利用调节剂生产生物聚合物的组合物和方法

专利名称：利用调节剂生产生物聚合物的组合物和方法
技术领域：
本发明总的涉及外多糖(exopolysaccharide)的生产，更具体而言，涉及能够调节外多糖生产的核酸序列及其变体，以及涉及利用所述核酸序列生成超生产粘液形式的外多糖的细菌。
背景技术：
在工业应用和食品工业中，对便宜和环境可接受的胶凝剂的需求日益增长。胶凝剂的一些示例性工业应用包括油田钻孔，粘合剂，颜料，动物饲料，生活用品，个人护理产品(例如，香波，护肤液)，口腔护理产品(例如，牙膏)，药物等。胶凝剂在食品工业中的一些示例性用途包括布丁，乳制品，饼馅，调味品，糖果，沙司，糖浆等。通过增加各种商用可接受的细菌性外多糖产品的可用性，生物工程工业已对胶凝剂的需求作出反应。
细菌性外多糖由于其独特的流变性质(例如，剪切抗性，与多种离子化合物的相容性，对极端温度，pH和盐浓度的稳定性)，是作为胶凝剂或粘度增加剂的有用化合物。多种细菌生产的外多糖尤其可用作增稠剂或胶凝剂。例如，生产许多类型外多糖的细菌属为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)。一些这种多糖包括结冷胶(gellan)，文莱胶(welan)，鼠李糖胶(rhamsan)，S-7和S-88(参见，例如，Pollock，J.Gen.Microbiol.1391939，1993)。由鞘氨醇单胞菌生产的外多糖称作“鞘氨醇胶(sphingans)”，并且至少三种鞘氨醇胶(结冷胶，文莱胶和鼠李糖胶)通过大规模深层发酵而商业化生产。
许多细菌性外多糖产品对合成产生的材料提供一系列具有吸引力的改善，但是由于所需产品的回收和纯化相关的成本，它们的生产保持相对昂贵。此外，顾及外多糖的较高发酵产量的条件也导致发酵液粘度增加，这种增稠最终需要更高的能量输入以有效分散氧和营养，使得细菌在发酵液中有效生长。即，提供较高外多糖产量的发酵同时导致相应更高生产成本。
因此，需要更好地了解外多糖的细菌生物合成，以帮助鉴定生产更多外多糖的细菌，以及鉴定以不会增加发酵液粘度的形式生产外多糖的细菌。此外，需要制备或鉴定这种细菌的方法，这些方法又使得在典型工业发酵条件下优化外多糖产量和收率。本发明满足了这些要求，并进一步提供其他相关优点。

发明内容
本发明总的涉及能够调节外多糖生产的核酸序列及其变体，以及涉及利用所述核酸序列生成超生产粘液形式的外多糖的细菌的方法。
在一方面，本发明提供分离的核酸分子，其包含的序列在高度严格条件下保持与探针杂交，其中探针由SEQ ID NO1或其互补序列组成。在一个实施方案中，前述分离的核酸分子中，所述核酸分子编码至少一种能够在鞘氨醇单胞菌种中改变外多糖生产的多肽。在相关的实施方案中，所述至少一种编码的多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO2具有至少80％同一性，或所述编码的多肽包含带有保守性氨基酸替换的氨基酸序列SEQ ID NO2，或所述多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO2，或所述多肽由氨基酸序列SEQ ID NO2组成。在另一实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO1的互补序列。在其他实施方案中，任何前述核酸分子为DNA或RNA。
