具有改良生长特性的植物及其制备方法

专利名称：具有改良生长特性的植物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及通过增加植物茎干组织中E2F二聚化配偶体(DP)编码基因的表达和/或通过增加植物茎干组织中DP蛋白质的活性来改良植物生长特性的方法。本发明还涉及在茎干优选的控制元件控制下的DP编码基因转化的植物，相对于对应的野生型植物，该植物具有改良的生长特性。
由于世界人口的持续增加，提高农业效率一直是研究的主要目标。农作物和园艺改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这种选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传组分的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。相反，分子生物学的发展已经使人们能够更精确地操作植物的种质。植物的基因工程需要分离和操作遗传物质(通常以DNA或RNA的形式)和继之将遗传物质导入植物。这类技术导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状的植物的开发。具体的目标经济性状包括高的产量和生物量。
改良一种或多种植物生长特性的能力将在农作物改良、植物育种、观赏植物的生产、树木栽培、园艺、林学以及在藻类或植物的生产领域具有多种应用(用作生物反应器，例如用于药物如抗体或疫苗的生产，或用于有机废物的生物转化，或在高产的藻类和植物的实例中用作燃料)。
相对于对应的野生型植物，已发现在植物茎干组织中，DP编码基因表达的增加和/或DB蛋白质活性的增加使植物具有改良的生长特性。
DP蛋白质是广泛保守的蛋白质并且涉及细胞周期的控制(Gutierrez等人(2002)Current Opinion in Plant Biology 5480-486)。DP因子与E2F因子一起作用，形成能够起始S期特异基因转录的异二聚体。Magyar等人，2000(FEBS letters，48679-97)报道了E2F因子、DP因子和E2F-DP样(DEL)因子的鉴别。基于序列比较，如Vandepoele等人，2002(Plant Cell14(4)903-16，在此处完整引入作为参考)所述，将编码这些蛋白质的拟南芥属(Arabidopsis)基因划分为不同的种类。此外，由Magyar等人报道(在此处也完整引入作为参考)了典型DP蛋白质的结构特性。例如，Magyar等人的图3A和B显示在拟南芥DP蛋白质中特征性DNA结合结构域和二聚化结构域的位置。Vandepoele等人的图5很好地说明由于存在一个DNA结合结构域和一个二聚化结构域，DP蛋白质与相关的蛋白质，如E2F因子和DEL不相同。
以Pioneer Hi-Bred之名公布的国际专利申请WO00/47614表明使用组织特异性或细胞特异性启动子控制DP表达提供不同的生长特性。具体而言，其表明(i)使用种子特异性启动子将刺激细胞分裂速率，产生增加的种子生物量；(ii)使用强表达的早期雄花穗特异性启动子将增加这一完整生殖结构的发育；和(iii)使用根特异性启动子将产生更大的根和更快的生长(即更多的生物量积累)。然而，在该申请中没有产生或例证具有这类不同生长特性的植物。
后来以Consejo Superior De Investigaciones Cientificas为名申请的国际专利申请WO01/21644仅表明可以通过重组DP的表达控制植物生长，而没有例证。尽管陈述“特别有用的是使用组织特异性启动子或化学诱导型启动子控制表达的核酸”，没有提到或例证使用这类核酸转化并且具有改良生长特性的植物的应用。
尽管存在上述启示，使用现有技术的教导还没有产生改良的转基因植物，其说明如现有技术所启示的，使用DP在改良植物生长特性中是无效的。
出人意料地，现已发现可以通过增加植物茎干组织中DP蛋白质的活性和/或通过增加DP编码基因在植物茎干组织中的表达来改良植物生长特性。
本发明提供相对于对应的野生型植物，用于改良植物生长特性的方法，其包括特别在植物茎干组织中增加DP蛋白质或其同源物活性和/或在植物茎干组织中增加DP编码基因或其功能变体的表达。
有利地，相对于对应的野生型植物，本发明方法的操作使植物具有多种改良的生长特性，特别是增加的生物量。所述改良的生长特性可以是稳定的并且可以遗传至下一代。
术语“生长特性”在下文详述的关于生长的其他特性中包括增加的生物量。
术语“生物量”指产生的生物物质的量。生物量的增加可以是在相对于对应的参考植物的生物量(例如相对于对应的野生型植物的生物量)的植物的一个或多个部分。本发明植物的特征在于增加的地上生物量，其对于农作物植物的营养组织生长特别重要。例如，对于青贮饲料玉米，典型的经济价值参数是地上生物量和叶的能量含量；对于树和甘蔗，典型的经济价值参数是茎的地上生物量。
本文所用的术语“增加的生物量”还可以包括增加的产量，特别是增加的种子产量。
本文所定义的术语“增加的产率”意指相对于对应的野生型植物，在如下的一个或多个方面的增加(i)植物一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分，增加的根生物量或增加的任何其他可收获部分的生物量，(ii)增加的种子产率，其可能源于增加的种子生物量(粒重)，可以是每株植物粒重的增加或单个种子基础上的增加，并且所述粒重的增加可以是因改变的种子大小所致，如种子长度和/或种子宽度和/或种子面积；(iii)增加的(饱满)种子数；(iv)增加的种子大小，其还可以影响种子的组成；(v)增加的种子体积，这也可能影响种子的组成；(vi)增加的收获指数，其可以表达为可收获部分如种子的产量占总生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，其是从所计的饱满种子数和它们的总重量推断的。增加的TKW可能源于增加的种子大小和/或粒重。
以玉米为例，产量增加可以表现为以下一个或多个方面每公顷或每英亩植物数的增加、每株植物穗的增加、畦数、每畦种子数、粒重、千籽粒重、穗长度/直径的增加。以稻为例，产量的增加可以表现在下列的一个或多个方面的增加每公顷或每英亩的植物数、每株植物圆锥花序数、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花数、种子饱满率的增加、千籽粒重的增加等等。产量的增加还可以产生改变的构造或可以作为改变的构造的结果发生。
因为本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于处于其生活周期的相应阶段的对应野生型植物的生长速率而言，这些植物很可能显示出增加的生长速率(在它们至少部分的生活周期期间)。增加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或可以基本存在于整个植物中。具有增加的生长速率的植物甚至可以呈现提早开花。生长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段或基本在整个植物生命周期中。在植物生命周期中早期增加的生长速率可以反映增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使得植物能够比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速率充分增加，可能允许播种相同植物物种的更多种子(例如播种和收获稻类植物，接着播种和收获更多的稻类植物，所有这些都在一个常规的生长期内)。类似地，如果生长速率充分增加，可能允许播种不同植物物种的更多种子(例如播种和收获稻类植物，接着，例如，播种和任选地收获大豆、马铃薯或任何其它合适的植物)。在一些植物的情形下从同一根茎收获增加的次数也是可能的。改变植物的收获周期可能导致每英亩年生物量产量的增加(由于(比方说在一年里)任何特定植物生长和收获的次数增加)。与野生型相似物相比，生长速率的增加还可以使能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定的。如果缩短收获周期，可以避免这类不利条件。可以通过生长实验测绘生长曲线得到多个参数来确定生长速率，这类参数可以是T-Mid(植株达到其最大大小的50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的90％所需的时间)等等。
本文所用的术语“生长特性”还包括植物构造。本发明的植物呈现改变的构造，其为由于增加的生物量而表现出的地上部分改变的形状和尺寸。这一特性对于多种观赏植物是有利的。本文所用的术语“构造”包括植物的外观或形态，包括任何一种或多种结构特性或结构特性的组合，所述结构特性如植物的细胞、组织、器官或植物的细胞、组织或器官的组的形状、尺寸、数量、位置、质地、排列和模式。特别优选的是具有下列任一项或多项的植物增加的分蘖(或相应的植物部分)的数量、尺寸、形状；增加的枝条和/或叶的数量。
在植物处于无胁迫条件，或植物相对于对照植物暴露于多种胁迫下发生任何前述生长特性的改良。植物通常通过更为缓慢地生长来应答暴露的胁迫。在严重胁迫的条件中，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，中等胁迫在本文中定义为当植物暴露于此而不导致植物完全停止生长的任何胁迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进展，栽培的农作物植物常常不会遭遇到严重胁迫。因此，中等胁迫诱导的受损的生长经常是农业上的不理想特性。中等胁迫是植物可能接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物可以被暴露于其的日常生物的和/或非生物的(环境的)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或冷/冰冻温度产生的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫还可以由化学药品产生。生物胁迫一般是由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫产生的那些胁迫。
在多种植物物种可以有利地修饰上述生长特性。
本文所用得术语“植物”包括整个植物、植物和部分植物的祖先和后代，包括种子、茎干、茎、根(包括块茎)以及植物细胞、组织和器官。术语“植物”还因此包括悬浮培养物、胚、分生区、胼胝体组织、叶、种子、根、茎干、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木金合欢属物种(Acacia spp.)、槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp.)、槟榔(Arecacatechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaea plurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp.)、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距豌豆(Centroemapubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、柏木属物种(Cupressus spp.)、Cyatheadealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属物种(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、粗糙蚌贝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusinecoracana)、画眉草属物种(Eragrestis spp.)、刺桐属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowiana)、草莓属物种(Fragariaspp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geraniumthunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthiaaltissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Iris spp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaenaleucocephala、Loudetia simplex、罗顿豆(Lotonus bainesii)、百脉根属物种(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属物种(Malus spp.)、Manihotesculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食豆属物种(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属物种(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属物种(Photiniaspp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zeamays)、苋菜、洋蓟、芦笋、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣绿甘蓝、亚麻、羽衣甘蓝、小扁豆、油料种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、squash tea、树、草(包括饲料草)和藻类等。
