缓冲液通过。此时，由于柱通过溶液在UV 280nm处的吸收增加，因此回收了相应部分。其被用作柱3洗脱馏分。
向柱3洗脱馏分中加入数量相当于1/4体积的0.5％甲基纤维素，得到含最终浓度为0.1％甲基纤维素的HVJ溶液。使其通过0.45微米的杀菌过滤器。
在用于缓冲液等的主要试剂中，使用的三(羟基甲基)氨基甲烷、氯化钠、氯化钙2-水合物、氯化镁6-水合物和氢氧化钠为Wako PureChemical Industries，Ltd.或Sigma Ltd.制造的特级产品。使用的盐酸为Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造的6N标准产品。作为纯化制剂的稳定剂加入的0.5％甲基纤维素为Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生产的那种。为了通过过滤纯化制剂来杀菌，使用孔直径为0.45微米的亲水性过滤器Miilipak Gamma Gold(NihonMillipore K.K.)。
实施例2.纯化的HVJ的活性测量和回收率基于唾液酸降解酶(神经氨酸苷酶，NA)活性和鸡红细胞凝集活性(血凝素活性，HA)测量HVJ的活性。两者都与回收的病毒的浓度和数量成比例关系，并且是定量的。用这两种方法测定的本发明实施例1中HVJ的残留活性和基于NA活性值的回收率显示在表1中。使用对比实施例的回收率显示在表2中。从表1和2的比较可看出，本发明的较好效果是明显的。
(表1)(本发明，实施例1)
(表2)(常规纯化方法，对比实施例1)
实施例3.通过SDS-PAGE分析纯化的HVJ的纯度在4-12％SDS-PAGE凝胶上进行HVJ电泳分离。用增溶剂(SigmaLtd.CelLytic-M Cat.No.C2978)溶解HVJ，该增溶剂用于适合病毒的膜蛋白并直接被电泳分离。使用其作为非还原处理样品。使用在溶解后加有2-巯基乙醇并在95℃下热处理10分钟的HVJ作为还原处理样品。为了与通常的方法比较，通过在消毒鸡蛋中培养和用阴离子交换色谱法纯化绒膜尿囊液得到的HVJ按相同的方式被处理。在100V的恒定电压下对样品进行电泳2.5小时，用SYPRO Ruby荧光菌株(Bio-Rad，Richmond，CA，SYPRO Ruby Protein Gel Stain Cat.No.170-3125)染色，并通过荧光成像系统分析凝胶。电泳结果显示在图4中。与基于从鸡蛋纯化的常规方法相比，可得到具有相同纯度的HVJ包膜。
工业实用性可提供以高回收率纯化病毒包膜同时保持其细胞融合活性的方法。纯化的病毒包膜可用作导入生物聚合物如基因等到细胞或活生物内的载体。
根据本发明的方法，可以以比常规方法高的回收率纯化灭活的病毒包膜(例如HVJ)，同时保持它的融合活性。因此，能用于病毒包膜的工业生产。另外，本发明的方法可应用于未灭活包膜病毒的纯化。
本申请基于在日本提交的专利申请No.2004-219381(提交日期2004年7月27日)，本文引入其全部内容作为参考。
权利要求
1.一种纯化病毒包膜的方法，包括使用疏水色谱法。
2.权利要求1的方法，其中所述疏水色谱法的官能团为弱疏水基。
3.权利要求1或2的方法，其中所述疏水色谱法的官能团为低聚乙二醇基或苯基。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述疏水色谱法的官能团为低聚乙二醇基。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述疏水色谱法与离子交换树脂色谱法和/或凝胶过滤色谱法联合。
6.权利要求5的方法，其中离子交换色谱法和疏水色谱法联合。
7.权利要求5或6的方法，其中离子交换树脂用于第一次色谱法，疏水树脂用于第二次色谱法。
8.权利要求5-7任一项的方法，其中离子交换色谱法为阴离子交换色谱法。
9.权利要求5-8任一项的方法，其中离子交换色谱法为弱阴离子交换色谱法。
10.权利要求5-9任一项的方法，其中离子交换色谱法的官能团为二乙基氨基丙基(DEAP)。
11.权利要求5-10任一项的方法，其中离子交换色谱法的官能团被低密度取代(Low Sub)。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中色谱法的缓冲液具有7-9的pH。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中色谱法的缓冲液具有7.8-8.5的pH。
14.权利要求5-13任一项的方法，其中离子交换色谱法的缓冲液含氯化钠或氯化钾。
15.权利要求5-14任一项的方法，其中离子交换色谱法中的样品吸收用缓冲液含0.01-150mM的氯化钠。
16.权利要求5-15任一项的方法，其中离子交换色谱法中的样品吸收用缓冲液含30-70mM的氯化钠。
17.权利要求5-16任一项的方法，其中离子交换色谱法中的冲洗用缓冲液含150mM-250mM的氯化钠。
18.权利要求5-17任一项的方法，其中离子交换色谱法中的冲洗用缓冲液含190-230mM的氯化钠。
19.权利要求5-18任一项的方法，其中离子交换色谱法中的洗脱用缓冲液含100mM-1000mM的氯化钠。