在另一实施方案中，本发明提供重组表达载体，其包含至少一种可操作连接至任一前述核酸分子的启动子。在另一实施方案中，所述重组表达载体以融合蛋白表达调节多肽，所述融合蛋白包含被第二核酸序列编码的多肽产物，诸如标志或酶。在某些实施方案中，重组表达载体具有被调节的启动子。在其他实施方案中，重组表达载体为质粒。在另一实施方案中，重组表达载体为质粒X026或质粒X029(ATCCPTA-5127，保藏日2003年4月4日)。在一个实施方案中，重组表达载体包含至少一种可操作连接至核酸分子的启动子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一实施方案中，本发明涉及包含任一前述重组表达载体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为原核生物细胞，诸如生产鞘氨醇胶的细菌，或鞘氨醇单胞菌细胞，或生产鞘氨醇胶的鞘氨醇单胞菌细菌。在其他实施方案中，所述宿主细胞为能够生产诸如结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198和NW11等鞘氨醇胶的鞘氨醇单胞菌细菌。在其他实施方案中，所述宿主细胞生产荚膜形式或粘液形式的鞘氨醇胶。在某些实施方案中，所述宿主细胞为鞘氨醇单胞菌株α252(ATCC PTA-5128，Welam Slime，2003年4月4日)，X287(ATCC PTA-3487，结冷胶粘液，2001年6月28日)，X530(ATCC PTA-3486，2001年6月28日)，Z473(ATCC PTA-3485，2001年6月28日)，X031(ATCC PTA-3488，2001年6月28日)，或α27。在相关实施方案中，所述宿主细胞为生产黄原胶的细菌，诸如黄单胞菌(Xanthomonas)细菌和更具体而言为黄单胞菌株X59(ATCC 55298，1992年2月18日)，X55(ATCC 13951)，α287，α300或α301。在某些实施方案中，从重组表达载体上的核酸表达的多肽或融合蛋白改变外多糖在宿主细胞中的生产水平。
在另一方面，本发明提供分离的细菌，其生产外多糖，包括即使在表达被任一前述核酸分子编码的多肽时，仍能够生产粘液形式的外多糖的细菌，以及其中所述细菌为任一前述细菌，包括鞘氨醇单胞菌株α027的突变体，或黄单胞菌株α287，α300，或α301的突变体。在其他实施方案中，在表达至少一种被任一前述核酸分子编码的多肽时，生产粘液形式的外多糖的细菌为菌株α062(ATCC PTA-4426，2002年6月4日)，α063，α065，或α069或黄单胞菌株α449(ATCC PTA-5064，2003年3月19日)，α485，或α525。在其他实施方案中，本发明提供分离的细菌，选自鞘氨醇单胞菌株α062(ATCC PTA-4426)，α063，α065，或α069及其突变体或衍生物，和这类细菌的混合物，其中所述细菌即使在表达至少一种被任一前述核酸分子编码的多肽时，仍能够生产粘液形式的外多糖。在其他实施方案中，本发明提供分离的细菌，选自黄单胞菌株α449(ATCC PTA-5064)，α485，或α525，及其突变体或衍生物，和这类细菌的混合物，其中所述细菌即使在表达至少一种被任一前述核酸分子编码的多肽时，仍能够生产粘液形式的外多糖。