根据本发明优选的特性，植物是农作物植物，如浮游植物、大豆、向日葵、油菜、油菜籽、棉花、苜蓿、番茄、土豆、莴苣、烟草、木瓜、南瓜、杨树、桉树、松树、leguminosa、亚麻、lupinus和高梁。根据本发明更优选的实施方案，所述植物是单子叶植物，如甘蔗、洋葱或竹子。进一步优选的植物是谷类，如稻、玉米(包括饲料玉米)、小麦、大麦、粟、燕麦和黑麦。
术语“DP”意指E2F二聚化配偶体。如名称所示，DP蛋白质能够与E2F/DEL转录因子二聚化。这可以通过，例如，如Magyar等人，2000(FEBSletters，48679-97)所述的双杂交测定或通过免疫沉淀检测。Magyar等人报道了典型的DP蛋白质的结构特性，其在此处完整引入作为参考。例如，Magyar等人的图3A和B显示在拟南芥DP蛋白质中的特征性DNA结合结构域和二聚化结构域的位置。Vandepoele等人，2002(Plant Cell 14(4)903-16)的图5很好地说明由于存在一个DNA结合结构域和一个二聚化结构域，DP蛋白质与相关的蛋白质，如E2F因子和DEL不相同。图3显示在拟南芥(Arabidopsis thaliana)DPb序列中这些结构域的位置。本领域的技术人员基于可获得的知识将能够容易地鉴别DP蛋白质。
根据本发明优选的特性，DP蛋白质由SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 2的同源物代表这类同源物的具体实例包括Magyar等人2000(FEBS，486(1)79-87)所述的拟南芥DP蛋白质、Ramirez-Parra和Gutierrrez，2000(FEBS，86(1)73-8)所述的普通小麦(Triticum aestivum)DP蛋白质和以Du Pont名称公布的国际专利申请WO99/53075中的凤仙花属(Impatiens)、大豆和玉米的DP蛋白质。
优选地，本文所定义的DP蛋白质或其同源物指与DP蛋白质，例如，与SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23中任一个具有一定的序列同一性的多肽，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如Vandepoele等人，2002(Plant Cell 14(4)903-16)所示，可以将拟南芥的DP蛋白质细分为两个不同类别，DPa和DPb。本文所用的术语“同源物”也包括两类成员。在本发明的方法中可以方便地使用这些不同类别的DP蛋白质或其编码核酸。
用于本发明方法中的DP核酸或DP蛋白质优选获自从植物，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更加优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。根据另一实施方案，DP多肽是DPb多肽。“DPb”指相对于AtDPa更接近于AtDPb的蛋白质。可以如下文所述通过计算序列同一性百分数，或者通过建立保守基序的存在来将查询序列分类为DPa或是DPb。鉴别查询序列为DPa或DPb的另一方法是将查询序列导入系统树，如在图5所示的那个。相对于AtDPa，DPb蛋白质应该聚类更接近于AtDPb。
用于本发明方法中优选的DP多肽或同源物是与DP蛋白质，例如，与SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的DP蛋白质中任一个具有一定序列同一性的那些，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。可以经由一般存在于所有DP蛋白质中的保守区计算百分数同一性。这一区域从残基CEKVES(如从SEQ ID NO2的位置111)附近开始至FVLKTM(如，到SEQ ID NO 2的位置290)附近；见图3。
在DP蛋白质亚类中有三个基序是特别保守的，所述亚类包括拟南芥的DPb。在这里由SEQ ID NO 9(基序1，LDIXXDDA)、SEQ ID NO 10(基序2，KKKK/RR)和SEQ ID NO 11(基序3，AXGXDK)代表这些“DPb”基序的共有序列(见图3)。
优选地，本发明方法中使用的DP多肽或同源物中存在这些基序。图3显示具有“DPb”基序位置的DP蛋白质的比对。由该比对所见，精制共有序列是可能的。例如，在基序1的位置4有Q或H残基的高概率，并且在位置5有G或A残基的高概率。同样地，在基序3的位置2有V、T或A残基的高概率，并且在位置4有P或A残基的高概率。本领域技术人员将认识到SEQ ID NO 9、10或11所代表的DPb基序，其可以通过例如1或2个错配与共有的DPb基序而不同，但没有任何功能损失。
还可以使用上述新鉴别的“DPb”基序搜索数据库，并鉴别同源的DPb多肽和编码序列。
蛋白质结构域、基序和盒的鉴别在本领域技术人员的范围内将是容易做到的。可以通过PRODOM(http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html)、PIR(http//pir.georgetown.edu/)、PROSITE(http//au.expasy.org/PROSITE/)或pFAM(http//pFAM.wustl.edu/)数据库获得蛋白质结构域信息。为这类结构域搜索而设计的软件程序包括，但不限于MotifScan、MEME、SIGNALSCAN和GENESCAN。MotifScan是优选的软件程序并且可获自http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN，该程序使用PROSITE和pFAM的蛋白质结构域信息。MEME算法(版本3.0)可以在GCG程序包或在http//www.sdsc.edu/MEME/meme找到。SIGNALSCAN版本4.0可获自http//biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html。GENESCAN可在http//gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html找到。
DP多肽或同源物可以在(公共的)序列数据库中找到。DP蛋白质同源物在序列数据库中比对和鉴别的方法是本领域公知的。这些方法涉及使用由本发明提供的序列，例如SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23(或SEQ ID NO 1)筛选序列数据库。用于序列比对和比较的不同的搜索算法和软件是本领域众所周知的，并且包括例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。优选使用计算序列同一性百分比并进行序列之间相似性统计分析的BLAST软件。被称为BLAST程序的程序组具有5个不同的执行程序三个为核苷酸序列查询而设计(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)，两个为蛋白质序列查询而设计(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology76-80，1994；Birren等人，GenomeAnalysis，1543，1997)。用于进行BLAST分析的软件可以公开获自生物技术信息国家中心。有用的序列数据库包括，但不限于Genbank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank)、欧洲分子生物实验室核酸数据库(EMBL)(http/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或它的译本或MIPS数据库(http//mips.gsf.de/)。
用于本发明方法中的优选DP多肽具有与SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23中任一个至少40％序列同一性。可以使用配对全球比对程序执行Needleman-Wunsch算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)来计算序列同一性百分数，该算法最大化配对数且最小化空位数。为了计算上述百分数，可以使用具有空位开放罚分为10并且空位延伸罚分为0.1的程序needle(EMBOSS包)。对于蛋白质，优选使用具有字长为3的blosum62矩阵。对于核酸，使用由EMBOSS包提供的，字长为11的矩阵“DNA-full”。Needleman-Wunsch算法最适于从蛋白质的全长上分析相关的蛋白质序列。备选地，可以在如以上提到的保守区、结构域或基序中进行计算，分析相关的蛋白质，并确定如以上提到的序列同一性百分数。
符合“DP多肽或其同源物”定义的多肽的实例是拟南芥DPb(SEQID NO 2和对应的编码序列SE ID NO 1)。在图3中给出了SEQ ID NO 12到23代表的DP蛋白质的其他实例，以及它们的Genbank登录号、它们的编码序列和它们的蛋白质序列。目前可在公共数据库如Genbank获得拟南芥和稻(Oryza sativa)的基因组序列，并且正在测序其他基因组。因此，期望使用程序BLASTX或BLASTP或其他程序，通过与SEQ ID NO 1到4或12到23中任一个进行序列比对，可以容易地鉴别更多的同源物。
尽管其可能呈现“至少40％同一性”的相对低序列同源性，DP蛋白质都具有DNA结合结构域和二聚化结构域，是高度保守的。应该理解的是，术语DP多肽或其同源物不限于由SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的序列，而是具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域的任何多肽，所述多肽可以用于本发明的方法。具有这类特性的DP多肽保留了DP蛋白质的相似功能活性和/或生物活性，或至少部分的功能活性和/或生物活性。生物活性是当蛋白质处于其天然环境下的活性。可以通过，例如在Magyar等人，2000(FEBS letters，48679-97)所述的双杂交或使用免疫共沉淀检测二聚化活性(即，DP与E2F转录因子二聚化的能力)。
DP多肽/蛋白质或其同源物是由“DP编码核酸”或由“DP编码基因”编码；该术语在此可互换使用，并意指编码上述DP多肽或其同源物的核酸。DP编码核酸的实例包括由SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一个代表的那些。DP的编码核酸及其功能变体可用于实施本发明的方法。DP编码核酸的功能变体包括这类核酸的部分和/或能够与DP编码核酸杂交的核酸。用于本发明方法中的功能变体(部分或杂交序列)是编码多肽的那些，所述多肽具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域，所述功能变体可以用于本发明的方法中。
本文所用的术语部分指包含至少80个核苷酸的DNA片段，并且该部分编码的多肽具有DP的特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。这些部分可以用于本发明的方法。可以例如通过对DP编码核酸进行一个或多个缺失来制备所述部分。所述部分优选地是SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一个代表的核酸的部分，并且该部分符合上述要求。
DP编码核酸的另一功能变体是能够与DP编码核酸杂交，优选在严格条件下杂交的核酸。本文定义的这类杂交序列在长度上是至少80个核苷酸并且编码的多肽具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。这类杂交序列可以用于本发明的方法。所述杂交序列优选能够与SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一个代表的核酸杂交，并且该杂交序列符合上述要求。
本文所用的术语“杂交”意指在杂交过程中与基本同源的互补核酸序列的退火。杂交过程可以完全发生在溶液中，即两条互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖凝胶珠子或任何其它树脂上。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成条件等的影响。
在简化的严格条件，优选地在严格条件下进行杂交。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成条件等的影响。在简化的严格条件，优选地在严格条件下进行杂交。严格条件的实例如下表1所示严格条件是那些至少如，例如条件A-L的严格性；并且简化的严格条件是至少如，例如条件M-R的严格性。
表1杂交和洗涤条件的实例

“杂交体长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列和鉴别本文所述的保守区来确定杂交体长度。
在杂交和洗脱缓冲液中可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后洗脱15分钟。杂交和洗脱可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和高达50％甲酰胺。*Tb-Tr对于预期长度少于50个碱基对的杂交体，杂交温度应该比杂交体的熔解温度Tm低5-10℃，根据下列方程式确定Tm。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2×(A+T的碱基数)+4×(G+C的碱基数)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6×lg(Na+)+0.41×(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，并且(Na+)是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC，(Na+)＝0.165M)。±本发明包括以PNA或修饰的核酸取代的任何一个或多个DNA或RNA杂交配偶体的取代物。