20.权利要求5-19任一项的方法，其中离子交换色谱法中的洗脱用缓冲液含290-330mM的氯化钠。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中疏水色谱法的缓冲液含硫酸铵、硫酸钠或氯化钠。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中疏水色谱法中的吸收用缓冲液含1.0M-2.5M的硫酸铵。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中疏水色谱法中的吸收用缓冲液含1.8-2.2M的硫酸铵。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中疏水色谱法中的冲洗用缓冲液含1.0-1.6M的硫酸铵。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中疏水色谱法中的冲洗用缓冲液含1.2-1.5M的硫酸铵。
26.权利要求1-25任一项的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.01-1.5M的硫酸铵。
27.权利要求1-26任一项的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.6-1.0M的硫酸铵。
28.权利要求1-27任一项的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含亲水性有机溶剂。
29.权利要求28的方法，其中亲水性有机溶剂为多元醇或低级醇。
30.权利要求28或29的方法，其中多元醇为乙二醇。
31.权利要求28-30任一项的方法，其中乙二醇的浓度为0.01-50％。
32.权利要求28-31任一项的方法，其中乙二醇的浓度为2-10％。
33.权利要求28-32任一项的方法，其中乙二醇的浓度为3-7％。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含表面活性剂。
35.权利要求1-34任一项的方法，其中上述表面活性剂为Tween 80或Triton X。
36.权利要求1-35任一项的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.001-1％的Tween 80.
37.权利要求1-36任一项的方法，其中疏水色谱法中的洗脱用缓冲液含0.01-0.1％的Tween 80。
38.权利要求1-37任一项的方法，其中在疏水色谱法中，通过从吸收过程中的温度降低温度不小于5℃来引起样品吸收后的洗脱。
39.权利要求38的方法，其中洗脱过程中的温度在(室温-5)℃-4℃的范围内。
40.权利要求1-39任一项的方法，其中在疏水色谱法中，通过升高吸收用缓冲液的pH不小于0.5来引起样品吸收后的洗脱。
41.权利要求40的方法，其中洗脱过程中的pH在6-10的范围内。
42.权利要求1-41任一项的方法，其中在疏水色谱法后进行凝胶过滤色谱法。
43.权利要求1-42任一项的方法，其中凝胶过滤色谱法的载体为琼脂糖。
44.权利要求1-43任一项的方法，其包括加入二价金属离子到用于凝胶过滤色谱法的缓冲液内。
45.权利要求44的方法，其中二价金属离子为钙或镁。
46.权利要求44或45的方法，其中二价金属离子的浓度为0.1-10mM。
47.权利要求44-46任一项的方法，其中二价金属离子的浓度为1-2mM。
48.权利要求1-47任一项的方法，其中病毒隶属于选自线状病毒科、布尼病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、正粘病毒科、反录病毒科、嗜肝DNA病毒科、呼肠病毒科和δ病毒科中的科。
49.权利要求1-48任一项的方法，其中病毒选自埃博拉出血热病毒、克里米亚-刚果出 血热病毒、汉坦病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、天花病毒、牛痘病毒、风疹病毒、SARS病毒(人冠状病毒)、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、猪瘟病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、日本血凝病毒(HVJ)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、腮腺炎病毒、RS病毒、拉沙病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、1型人T细胞白血病病毒(HTLV-1)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼肠病毒和丁型肝炎病毒。
50.权利要求1-49任一项的方法，其中病毒为HVJ。
51.权利要求1-50任一项的方法，其中病毒包膜为减毒或灭活病毒包膜。
52.权利要求1-51任一项的方法，其中病毒包膜为灭活病毒包膜。
全文摘要
提供病毒(例如日本血凝病毒，HVJ)包膜的工业纯化方法。具体地说，提供通过离子交换色谱法和疏水色谱法以高回收率纯化灭活病毒包膜同时保持病毒细胞融合活性的方法。纯化的病毒包膜可用作导入生物聚合物如基因等到细胞和活生物内的载体。另外，这种方法可用于纯化减毒的包膜病毒。
文档编号C12N7/02GK101018804SQ200580025540
公开日2007年8月15日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年7月27日
发明者井冈进一 申请人:基诺美生物工程(制药)公司