在本发明的另一方面，提供超生产外多糖的方法，包括在足以允许外多糖生产的条件和时间下培养细菌，其中所述细菌在表达至少一种被任一前述核酸分子编码的多肽时，超生产粘液形式的外多糖；以及从这种培养物中分离粘液形式的外多糖。在某些实施方案中，所述细菌为鞘氨醇单胞菌细菌，诸如那些能够超生产选自结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，和NW11的外多糖的细菌，包括鞘氨醇单胞菌株α062(ATCC PTA-4426)，α063，α065，或α069。在某些其他实施方案中，所述细菌为黄单胞菌细菌，诸如那些超生产黄原胶的细菌，包括黄单胞菌株α449(ATCC PTA-5064)，α485，或α525。本发明还提供任一前述方法，其中培养包括发酵，或其中所述细菌生产每升培养物约20g-约60g外多糖。在一些实施方案中，在约25℃-约35℃的温度下发酵约48小时-约96小时。在其他实施方案中，本发明提供任一前述方法，其中从细菌分离外多糖的方法为醇沉淀，诸如向培养物中加入约1-约1.5培养物体积的醇。在其他实施方案中，发酵培养物的粘度为约15,000cp-约40,000cp。
转向另一方面，本发明提供能够超生产粘液形式的外多糖的细菌的制备方法，包括将抑制生产粘液形式的外多糖的细菌与诱变剂接触，其中所述细菌(i)含有重组表达载体，所述载体包括至少一种可操作连接至核酸分子的启动子，所述核酸分子编码被权利要求2-4任一核酸分子编码的多肽，以及(ii)表达(i)部分的多肽，以致外多糖生产被抑制；以及从中鉴定在能够抑制外多糖生产的多肽的存在下能够超生产粘液形式的外多糖的细菌。在某些实施方案中，提供能够超生产粘液形式的外多糖的细菌的制备方法，包括(A)将(a)诱变剂与(b)能够生产粘液形式的外多糖的细菌接触，其中所述细菌(i)含有重组表达载体，所述载体包括至少一种可操作连接至编码至少一种多肽的核酸分子的启动子，其中所述核酸分子为任一前述核苷酸序列，以及(ii)表达(i)中所述至少一种多肽，以致在足以生产被诱变细菌的条件和时间下，外多糖生产被抑制；以及(B)从所述被诱变细菌中鉴定一种或多种能够超生产粘液形式的外多糖的细菌。在一个实施方案中，本发明中所用的诱变剂为甲磺酸乙酯，并且所述细菌为鞘氨醇单胞菌细菌，诸如那些能够生产选自结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，和NW11的外多糖的细菌，包括鞘氨醇单胞菌株α027。
在另一方面，本发明提供由任一前述方法生产的细菌，包括鞘氨醇单胞菌株α027的突变体，诸如α062(ATCC PTA-4426)，α063，α065，或α069，以及黄单胞菌株α300的突变体，诸如α449(ATCC PTA-5064)，α485，或α525。
附图简述

图1示出鞘氨醇单胞菌株α0449培养物的活细胞数和OD600之间的关系。
图2示出利用SEB-022-SF+MSP培养基对α449进行42L生产发酵。
本发明最佳实施方式如本说明书所述，本发明提供编码外多糖生物合成调节剂的核酸分子，以及制备和使用该核酸分子鉴定不再对该调节剂反应并由此能够生产高水平外多糖的细菌的方法。使用遗传技术创建改进的外多糖生产细菌对方便大规模生产生物聚合物，例如鞘氨醇胶多糖是期望的。然而，生物聚合物的合成被高度调节，这是因为，如果一时非必需地消耗代谢能量合成如此大的分子，细菌生存将受到危害，例如，当能量必须被导向生长时。而且，由于需要大量的蛋白创建和输出这些大分子，外多糖合成和组装的调节十分复杂。通过鉴定和使用编码鞘氨醇胶生物合成的负调节剂的核酸序列来生成鞘氨醇单胞菌衍生物，所述衍生物不再对该负调节剂反应，其结果能够产生高于正常量的鞘氨醇胶外多糖，本发明解决了这些问题。