用于本发明方法中的DP编码核酸的其他功能变体包括DP编码核酸的等位变体、剪接变体、由于遗传密码简并性产生的变体、DP编码核酸的家族成员和由一个或多个间插序列，如内含子、间隔序列或转座子间断的变体。每个上述功能变体均能够编码多肽，所述多肽具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域；这些功能变体可以用于本发明的方法中。DP编码核酸或其功能变体可以是DNA或其互补链、RNA、cDNA、基因组DNA、合成DNA的整体或部分形式的双链或单链核酸。
SEQ ID NO3表示的序列是SEQ ID NO 1剪接变体的实例。在稻中发现剪接变体的其他实例，其中两个DPb蛋白质各自具有两个不同的剪接形式AAO72709.1和AY224589，其是同一基因组DNA的剪接变体，以及AAO72671.1和AY224551，其是同一基因组DNA的剪接变体且编码其他DPb蛋白质。本文所用的术语“剪接变体”包括其中选择的内含子和/或外显子已经被切除、替换或添加的核酸的变体。适用于本发明方法中的剪接变体编码的多肽具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。可以在自然界中发现这类剪接变体，或可以通过选择性保留蛋白质的这些功能片段来制备这类剪接变体。制备剪接变体的方法在本领域是熟知的。
另一DP编码核酸的功能变体是DP编码基因的等位变体。等位变体天然存在，且囊括在本发明的方法之内的是这些天然等位基因的用途。等位变体还包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物体的天然存在的多态品系中，SNP和INDEL构成了最大的一类序列变体。适于在本发明方法中使用的等位变体是编码多肽的那些，所述多肽具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。
DP编码核酸或其功能变体可衍生自任何天然或人工来源。所述来源可以是微生物来源，如细菌、酵母或真菌，或植物、藻类或动物(包括人)来源。可以通过精确的人工操作，在组合物和/或基因组环境中，从该核酸的天然形式修饰其。优选植物来源的核酸，无论来自同一植物物种(例如，对其被导入的物种)或者无论来自不同植物物种。可以从双子叶物种，优选十字花科，更优选从拟南芥分离该核酸。更优选地，从拟南芥分离的DP编码基因是由SEQ ID NO 1或3表示的，并且编码的DP氨基酸序列是如由SEQ ID NO 2或4表示的。其他优选的序列由SEQ ID NO 12、14、16、18、20和22表示，并且对应的氨基酸序列由SEQ ID NO 13、15、17、19、21或23表示。
用于本发明方法中的DP编码核酸序列可以与，例如与SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20或22中任一个的DP编码核酸序列具有序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入、且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。为了产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸可以被具有相似性能(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打断α-螺旋结构或β-片层结构的趋势)的其它氨基酸所取代。保守置换表是本领域熟知的(例如参见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。用于本发明的方法中的同源物是那些多肽，其具有DP的特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。具有这类特性的DP多肽保留与DP蛋白质相似的功能活性和/或生物活性，或DP蛋白质的至少部分功能活性和/或生物活性。
同源物的两个特殊形式，即直系同源物和旁系同源物，其用于描述基因遗传关系的进化概念。术语“直系同源物”涉及在不同生物中的基因，其由于祖先关系是同源的。术语“旁系同源物”涉及某物种基因组内的基因复制，产生旁系同源基因。本文所用的术语“同源物”还包括DP蛋白质的旁系同源物和直系同源物，其也可用于实施本发明的方法。
通过进行交互Blast搜索可以容易地找到DP蛋白质在其他植物物种中的直系同源物所述搜索涉及使用如BLAST程序，以查询基因或蛋白质(例如，SEQ ID NO 1到4，或12到23中任一个)搜索一个或多个序列数据库。从这一搜索产生的最高级别的目标基因继之被用作相似BLAST搜索中的查询序列。那些与原始查询序列具有最高匹配的基因被认为是直系同源基因。例如，为了找到拟南芥基因的稻直系同源物，可以在稻数据库，如在NCBI网址(http//www.ncbi.nim.nih.gov)提供的Oryza sativa Nipponbare数据库进行BLASTN或TBLASTX分析。下一步，在拟南芥序列数据库中，使用最高级别的稻序列进行反向BLAST搜索。可以使用该方法从许多不同物种，例如，从玉米中鉴别直系同源物。
可以通过在“查询”DP蛋白质衍生的相同物种的序列中进行Blast搜索，可以容易地找到DP蛋白质的旁系同源物。从Blast搜索所选择的序列中，可以鉴别真正的旁系同源物为具有最高序列同一性的那些。
用于本发明的方法中的直系同源物和旁系同源物是那些多肽，所述多肽具有DP特征性特点，即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。优选地，DP旁系同源物还包括如下文所述的DPb基序。
可以天然产生并且可以从自然界中分离如上文所定义的DP编码核酸的功能变体和DP蛋白质的同源物。一旦知晓同源物的序列及其对应的编码序列，本领域的技术人员将能够，例如通过PCR技术从生物材料，如基因组文库分离对应的DP核酸。实施例1中描述了这类实验的一个实例。备选地，当序列未知时，可以基于来自已知DP蛋白质的探针，经由杂交技术从生物材料分离新的DP蛋白质。备选地和/或另外地，可以经由涉及，例如突变(取代、插入或缺失)或衍生的技术，人工制备DP编码核酸的功能变体或DP蛋白质的同源物。本文称这些功能变体为“衍生物”，只要该衍生物是具有DP特征性特点的多肽，其也可用于本发明的方法，所述DP特征性特点即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域，或者在核酸的情况下，衍生物编码这类多肽。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易地制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。
同源物还可以是取代变体的形式。术语DP蛋白质的“取代变体”指那些变体，其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，而将一个不同的残基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大约1到10个氨基酸残基，缺失为大约1到20个残基。优选地，氨基酸取代包括保守氨基酸取代。
同源物还可以是蛋白质的“插入变体”的形式，其中一个或多个氨基酸残基被引入到DP蛋白质中的预定位点。插入片段可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入片段约为1到10个氨基酸。氨基或羧基末端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂合系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
“缺失变体”形式的同源物的特征在于从该蛋白质除去一个或多个氨基酸。
DP多肽或其同源物可以是肽、寡肽、多肽、蛋白质或酶形式的衍生物，其特征在于与天然产生的DP蛋白质的氨基酸相比，天然和非天然生成氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。与其衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可以包括一个或多个非氨基酸取代物。这类非氨基酸取代物包括，例如，非天然产生的氨基酸、报告分子或其他配体，其共价地或非共价地连接于氨基酸序列。可以连接这类报告分子以利于DP蛋白的检测。
用于本发明方法中的DP多肽的另一类型是DP蛋白质的活性片段。DP蛋白质的“活性片段”包含DP蛋白质的至少80个连续的氨基酸残基，所述残基与天然产生的蛋白质或其的部分保持相似的生物活性和/或功能活性。适用于本发明方法的活性片段包括具有DP特征性特点的多肽，所述DP特征性特点即(i)二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。此外，活性片段包括在第二个或第三个或其他内部甲硫氨酸残基开始的DP蛋白质的片段；这些片段源自在内部ATG密码子起始的蛋白质翻译。
可以通过导入遗传修饰(优选在编码DP的基因或其同源物的基因座上)增加DP多肽或其同源物的活性，或者DP编码基因或其功能变体的表达。本文所定义的基因座意指包括目标基因和编码区上游或下游10KB的基因组区。
例如，遗传修饰可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入TDNA激活、TILLING、定点诱变、定向进化、同源重组，或通过将DP编码核酸或编码DP多肽或其同源物的功能变体导入植物。在导入遗传修饰之后，继之选择增加DP多肽活性的任选步骤，该增加的活性使植物具有改良的生长特性。
T-DNA激活标签(Hayashi等人，Science(1992)1350-1353)涉及在目标基因的基因组区域或基因编码区域上游或下游10KB中插入通常包含启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA，如此构型以便启动子指引靶基因表达。通常，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。该启动子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通过农杆菌属感染随机插入到植物基因组中，并导致靠近该插入的T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体[在这一实例中为植物]中表达的任何启动子。例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部突变技术)，把遗传修饰引入到DP编码基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定、并最终分离能显示DP活性的DP蛋白质。TILLING还能够选择携带这类突变变体的植物。这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现的更高的DP活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链；(e)DHPLC，其中库中异源双链的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallumNat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple 2004(TILLING-ahigh-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.20045(2)145-50)综述)。
可利用定点诱变产生DP编码核酸的变体或其编码活性蛋白质的功能变体。可提供多种方法获得定点诱变；最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著http//www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向进化也可用于产生DP编码核酸的变体。这包括重复的DNA改组，接着进行合适的筛选和/或选择以产生DP编码核酸的变体或其编码DP多肽部分的变体，或其具有修饰的生物活性部分的变体(Castle等人，(2004)Science 304(5674)1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
TDNA激活、TILLING和定点诱变是能够产生新的等位基因，以及保留DP功能并因此可用于本发明的方法中的DP变体的技术的实例。
同源重组能够在基因组的指定选择位置引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓physcomitrella。用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)3077-84)，而且在禾谷类作物例如稻中描述(Terada R等人，Nat.Biotechnol.2002 Efficient gene targeting byhomologous recombination in rice；Lida和Terada，Curr Opin Biotechnol.2004 15(2)132-8A tale of two integrations，transgene and T-DNAgenetargeting by homologous recombination in rice)。靶标核酸(其可以是DP核酸或如前述定义的它的变体)不需要靶向于DP基因的位点，但是可以被导入在，例如，高表达的区域。例如，待靶向的核酸(其可以是DP核酸或如前述定义的它的变体)不需靶向到DP编码基因的基因座中，但是可以被引入到高表达的区域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替换内源基因，或是额外引入到内源基因中。
根据本发明优选的实施方案，可以通过在植物中导入并表达编码DP多肽或其同源物的核酸或其功能变体来改良植物的生长特性，其中所述的核酸是在植物茎干组织中特异性地表达的。
根据本发明优选的方面，DP的编码核酸或其功能变体的提高或增加的表达是可以预期的。在本领域中已经很好地证明了提高或增加基因或基因产物表达的方法，其包括，例如由合适的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以在多核苷酸非异源形式的合适位置(通常在上游)上导入分离的核酸，用作启动子或增强子元件，使DP编码核酸或其功能变体的表达上调。例如，通过突变、缺失和/或取代可体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或可以在合适的方向和距离本发明基因合适的距离将分离的启动子导入植物细胞，使得以控制该基因的表达。
根据本发明的方法，在茎干组织中特异性增加DP多肽的活性，并且优选这是由在茎干组织中特异性增加的DP编码核酸的表达介导的。本文所用的术语“茎干”包括植物的全部气生部分。典型的茎干组织包括，但不限于茎、枝条、叶、芽、花、生殖器官、种子和茎干衍生的结构如匍匐茎、球茎、鳞茎或块茎的组织。优选地，在本发明的方法中DP的编码基因是在幼生茎干组织中优先表达。
优选地，由有效连接于DP编码基因的茎干特异性启动子可获得DP编码基因的茎干特异性表达。因此，相对于对应的野生型植物，本发明优选的实施方案提供了改良植物生长特性的方法，其包括将在茎干组织中特异性表达的DP蛋白质的编码核酸导入植物。
本文定义的术语“茎干特异性启动子”指在茎干中至少5倍强于在其他植物器官(如根)的启动子，并且该启动子优先，但并非专有地在植物的气生部分表达。本文中可互换使用术语“组织特异性”启动子与“组织偏好的”启动子。备选地，可以通过选择性转化技术，如用于转化气生组织的弹道(ballistic)的使用来介导DP编码基因的茎干特异性表达。备选地，可以通过T-DNA标签获得茎干特异性表达，该技术对于本领域研究人员是众所周知的，并且包括在植物中随机地导入启动子和选择那些其中在茎干组织中DP表达特异性地增加的植物。
如果期望表达多肽，通常应该在多核苷酸编码区的3′末端包括聚腺苷酸化区域。聚腺苷酸化区域可以衍生自天然基因、多种其他植物基因或来自T-DNA。加入的3′末端序列可以衍生自，例如，胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或备选地来自另一植物基因，或来自任何其他真核生物基因。
还可以将内含子序列加至5′非翻译区或部分编码序列的编码序列，以增加在胞质中积聚的成熟信使的数量。已经显示，在植物和动物的表达构建体的转录单位中包括可剪接的内含子可在mRNA和蛋白质水平上同时增加高达1000倍的基因表达，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.84395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.11183-1200(1987)。通常当此类内含子被置于接近转录单位的5′末端时，其提高的基因表达最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域公知的；参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供了用于促进在本发明方法中有用的核酸序列的导入和/或表达的遗传构建体和载体。
因此，本发明的另一实施方案提供遗传构建体，其包括(a)DP的编码核酸或其功能变体；(b)能够在茎干组织中驱动(a)的核酸表达的一个或多个的转录控制序列；和任选地(c)转录终止序列。
可用于本发明方法的构建体可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建。遗传构建体可插入到载体中，该载体可以是商购的，适于转化到植物中，并适于在转化的细胞中维持和表达目标基因。优选地，本发明的遗传构建体是植物表达载体，其适于在植物细胞、组织、器官或整个植物中导入和/或维持和/或表达核酸。
本发明的遗传构建体的实例是SEQ ID NO 8表示的，并且在稻β扩展蛋白启动子控制下，之后为双转录终止序列的DP基因(见图2)。
本发明提供如上所述的遗传构建体，其中控制序列(b)是茎干组织优选的启动子，如β扩展蛋白启动子或具有与β扩展蛋白启动子同等表达谱的启动子。
根据(a)的核酸有利地是任何DP编码核酸，如上文所述的任何核酸。优选的核酸是SEQ ID NO 1、2、12、14、16、18、20或22表示的核酸或如上文所述它的功能变体，或是SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21或23表示的蛋白质或如上文所述其同源物的编码核酸。
在本发明的方法中还提供了上述构建体的用途。
植物用包含目标序列(即DP编码核酸或其功能变体)的载体转化。目标序列与一个或多个控制序列(至少与一个启动子)有效地连接，优选地连接于启动子。术语“启动子”指转录控制序列。启动子(b)在植物中可操作并且优选是植物衍生的。术语“转录控制序列”和“启动子”在文中可以互换使用，且指能对与它们有效连接的序列的表达起作用的调控核酸序列。上述术语涵盖来源于经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括精确转录起始所需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)的转录调控序列。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在这种情况下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。
本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以便启动子序列能启动目的基因的转录。优选地，将目标基因以正义方向有效连接于启动子。
有利地，本发明的方法可以使用任何具有茎干组织特异性表达模式的启动子。当与强的组成型启动子(如强的组成型/普遍存在的CaMV35S启动子)比较时，这些启动子在根中具有较低的表达水平。
这类启动子的一个实例是本文中SEQ ID NO 7表示的稻β扩展蛋白启动子EXPB9。可以从稻(日本栽培种)染色体10，BAC OSJNBa0082M15分离这一启动子，其中该启动子位于Genbank登录号AF261277表示的mRNA的编码EXPB9基因的上游。本文所用的术语“茎干特异性启动子”因此还意指具有相同或相似活性的启动子，如在稻中的稻β扩展蛋白启动子EXPB9。在本文中相似的活性意指比β扩展蛋白启动子EXPB9最多高或低20倍的活性，优选地最多高或低10倍，或高或低5倍，或高或低3倍的活性。
测量启动子强度的一个方法是通过使用启动子β葡糖醛酸酶融合。可以将该启动子融合到编码的β葡糖醛酸酶的埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)UidA基因，并转化进入植物。从植物材料提取蛋白质并且测定GUS活性(Jefferson等人，1987，EMBO J.20；6(13)3901-7)。继之按照提取蛋白质的每mg单位中的光密度计算启动子活性。
优选地，在植物的营养生长期间或在幼生茎干组织中表达茎干优先的启动子。因此，优选在萌发之后从组织中测量GUS活性。优选地，在植物的营养生长期间，例如在萌发之后2周，优选萌发之后4周进行这些测量。
茎干组织优先的启动子的另一实例是原叶绿素还原酶启动子。
任选地，遗传构建体还可以包括一个或多个终止子序列。术语“转录终止序列”包括位于转录单位末端的控制序列，其标志初级转录本的3′加工和聚腺苷酸化以及转录的终止。其他调控元件，如转录或翻译增强子，可以被引入遗传构建体中。本领域的那些技术人员将知道合适的终止子和增强子序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为附加型基因元件(如质粒或黏粒)维持的情况。优选的复制起点包括，但不限于f1起点和colE1。
遗传构建体任选地可包含选择标记基因。如本文所用，术语“选择性标记基因”包括赋予表达该基因细胞表型，以便于鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的新陈代谢性状或允许可视选择。选择标记基因的实例包括能赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视标记基因导致颜色的形成(例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、发光(如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
本发明还包括通过本发明的方法获得的植物。本发明因此提供了可通过本发明的方法获得的植物，该植物中已经导入了DP的编码核酸或如上定义的它的功能变体。
本发明还提供了产生具有改良的生长特性的转基因植物的方法，其包括在植物中导入和表达DP编码核酸或其功能变体。
因此，本发明提供的产生转基因植物的方法，其包括(a)将DP的编码核酸或其功能变体导入植物细胞，优选导入如上所述的遗传构建体；(b)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
DP编码核酸或其功能变体或遗传构建体定义如上。相对于对应的野生型植物，由上述方法产生的转基因植物具有改良的植物生长特性，这类生长特性是上述的任何生长特性。
优选通过转化将DP编码核酸或遗传构建体“导入”植物细胞中。本文所用的术语“转化”涵盖把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移的方法如何。能够随后无性繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用本发明的遗传构建体进行转化。组织的选择决定于被转化的特定的植物物种。例示性的靶组织包括叶盘(leaf disk)、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、胼胝体组织、已存在的分生组织(如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择地，它可以整合到宿主基因组中。优选地，将DP的编码核酸稳定地整合到植物细胞的基因组中，其可以通过，例如使用在被导入基因组的核酸侧翼具有T-DNA边界的植物转化载体或植物表达载体而获得。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，多种转化方法都可用于引入目的基因到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪颗粒轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，1987年6月，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA包被颗粒轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。产生本发明的转基因植物的优选方法是农杆菌属介导的转化方法。
优选使用任何通过农杆菌属介导的转化产生转基因稻的熟知方法，例如在任何以下文献中描述的方法公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，1996，199，612-617)、Chan等人(Plant Mol.Biol.1993，22(3)491-506)、Hiei等人(Plant J.1994，6(2)271-282)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996，14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002，129(1)13-22)中所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。
通常在转化之后，由与DP编码基因共转化的一种或多种的标记的存在选择植物细胞或细胞群。
可以随后经由本领域技术人员熟知的再生技术，使用产生的转化的植物细胞、细胞群或植物组织产生完整的转化植物。因此，在促进植物生长的条件下培养植物细胞可以包括选择和/或再生和/或生长至成熟的步骤。
DNA转移和再生之后，可评价推断转化植物中目标基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选择地或另外地，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。
产生的转化植物可通过各种方法进行繁殖，如通过无性繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精以产生纯合的第二代(或T2)转化株，而T2植物可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。