在本说明书中，所有浓度范围、百分比范围或整数范围应被理解为含有所述范围内的任何整数值，并且如果合适，还含有其分数值(诸如整数的1/10和1/100)，除非另有说明。如本说明书所用，“约”或“基本上含有”表示±15％。替代物(例如，“或”)的使用应被理解为表示替代物的任一，两个或其任何组合。当术语以单数形式提供时，还预期该术语的复数形式。此外，应理解的是，衍生自在此所述结构和取代基的各种不同的组合的单个化合物，或化合物组，被本申请公开的程度如同各化合物或化合物组被单独阐述一样。因此，选择具体结构或具体取代基落入本发明范围之内。
鞘氨醇胶多糖如本说明书中所用，术语“鞘氨醇胶”和短语“鞘氨醇胶外多糖”，是指一组相关、但截然不同的由鞘氨醇单胞菌属的成员分泌的多糖(Pollock，J.Gen.Microbiol.1391939-1945，1993)。鞘氨醇单胞菌属的常见成员，以及它们生产的鞘氨醇胶，包括少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(ATCC 31461，前称伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea)，该菌生产外多糖S-60(结冷胶)(参见，例如，US专利Nos.4,377,636；4,326,053；4,326,052和4,385,123)；鞘氨醇单胞菌种ATCC 21423，该菌生产外多糖S-7(参见，例如，US专利No.3,960,832)；鞘氨醇单胞菌种ATCC 31554，该菌生产外多糖S-88(参见，例如，US专利Nos.4,331,440和4,535,153)；鞘氨醇单胞菌种ATCC31555，该菌生产外多糖S-130(文莱胶)(参见，例如，US专利No.4,342,866)；鞘氨醇单胞菌种ATCC 31961，该菌生产外多糖S-194(鼠李糖胶)(参见，例如，US专利No.4,401,760)；鞘氨醇单胞菌种ATCC31853，该菌生产外多糖S-198(参见，例如，US专利No.4,529,797)；鞘氨醇单胞菌种ATCC 53159，该菌生产外多糖S-657(diutan)(参见，例如，US专利No.5,175,278)；鞘氨醇单胞菌种ATCC 53272，该菌生产外多糖NW11(参见，例如，US专利No.4,874,044)；鞘氨醇单胞菌种FERM BP-2015(前称为广泛产碱菌(Alcaligenes latus)B-16)，该菌生产生物聚合物B-16(alcalan)(参见，例如，US专利No.5,175,279)等。
鞘氨醇胶在结构上总是有些相关性。各鞘氨醇胶的主链由四种糖，包括D-葡萄糖，D-葡糖醛酸，L-甘露糖和L-鼠李糖的相关序列组成。鞘氨醇胶族的多糖成员彼此区别在于形成聚合物骨架的碳水化合物，存在或缺乏酰基取代基(例如，乙酰基，甘油基，丙酮酰基，羟基丁酰基)，以及存在或缺乏侧链。例如，鞘氨醇胶多糖可含有碳水化合物侧链，以及连接至聚合物骨架碳水化合物的乙酰基或丙酮酰基。参见，例如，Mikolajczak等，Appl.Env.Microbiol.60402，1994。在某些实施方案中，鞘氨醇胶外多糖家族成员可由具有重复化学结构的下列通式表示 其中Glc为葡萄糖；GlcA为葡糖醛酸或2-脱氧-葡糖醛酸；Rha为鼠李糖；Man为甘露糖；X可以为Rha或Man；Z连接至Glc残基2，并可以是α-L-Rha-(1-4)-α-L-Rha，α-L-Man，或α-L-Rha；Y连接至Glc残基1，并可以是β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc，β-D-Glc-(1-6)-β-D-Glc，或α-L-Rha，下标m和n可以独立地为0-约1，以及其中聚合物的“还原端”朝向骨架的X残基。