产生的转化生物体可以是各种形式的。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根茎被嫁接到未转化的接穗中)。
本发明还提供宿主细胞，其含有编码DP或其功能变体的分离的核酸分子或如上提到的遗传构建体。优选的宿主细胞是植物细胞。本发明还提供已经用DP编码基因或其功能变体或本发明的遗传构建体转化，并且包含其的植物细胞、组织、器官和整个植物，以及植物的部分和其无性繁殖体。本发明显然延及由上述任何方法可获得的植物。本发明延及特异性在茎干组织中具有增加的DP编码核酸的表达水平和/或增加的DP蛋白质的水平和/或活性的植物。本发明还包括原代转化细胞、组织、器官或整个植物或植物部分的后代，所述后代的唯一要求是与其衍生自的亲本植物呈现相同的基因型特性。相对于对应的野生型植物，根据本发明的植物具有改良的生长特性。本发明还延及根据本发明的植物的任何部分，优选地，可收获的部分，例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎培养物、茎、根状茎、根、块茎、球茎和棉纤维。
本发明还涉及在茎干优选的启动子控制下的编码DP蛋白质或其同源物的核酸用于改良任何一种或多种的上述生长特性的用途。
可以在育种程序中使用DP的编码核酸或其功能变体，或DP多肽或其同源物，其中可以鉴别遗传性连接于DP编码基因或其功能变体的DNA标记。可以使用DP编码基因或其功能变体，或DP蛋白质或其同源物定义分子标记。可以随后在育种程序中使用这一DNA或蛋白质标记来选择具有改变的生长特性的植物。DP的编码基因或其功能变体优选是SEQ IDNO 1、3、12、14、16、18、20或22中任一个代表的核酸。
还可以在标记辅助的育种程序中使用DP编码基因的等位变体或其功能变体。这类育种方案有时需要通过植物的诱变处理，在植物中引入等位基因变异，例如使用EMS诱变；备选地，该程序可以以天然起源的等位变体的采集开始。然后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。然后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是筛选步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性。一般通过监控含有所讨论序列的不同等位变体(例如，SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20或22中任一个的不同等位变体)的植物的生长特性来进行筛选。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外任选的步骤包括使已鉴定优良等位变体的植物与另一种植物杂交。例如，这可用于产生目标表型特征的组合。DP编码核酸还可用作探针，以对基因进行遗传和物理作图，这些基因是与之连锁的性状的一部分和标志。这些信息可用于植物育种，以开发具有所需表型的种系。DP编码核酸或其功能变体的这种应用，仅仅需要长度为至少15个核苷酸的核酸序列。DP编码核酸或其功能变体可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Maniatis)可使用DP编码核酸或其功能变体进行探测。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测Southern印迹，该Southern印迹含有代表亲本和明确的遗传杂交后代的一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA。记录到DNA多态性的分离，并用于计算DP编码核酸或其功能变体在前面使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
植物基因来源的探针的制备和在遗传作图中的用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。众多出版物描述过使用上面所述的方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系及其他的个体组可用于作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。
核酸探针也可用于物理作图(即，把序列置于物理图上；参见Hoheisel等人in Non mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。虽然目前的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几个到几百KB；参见Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。
许多用于遗传和物理作图的各种基于核酸扩增的方法可以使用所述DP编码核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 1195-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic AcidRes.183671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和制备引物对，以用于扩增反应或引物延伸反应。这类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在采用基于PCR遗传作图的方法中，可能有必要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
DP编码核酸或其功能变体，或DP多肽或其同源物也可用作生长调节剂。由于这些分子可用于改良植物的生长特性，它们也是有用的生长调节剂，如除草剂或生长刺激物。本发明因此提供了一种组合物，其包含DP编码核酸或其功能变体，或DP多肽或其同源物，连同合适的载体、稀释剂或赋形剂，用作生长调节剂。
根据本发明的方法产生如上所述的具有改良的生长特性的植物。这些改良的生长特性也可与其它经济学上有利的性状组合，如进一步增产性状、对各种胁迫的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。
本发明现在将参考以下附图进行描述，其中

图1显示了二元载体pEXP::AtDPb的图谱，用于在稻中表达处于稻β扩展蛋白启动子(带有内参PRO0061的β-EXPB9启动子)控制下的拟南芥DPb基因(内参CDS006)。AtDPb表达盒还包括T-玉米醇溶蛋白和T-rbcS-δGA双转录终止序列。这一表达盒被定位在胭脂碱Ti质粒的左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58)之间。在T-DNA中还有其他的选择性标记和筛选性标记，它们均在组成型启动子控制下，并后跟polyA或T-NOS转录终止序列。这一载体还包括用于细菌复制的复制起点(pBR322起点+bom)和用于细菌选择的选择性标记(Spe/SmeR)。
图2给出本申请中描述的序列的一些实例。SEQ ID NO 2还显示在DP蛋白质中特别保守的下划线区域。
图3显示具有SEQ ID NO 9(基序1)、10(基序2)和11(基序3)表示的保守共有DPb基序位置的DP蛋白质的比对。显示了AtDPb的DNA结合结构域和二聚化结构域。用虚线括号标明全部DP蛋白质通用的高度保守区的位置。使用CLUSTAL W(Higgins等人，(1994)Nucleic Acids Res.224673-4680)，以BLOSSUM 62矩阵和参数GAPOPEN 10、GAPEXT 0.05以及GAPDIST 8完成对整个序列的多序列比对。还提供序列的Genbank登录号。
图4显示对应于图3的多比对的分支进化树。使用Clustal W产生分支进化树。还提供序列的Genbank登录号。
图5显示DP蛋白质的系统发生图的图示。该系统发生图给出的分支长度和节点之间的距离与序列之间的进化距离成比例。该进化树图示由Clustal W产生。通过仅存在于DPb中的KKKK/RR基序的存在或缺失可以将两组DP蛋白质(DPa和DPb)彼此区分开。
实施例本发明现在将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。
DNA操作除非另外说明，否则重组DNA技术按照(Sambrook(2001)分子克隆实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约)或Ausubel等人(1994)、Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols的卷1和2中描述的标准方案进行。植物分子操作的标准材料和方法在R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)(BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)发表)中进行了描述。
实施例1拟南芥DPb的克隆使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，PCR扩增拟南芥DPb基因(内参CDS006)。对从幼苗提取的RNA进行反转录以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。cDNA文库的平均插入片段大小为1.5kb，而且菌落的原始数为1.59×107cfu。原始滴度确定为9.6×105cfu/ml，而且在第一轮扩增以后变成6×1011cfu/ml。菌落的质粒提取以后，200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR扩增的引物包含用于Gateway重组克隆(斜体)的AttB位点，其中prm0319的序列为5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGACAACTACTGGGTCTAATTCT 3′(SEQ ID NO 5)和prm0320的序列为5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAATTCTCCGGCTTCAT3′(SEQ ID NO 6)。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在标准条件下进行PCR。同样使用标准方法扩增和纯化期望长度的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步，BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”(entry clone)，p0424。作为Gateway技术部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。
实施例2载体构建((pEXP::AtDPb)继之在LR反应中使用进入克隆p0424和用于稻转化的指定载体p3169。该载体包含位于T-DNA边界内的以下部分作为功能性元件植物选择性标记；植物筛选标记；旨在与已克隆到进入克隆中的目标序列进行体内重组的LR的Gateway表达盒。用于目标基因茎干组织优选表达的稻β扩展蛋白启动子(内参PRO061)位于这一Gateway盒的上游。在LR重组步骤之后，将产生的表达载体pEXP::AtDPb(图1)转化进入农杆菌属菌株LBA4044，其随后被转化到稻植株中。使转化的稻植株生长，然后检验实施例3中所述的多种生长特性。
实施例3用pEXP::AtDPb转化的T0、T1和T2稻植物的评估产生大约15到20个独立的T0转化株。将原代转化体从组织培养箱转移到温室生长并收获T1种子。6个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。“无效植物”或“无效分离体”或“无效合子”是与转基因植物以相同方式处理的植物，但是转基因已经从其分离。还可以将无效植物描述为纯合的阴性转化体。对于每一个这些事件，通过PCR选择大约10个含有转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10个缺少转基因的T1幼苗(无效合子)。
基于T1评估的结果，选择在T1水平上显示改良的生长特性的三个事件用于在T2中的进一步鉴定和更多的个体。通过检测标记表达筛选来自阳性T1植物(杂合子和纯合子都有)的种子组。对于每个选择的事件，随即选择杂合子种子组用于T2评估。在每个种子组中移植相同数目的阳性和阴性种子于温室中用于评估(即，对于每个事件，生长40个植物，其中20个是转基因阳性和20个是转基因阴性)。因此，对于三个事件，在T2代总共评估120个植物。
转移T1和T2植物至温室，并如下所述地评估其营养生长参数。
(I)数据的统计分析使用为不均衡设计校正的双因子ANOVA(方差分析)作为所观察的植物表型特性数值的统计评估模型。提交数值至t检验或F检验。通过比较t值与t分布，或备选地通过比较F值与F分布获得p值。p值代表无效假定的可能性(无效假定是“没有转基因的影响”)是正确的。
对一事件的全部植物的全部值进行t-检验。对于每一事件和每一生长特性重复这类t检验。进行t检验以检查在一个转化事件内的基因作用，本文中又被称为“线性特异性作用”。在t检验中，设定显著线性特异性作用的域值在10％de概率水平。因此，t检验的p值低于10％的数据意味着在基因存在产生的株系的转基因植物中观察到表型。在转化事件的一个群体之内，一些事件可以低于这一域值。这一差异可能是由于转基因在基因组中的位置不同。基因可能仅在基因组的某些位置上具有作用是常见的。因此，上述“线性特异性作用”也被称为“位置依赖的作用”。