在标准实践中，寡糖或多糖的还原端置于右边。如本说明书所用，术语“骨架”或“主链”是指排除链Y和Z(即，当m和n等于0)的结构部分。例如，结冷胶(S-60)的主链以2∶1∶1摩尔比包含糖D-葡萄糖，D-葡糖醛酸和L-鼠李糖，它们连接在一起形成四糖重复单元，具有下列亚基顺序葡萄糖，葡糖醛酸，葡萄糖，鼠李糖。另一鞘氨醇胶，diutan(S-657)的主链与结冷胶的区别在于其具有与葡萄糖残基2连接的L-鼠李糖的额外二糖侧链，形成六糖重复单元。另一鞘氨醇胶，文莱胶(S-130)，与结冷胶具有相同的一级结构，但具有与葡萄糖残基2连接的单一L-甘露糖或单一L-鼠李糖的侧链，形成五糖重复单元。
鞘氨醇胶多糖家族的一些成员在多种不同位置被乙酰基化。例如，如本说明书所用，结冷胶与文莱胶(即，X＝Rha)具有同样的碳水化合物骨架，与文莱胶(即m＝0和n＝0)一样，缺乏侧链糖，但与文莱胶相反，葡萄糖残基1完全被甘油基化和部分被乙酰基化。结冷胶平均每个四糖重复单元具有约1个甘油基，以及每两个重复单元具有约1个乙酰基。另一含有乙酰基的鞘氨醇胶是diutan(S-657)，其在葡萄糖残基2的位置2和/或位置6含有乙酰基。如本领域公知，和如在此所述，鞘氨醇胶多糖可置于以常规方式促进脱乙酰基化的条件下以去除乙酰基。因此，如在此所用，“脱乙酰基化”是指缺乏一个或多个乙酰取代基，诸如甘油基和乙酰基的鞘氨醇胶多糖。
通过背景，鞘氨醇单胞菌可生产荚膜形式或粘液形式的鞘氨醇胶外多糖。如本发明所用，“荚膜”是指与产细菌细胞的表面连接的多糖，甚至在水性稀释，沉淀，或离心之后，其仍维持与细胞的连接。通常情况下，为了使荚膜外多糖与细菌细胞分开，需要某些形式的物理处理(例如，热)或化学处理。如本发明所用，“粘液”是指不与产细菌细胞连接的多糖。即，通过例如，离心发酵液，或水性稀释发酵液(甚至在缺乏热处理或其他物理或化学处理的情形下)，粘液形式的外多糖可基本上与细菌细胞分开。如本领域所公知，借助光学显微镜观察，产粘液形式外多糖的细菌可区别于那些产荚膜多糖的细菌荚膜化的鞘氨醇单胞菌形成多细胞聚集体，而粘液形成细菌均匀地分散。此外，通过例如US专利No.6,605,461中所述的诱变，荚膜化的鞘氨醇单胞菌可转化成粘稠鞘氨醇单胞菌。
如本发明所用，术语“鞘氨醇单胞菌”是指产生外多糖(例如，鞘氨醇胶)的革兰氏阴性细菌及其衍生菌株的属，如在此所述。革兰氏阴性细菌的鞘氨醇胶-产家族于1993年首先被鉴定成属于鞘氨醇单胞菌属(参见，Pollock，J.Gen.Microb.1391939，1993)。本发明中有用的鞘氨醇单胞菌包括亲本鞘氨醇单胞菌菌株及其衍生菌株。如本发明所用，“亲本菌株”是指在诸如化学，生物或其他类型的诱变等任何处理之前的细菌或单个细菌，所述处理将修饰亲本菌株的基因内容(例如，基因组或外基因组序列内的替换，插入，或缺失)或表型。本领域普通技术人员会理解，突变的鞘氨醇单胞菌可以是“亲本菌株”，诸如突变的鞘氨醇单胞菌衍生株，随后进行突变，产生粘液形式而非荚膜形式的外多糖。如本发明所用，术语“衍生株”，当指鞘氨醇单胞菌种，菌株，或细菌时，表示维持基本相同或增强的生产鞘氨醇胶外多糖的能力的任何鞘氨醇单胞菌种，菌株，或细菌，如本发明所述。