在所有事件的全部植物测量的全部值进行F检验。对于每个生长特性重复F检验。进行F测验以检查基因对所有转化事件的作用，并检验基因的总效应，亦称之为“基因作用”。显著性整体基因效应的显著性域值设置为5％概率水平。因此，F检验的p值低于5％的数据意指非正确的基因存在和/或基因组中转基因位置产生的观察到的表型。“基因作用”是转基因植物中基因的广泛适用性的指标。
(II)营养生长测量选择的植物在温室生长。每种植物获得独特的barcode标签以明确地联系表型数据和对应的植物。选择的植物生长在10cm直径盆中的土壤中，生长环境设置如下光周期＝11.5小时，日光强度＝30000勒克斯或更高，日间温度＝28℃或更高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和对应的无效合子并排生长在随机的位置。从播种阶段直至成熟阶段(该阶段是没有生物量增加的阶段)，植物每周通过数字成像机。在每个时间点从至少6个不同角度对每个植物拍摄数字图像(2048×1536象素，16百万色)。下述参数是使用图像分析软件以自动化的方式从数字图像获得。
地上面积植物地上面积通过计数排除背景后地上植物部分的像素总数测定。这个值为在同一时间点从不同角度拍摄的图像的平均数，并通过校准将其转化为以平方毫米表达的物理表面值。实验显示，这种方式测定的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。
平均起来，T1代的pEXP::DPb转基因植物显示地上面积的8％增加以及F检验中0.08的p值。三个最佳阳性T1株系中的一个显示地上面积的30％增加和t检验的0.01的p值。在T2代中，这一株系显示地上面积的18％增加和t检验的0.03的p值。
实施例4由β扩展蛋白启动子驱动的GUS表达使用“BP重组反应”将β扩展蛋白启动子克隆入GatewayTM系统(Life Technologies)的pDONR201进入质粒。通过测序确定克隆的插入片段的同一性和碱基对组成，并且还经由限制性消化检验产生的质粒。
为了将启动子克隆在报告基因之前，随即在“LR重组反应”(GatewayTM)中使用每个进入克隆和指定载体。对这一指定载体通过在GUS基因前的Gateway重组盒的置换的设计，将启动子有效连接到埃希氏大肠杆菌β葡糖醛酸酶(GUS)基因上。继之将产生的含有有效连接于GUS启动子的报告载体转化入农杆菌菌株LBA4044，并且随后使用标准转化技术进入稻植物。
从转化的细胞产生转基因稻植物。植物在正常条件下生长。
使用90％冰冷的丙酮覆盖植物或植物的部分，并在4℃孵育30分钟。使用Tris缓冲液[在1升双蒸水中的15.76g Trizma HCl(Sigma T3253)和2.922g NaCl，用NaOH调节pH到7.0]洗涤3次，每次5分钟后，所述材料使用Tris/铁氰酸盐(ferricyanate)/X-Gluc溶液[10ml Tris缓冲液中的9.8ml Tris缓冲液和0.2ml铁氰酸盐母液(0.33g铁氰化钾(Sigma P3667))+500μl DMSO中的0.2ml X-Gluc母液(26.1mg X-Gluc(EuropaBioproducts ML 113A))]覆盖。真空过滤15到30分钟。37℃下孵育植物或植物的部分16小时直至可见蓝色显影。用Tris缓冲液洗涤样品3次，共5分钟。以50％、70％和90％乙醇(每种30分钟)连续提取叶绿素。
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<110>克罗普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生长特性的植物及其制备方法<130>CD-113-PCT<150>EP 04102392.0<151>2004-05-28<150>US 60/576,250<151>2004-06-02<160>23<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1158<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgacaacta ctgggtctaa ttctaatcac aaccaccatg aaagcaataa taacaacaat 60aaccctagta ctaggtcttg gggcacggcg gtttcaggtc aatctgtgtc tactagcggc120agtatgggct ctccgtcgag ccggagtgag caaaccatca ccgttgttac atctactagc180gacactactt ttcaacgcct gaataatttg gacattcaag gtgatgatgc tggttctcaa240ggagcttctg gtgttaagaa gaagaagagg ggacagcgtg cggctggtcc agataagact300ggaagaggac tacgtcaatt tagtatgaaa gtttgtgaaa aggtggaaag caaaggaagg360acaacttaca atgaggttgc agacgagctt gttgctgaat ttgcacttcc aaataacgat420ggaacatccc ctgatcagca acagtatgat gagaaaaaca taagacgaag agtatatgat480gctttaaacg tcctcatggc tatggatata atatccaagg ataaaaaaga aattcaatgg540agaggtcttc ctcggacaag cttaagcgac attgaagaat taaagaacga acgactctca600cttaggaaca gaattgagaa gaaaactgca tattcccaag aactggaaga acaatatgta660ggccttcaga atctgataca gagaaatgag cacttatata gctcaggaaa tgctcccagt720ggcggtgttg ctcttccttt tatccttgtc cagactcgtc ctcacgcaac agtagaagtg780gagatatcag aagatatgca gctcgtgcat tttgatttca acagcactcc atttgagctc840
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Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala Thr Val Glu Val275 280 285Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp Phe Asn Ser Thr290 295 300Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Asn Phe Val Leu Lys Thr Met Lys Phe305 310 315 320Cys Asp Gln Pro Pro Gln Gln Pro Asn Gly Arg Asn Asn Ser Gln Leu325 330 335Val Cys His Asn Phe Thr Pro Glu Asn Pro Asn Lys Gly Pro Ser Thr340 345 350Gly Pro Thr Pro Gln Leu Asp Met Tyr Glu Thr His Leu Gln Ser Gln355 360 365Gln His Gln Gln His Set Gln Leu Gln Ile Ile Pro Met Pro Glu Thr370 375 380Asn Asn Val Thr Ser Ser Ala Asp Thr Ala Pro Val Lys Ser Pro Ser385 390 395 400Leu Pro Gly Ile Met Asn Ser Ser Met Lys Pro Glu Asn405 410<210>5<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物正向引物<400>5ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgaca actactgggt ctaattct58<210>6<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物反向引物<400>6ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caattctccg gcttcat47<210>7<21l>1243<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)<400>7aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa 780cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa1020gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc1080ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ccacccgcgc cctcacctcg1140ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa1200aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg aca 1243<210>8<211>3077<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>表达盒
<400>8aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa 780cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa1020gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc1080ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ceacccgcgc cctcacctcg1140ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa1200aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg acaatttaaa tcaactaggg1260atatcacaag tttgtacaaa aaagcaggct tcacaatgac aactactggg tctaattcta1320atcacaacca ccatgaaagc aataataaca acaataaccc tagtactagg tcttggggca1380cggcggtttc aggtcaatct gtgtctacta gcggcagtat gggctctccg tcgagccgga1440gtgagcaaac catcaccgtt gttacatcta ctagcgaeac tacttttcaa cgcctgaata1500
atttggacat tcaaggtgat gatgctggtt ctcaaggagc ttctggtgtt aagaagaaga1560agaggggaca gcgtgcggct ggtccagata agactggaag aggactacgt caatttagta1620tgaaaggtct tatctctttc tctgccccta ttatgctttc atctaaatgc ctttcaattt1680gtgaaaaggt ggaaagcaaa ggaaggacaa cttacaatga ggttgcagac gagcttgttg1740ctgaatttgc acttccaaat aacgatggaa catcccctga tcagcaacag tatgatgaga1800aaaacataag acgaagagta tatgatgctt taaacgtcct catggctatg gatataatat1860ccaaggataa aaaagaaatt caatggagag gtcttcctcg gacaagctta agcgacattg1920aagaattaaa gaacgaacga ctctcactta ggaacagaat tgagaagaaa actgcatatt1980cccaagaact ggaagaacaa gtaatgaaca tcatcgatac tctcggctta tctgcttcct2040gccttcagaa tctgatacag agaaatgagc acttatatag ctcaggaaat gctcccagtg2100gcggtgttgc tcttcctttt atccttgtcc agactcgtcc tcacgcaaca gtagaagtgg2160agatatcaga agatatgcag ctcgtgcatt ttgatttcaa cagcactcca tttgagctcc2220acgacgacaa ttttgtcctc aagactatga agttttgtga tcaaccgccg caacaaccaa2280acggtcggaa caacagccag ctggtttgtc acaatttcac gccagaaaac cctaacaaag2340gccccagcac aggtccaaca ccgcagctgg atatgtacga gactcatctt caatcgcaac2400aacatcagca gcattctcag ctacaaatca ttcctatgcc tgagactaac aacgttactt2460ccagcgctga tactgctcca gtgaaatccc cgtctcttcc agggataatg aactccagca2520tgaagccgga gaattgaacc cagctttctt gtacaaagtg gtgatatcac aagcccgggc2580ggtcttctag ggataacagg gtaattatat ccctctagat cacaagcccg ggcggtcttc2640taegatgatt gagtaataat gtgtcacgca tcaccatggg tggcagtgtc agtgtgagca2700atgacctgaa tgaacaattg aaatgaaaag aaaaaaagta ctccatctgt tccaaattaa2760aattcatttt aaccttttaa taggtttata caataattga tatatgtttt ctgtatatgt2820ctaatttgtt atcatccggg cggtcttcta gggataacag ggtaattata tccctctaga2880caacacacaa caaataagag aaaaaacaaa taatattaat ttgagaatga acaaaaggac2940catatcattc attaactctt ctccatccat ttccatttca cagttcgata gcgaaaaccg3000aataaaaaac acagtaaatt acaagcacaa caaatggtac aagaaaaaca gttttcccaa3060
tgccataata ctcgaac 3077<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Dpb基序1<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>Xaa不能天然产生的氨基酸<400>9Leu Asp Ile Xaa Xaa Asp Asp Ala1 5<210>10<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Dpb基序2<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa可以是Arg或Lys<400>10Lys Lys Lys Xaa Arg1 5<210>11<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Dpb基序3<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa不能天然产生的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>Xaa不能天然产生的氨基酸<400>11Ala Xaa Gly Xaa Asp Lys1 5<210>12<211>1550<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<400>12gctccatttt gccccctcgc tcttcacttc ctccgctccg cttgttgtct ccttccctag 60ggtttgtcca gctccgcgct cagcctcgct cgctagctcc cgctctcctc gatcccgcgg 120ccccgatcag cgcgatctcc gcgcggccat ggtctccggc gcggcgcaca acccgggcgg 180gggcgccgcc gcccagacca cccagcgctc gccgccgcag ctgggggccc ggacggccct 240cgccacgccg ccgccggtct ccgggcgsgc cgcgcactcc gcgtctacta gcggcggcac 300cgctggttca ccaccgtcca gccgcagcga gcagcacgcc cccgacggtg ctgtcaaggg 360tcccgccctc gcgcgctgcg cccgcagcgg cggcggcggc gtccacgccc gccagcgaca 420gcacgttcct ccgcttgaac tcgacatcaa csgcgacgac gcgccgtcgt cgcaggctcc 480cacgagcaag aagaaaagga gaagcacacg ggcagtgggt cctgataaag gtaaccgggg 540actgcgccag tttagtatga aagtttgtga gaaagttgaa agtaaaggga gaacaacata 600taatgaggtg gcagatgaac ttgttgctga gtttacagac cccaataata atattgaggc 660accagaccct gataacccta atgcgcaaca atatgatgaa aaaaatattc gacgaagagt 720ttatgatgct ttaaatgttc tgatggctat ggacattata tctaaagata aaaaggagat 780ccagtggaag ggcttgccgc ggactagtat aagtgatatt gaagaattga agactgagct 840tgtgggactg aaaggtagaa ttgagaagaa aagtgtttac ttacaggagc tacaagatca 900atatgtaggt ttgcaaaacc tgattcaacg aaatgagcaa ctatatggtt caggaaacac 960accttctggt ggagtggctt tgccattcat cctagtccag acccgacctc atgcaaccgt1020ggaagttgag atatcagaag atatgcagct ggttcatttt gacttcaata gcactccatt1080tgagctgcat gatgactcat atgtcctaaa agaaatgcgg ttctgtggaa gagaacaaca1140
tgatggaact caagagtcga tatcaaatgg aggtgagagt tcaaacgtgt caaatattta 1200ttggcaacaa gcacagcata tggagatgcc aaacaatggc acagttaggt tatcaagctc 1260accgcctatt ccagggatat taaaagggcg tgtgaagcac gagcactagc gcttcggttt 1320tggtttcact ggcgttgtcg tctgagagca gtttgtttta ttacttttct ccgttgtgta 1380aagcgcctgt aaattattag gcaaggggga gggtagtagc tctgatctga tttasctctg 1440attggtagaa cgacgggtgt aattctatat ccttgattcg gttctttcgg tatggttgag 1500aaaagggttg acatgtaatt tgtrgrgcat tataaaaact aaaattgttg 1550<210>13<211>386<212>PRT<213>玉米<220>
<221>misc_feature<222>(40)..(40)<223>Xaa不能天然产生的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(102)..(102)<223>Xaa不能天然产生的氨基酸<400>13Met Val Ser Gly Ala Ala His Asn Pro Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gln1 5 10 15Thr Thr Gln Arg Ser Pro Pro Gln Leu Gly Ala Arg Thr Ala Leu Ala20 25 30Thr Pro Pro Pro Val Ser Gly Xaa Ala Ala His Ser Ala Ser Thr Ser35 40 45Gly Gly Thr Ala Gly Ser Pro Pro Ser Ser Arg Ser Glu Gln His Ala50 55 60Pro Asp Gly Ala Val Lys Gly Pro Ala Leu Ala Arg Cys Ala Arg Ser65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Val His Ala Arg Gln Arg Gln His Val Pro Pro Leu85 90 95Glu Leu Asp Ile Asn Xaa Asp Asp Ala Pro Ser Ser Gln Ala Pro Thr100 105 110
Ser Lys Lys Lys Arg Arg Ser Thr Arg Ala Val Gly Pro Asp Lys Gly115 120 125Asn Arg Gly Leu Arg Gln Phe Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu130 135 140Ser Lys Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala145 150 155 160Glu Phe Thr Asp Pro Asn Asn Asn Ile Glu Ala Pro Asp Pro Asp Asn165 170 175Pro Asn Ala Gln Gln Tyr Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr180 185 190Asp Ala Leu Asn Val Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys195 200 205Lys Glu Ile Gln Trp Lys Gly Leu Pro Arg Thr Ser Ile Ser Asp Ile210 215 220Glu Glu Leu Lys Thr Glu Leu Val Gly Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys225 230 235 240Lys Ser Val Tyr Leu Gln Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Val Gly Leu Gln245 250 255Asn Leu Ile Gln Arg Asn Glu Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Thr Pro260 265 270Ser Gly Gly Val Ala Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His275 280 285Ala Thr Val Glu Val Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe290 295 300Asp Phe Asn Ser Thr Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Ser Tyr Val Leu305 310 315 320Lys Glu Met Arg Phe Cys Gly Arg Glu Gln His Asp Gly Thr Gln Glu325 330 335Ser Ile Ser Asn Gly Gly Glu Ser Ser Asn Val Ser Asn Ile Tyr Trp340 345 350Gln Gln Ala Gln His Met Glu Met Pro Asn Asn Gly Thr Val Arg Leu355 360 365Ser Ser Ser Pro Pro Ile Pro Gly Ile Leu Lys Gly Arg Val Lys His370 375 380
Glu His385<210>14<211>1306<212>DNA<213>稻<220>
<221>misc_feature<222>(654)..(654)<223>n是a、c、g或t<400>14ccctccatcc atccatcccc cacctccgct ctctagggtt tctcccccgc ctcctccccc 60ccaatctcgc cgccgcgatg gtctccggcg cggcgcattc ggcctccacc agtggcggcg 120gcggggggag cgagggctcc cccaccggcc gcgccgcgcc gggcatgcag ggcggcggca 180gcgccgccac gcccgccgcc tcggcctccg cgtccacgcc ggccagcgag accaccgtcg 240cccgccgcct cgacggcctc gacatccagg gcgacgacgc gccctcgtcg cagcccgcca 300cgagcaagaa gaaaaaaagg gggacacgtg caacgggccc tgacaagggt ggccgtggat 360tgcgccaatt tagtatgaaa gtttgtgaga aagttgaaag caaagggaga acaacctaca 420acgaggtggc agatgagctt gtagctgagt ttgcagaccc caacaataat tttgcatcac 480ctgatcctga caaccctaac acaccacaat ttgatgagaa aaatatacga cgaagggttt 540atgatgcatt gaatgtcctg atggctatgg atattatatc taaggataaa aaggaaattc 600agtggaaggg cttgcctcgg acaagtatga gcgatgttga agaattgaag gttnagatca 660tcggactgaa aggtaggatc gacaagaaaa atgcatattt gcaggagtta gaagatcaat 720atgtaggttt gcaaaacctg attcaacgaa acgagcagct ttatggttca ggaaatgctc 780cttcaggagg agtggcattg ccatttatcc tagttcagac acgtcctcat gctacagtag 840aagtggagat atcagaagat atgcagctgg tgcattttga tttcaatagc actccatttg 900aactgcatga cgattccttt gtactgaaag cattggggtt ctctggcaaa gaaccagatg 960atacgcaagc ctgggttgga aatggaggtg agtgctcaac cacacctatc tatcatcaat1020caccccaagt tgcgaggcca aacggagtta gactaccaac atcgccccct attcccggta1080tacttaaagg gcgtgtcaag catgaacatt aggggttact atgatttgtt gatggtgtga1140
ggtacttggt ttatttgtta ctccccaatt ttcccttttt gtaactttac atgtagaaag 1200agcctgtaca ttagatcaat gggggaaaaa tggcgggtct agtttagttt cactggtaga 1260agatcgatgg gcatgttgac aaaccatatg cctaacttaa cttgta 1306<210>15<211>344<212>PRT<213>稻<220>
<221>misc_feature<222>(193)..(193)<223>Xaa不能天然产生的氨基酸<400>15Met Val Ser Gly Ala Ala His Ser Ala Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Set Glu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Ala Ala Pro Gly Met Gln Gly20 25 30Gly Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Pro35 40 45Ala Ser Glu Thr Thr Val Ala Arg Arg Leu Asp Gly Leu Asp Ile Gln50 55 60Gly Asp Asp Ala Pro Set Ser Gln Pro Ala Thr Ser Lys Lys Lys Lys65 70 75 80Arg Gly Thr Arg Ala Thr Gly Pro Asp Lys Gly Gly Arg Gly Leu Arg85 90 95Gln Phe Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu Ser Lys Gly Arg Thr100 105 110Thr Tyr Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala Glu Phe Ala Asp Pro115 120 125Asn Asn Asn Phe Ala Ser Pro Asp Pro Asp Asn Pro Asn Thr Pro Gln130 135 140Phe Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr Asp Ala Leu Asn Val145 150 155 160Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys Lys Glu Ile Gln Trp165 170 175Lys Gly Leu Pro Arg Thr Ser Met Ser Asp Val Glu Glu Leu Lys Val180 185 190
Xaa Ile Ile Gly Leu Lys Gly Arg Ile Asp Lys Lys Asn Ala Tyr Leu195 200 205Gln Glu Leu Glu Asp Gln Tyr Val Gly Leu Gln Asn Leu Ile Gln Arg210 215 220Asn Glu Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Ala Pro Ser Gly Gly Val Ala225 230 235 240Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala Thr Val Glu Val245 250 255Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp Phe Asn Ser Thr260 265 270Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Ser Phe Val Leu Lys Ala Leu Gly Phe275 280 285Ser Gly Lys Glu Pro Asp Asp Thr Gln Ala Trp Val Gly Asn Gly Gly290 295 300Glu Cys Ser Thr Thr Pro Ile Tyr His Gln Ser Pro Gln Val Ala Arg305 310 315 320Pro Asn Gly Val Arg Leu Pro Thr Ser Pro Pro Ile Pro Gly Ile Leu325 330 335Lys Gly Arg Val Lys His Glu His340<210>16<211>1140<212>DNA<213>稻<400>16atggtctccg gcgtcgccca ccgcccggac gacgacggcg ggcgcgccgc ctcgacgttc 60cagcgcccgc cgcagccggc cggcgcgcgg ccgtccctgg ccacgccgcc gccctcgggc120ggagcgcaat ccgcttcgac gagcggcggg agcgcgggct ccccgtccag ccgcagcgag180cagcatgtcc ccgcagccgc aggcatggcg gcgggggcgg cggcggcctc tactccgatt240agtgagaata ccttcctccg cctcaacgac cttgacatcc acggcgacga tgcgccttcc300tcacaggctc caacgagcaa gaagaagaag agaggagcac gagcagttgg tcctgacaaa360ggtggcaggg ggctgcgcca gtttagtatg aaggtttgtg agaaagttga aagtaaaggg420agaacaacat acaacgaggt ggcagatgaa cttgttgccg aatttgcaga tcccaataac480
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权利要求
1.相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括在植物茎干组织中特异性增加DP多肽或其同源物的活性，和/或增加植物茎干组织中DP编码基因或其功能变体的表达，以及任选选择具有改良生长特性的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中优选在编码DP多肽或其同源物的基因座上引入遗传修饰来实现所述增加活性和/或增加表达。
3.根据权利要求2的方法，其中通过定点诱变、定向进化、同源重组、TILLING、T-DNA激活中的任一种或多种，以及通过将编码DP多肽或其同源物的DP编码核酸或其功能变体导入植物来实现所述遗传修饰。
4.相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括将DP编码核酸或其功能变体导入植物，并在茎干组织中特异性表达。
5.根据权利要求4的方法，其中所述功能变体是部分DP编码核酸，或者能够与DP编码核酸杂交的序列，其中所述功能变体编码的多肽具有(i)属于部分，或优选属于整个二聚化结构域的二聚化活性；和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。
6.根据权利要求1到5中任一项的方法，其中所述DP编码核酸或其功能变体，或DP多肽或其同源物是植物来源的，优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，进一步优选来自拟南芥。
7.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中所述DP编码核酸是(i)包括SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20或22，或其中任一个序列的功能变体的核酸，其中所述核酸或功能变体编码的多肽包含(i)属于部分，或优选属于整个二聚化结构域的二聚化活性；和(ii)结合DNA的DNA结合结构域；或(ii)编码SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21或23代表的蛋白质，或编码其中任一个序列的同源物的核酸，其中所述蛋白质或同源物包含(i)属于部分，或优选属于整个二聚化结构域的二聚化活性；和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。
8.根据权利要求4到7中任一项的方法，其中所述核酸或其功能变体在启动子的控制下，能够在茎干组织中特异性表达所述DP编码核酸。
9.根据权利要求8的方法，其中所述启动子具有与β扩展蛋白启动子相当的表达谱。
10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中相对于对应的野生型植物，所述改良的植物生长特性是增加的生物量。
11.根据权利要求1到10中任一项的方法，其中相对于对应的野生型植物，所述改良的植物生长特性是增加的产量，特别是增加的种子产量。
12.根据权利要求1到11中任一项的方法，其中相对于对应的野生型植物，所述改良的植物生长特性是增加的生长速率。
13.根据权利要求1到12中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是改变的构造，特别是分蘖或对应植物部分的增加的数量、尺寸、形状中的一个或多个；枝条和/或叶的增加的量。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
15.根据权利要求1到14中任一项的方法获得的植物。
16.遗传构建体，其包括(a)DP编码核酸或其功能变体；(b)能够在茎干组织中驱动核酸(a)表达的一个或多个转录控制序列；及任选的(c)转录终止序列。
17.根据权利要求13的遗传构建体，其中所述控制序列能够在幼生茎干组织中特异性表达所述DP编码核酸。
18.根据权利要求16或17的遗传构建体，其中所述控制序列是具有与β扩展蛋白启动子相当的表达谱的启动子。
19.转基因宿主细胞，其包含权利要求16到18中任一项所定义的遗传构建体。
20.转基因植物或植物的部分，其包含权利要求16到18中任一项所定义的遗传构建体。
21.相对于对应的野生型植物，产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，所述方法包括(a)将根据权利要求16到18中任一项的遗传构建体导入植物细胞；(b)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
22.相对于对应的野生型植物，具有改良生长特性的转基因植物，所述改良生长特性由导入所述植物的，在茎干特异性启动子控制下的DP编码核酸或其功能变体产生。
23.根据权利要求15、19、20或22的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗或谷类，如稻、小麦、大麦、玉米、粟、黑麦、燕麦或高梁。
24.权利要求15、19、20、22和23中任一项所定义的植物的部分，优选可收获部分，例如植物的种子或无性繁殖体。
25.权利要求15、19、20、22、23和24所定义的植物的后代，其中所述后代与其来源的亲本植物呈现一种或多种相同的基因型特性。
26.直接来源于权利要求15、19、20、22、23到25中任一项所定义的植物或后代的产物。
27.在茎干特异性启动子控制下，DP编码核酸或其功能变体用于改良植物生长特性的用途，所述植物生长特性选自以下一种或多种增加植物生物量、增加产量、增加种子产量、改变植物构造和增加生长速率。
全文摘要
本发明涉及通过增加茎干组织中DP蛋白质的活性或通过增加植物茎干组织中DP编码基因的表达来改良植物生长特性的方法。本发明还涉及由本发明方法产生的，具有改良生长特性的转基因植物。
文档编号C12N15/82GK1993039SQ200580025230
公开日2007年7月4日 申请日期2005年5月30日 优先权日2004年5月28日
发明者V·弗兰卡德, C·鲁兹 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司