另外，如本发明所用，“基因突变”，“基因修饰”，“诱变”，和“突变体”是指具有一个或多个自发或诱导突变的品质，以及显示将突变细菌或菌株与亲本细菌或菌株相区别的性质的品质。因此，为本发明目的，超生产鞘氨醇胶外多糖的突变鞘氨醇单胞菌种，菌株，或细菌预计作为亲本鞘氨醇单胞菌种，菌株，或细菌的衍生株。如本发明所用，“诱导的突变”表示以公知诱导DNA基因变化的试剂，包括化学化合物，电磁辐射，离子辐射，和生物试剂(诸如病毒，质粒，插入元件或转座子)处理细菌细胞。在一个优选的实施方案中，本发明提供在外多糖生物合成负调节剂存在下生产外多糖的突变的鞘氨醇单胞菌。
如本发明所用，术语“生物合成”描述任何类型的大分子，诸如核酸，多肽，或多糖(例如，鞘氨醇单胞菌的鞘氨醇胶或黄单胞菌的黄原胶)的生物生产或合成，其可包括若干合成步骤才能得到中间产物或终产物。例如，鞘氨醇胶外多糖经被众多细菌酶(例如，糖基转移酶)控制的系列步骤可合成自单个碳水化合物单位。术语“生物质量”是指细菌培养物中的外多糖加细菌细胞。
在某些实施方案中，本发明的鞘氨醇单胞菌生产粘液形式的外多糖。例如，经基因突变后合成和输出粘液形式的鞘氨醇胶外多糖的鞘氨醇单胞菌菌株，在本发明上下文中可用作“亲本菌株”。在本发明中有用的鞘氨醇单胞菌亲本菌株的例子包括菌株X287(ATCCPTA-3487)，该菌株生产粘液形式的结冷胶(S-60)；菌株X530(ATCCPTA-3486)和α252(ATCC PTA-5128)，该菌株生产粘液形式的文莱胶(S-130)；菌株Z473(ATCC PTA-3485)，该菌株生产粘液形式的外多糖S-88；以及菌株X031(ATCC PTA-3488)，该菌株生产粘液形式的外多糖S-7(参见，例如，US专利Nos.5,338,841和6,605,461)。生产粘液形式的鞘氨醇胶外多糖的鞘氨醇单胞菌菌株的一个优点在于发酵液粘度可显著降低，这使得增量的所需多糖累积。然而，示例性粘液形式鞘氨醇单胞菌菌株X287(ATCC PTA-3487)以类似于亲本菌株鞘氨醇单胞菌paucimobilis(ATCC 31461)的水平生产结冷胶，同时仍有利地降低发酵液粘度。因此，本发明的一个方面是鉴定能够调节多糖，例如鞘氨醇胶表达的核酸序列。
鞘氨醇胶生物合成调节剂如果供应以容易转化的碳源，诸如葡萄糖，以及足量的氧，多种细菌合成和分泌酸性多糖。若干细菌属鞘氨醇单胞菌的成员生产多种酸性多糖，统称为鞘氨醇胶。在某些环境情况下，经由负调节系统，通过使外多糖生产最小化，细菌会保存能量。本发明总的涉及编码一种或多种多肽的核酸序列，所述多肽能够在鞘氨醇单胞菌中改变(例如，以统计学显著的方式增加或减少)外多糖生产。本发明还涉及通过筛选对外多糖生物合成的调节剂不再反应的细菌，从而制备能够超生产粘液形式的外多糖的细菌的方法。因此，在本发明的某些优选实施方案中，编码一种或多种能够在鞘氨醇单胞菌种中调节外多糖生产的多肽的分离的核酸分子用来制备能够超生产(即，以统计学显著的方式比亲本菌株生产更多的量)例如粘液形式的外多糖的突变细菌。
能够调节外多糖生产的合适核酸分子和多肽包括，但不限于，天然存在的核酸分子和多肽，及其衍生物或类似物。“纯化的肽，多肽或蛋白”或“纯化的核酸分子”为单独基本上无污染细胞组分，诸如碳水化合物，脂质，核酸(DNA或RNA)，或其他天然与核酸分子或多肽相连的类蛋白(proteinaceous)杂质的序列。优选地，纯化的核酸和多肽不含污染物，足以用于本发明的化学偶联反应或其他所需的用途。“分离的肽，多肽或蛋白”或“分离的核酸分子”为已从其原始环境中去除，诸如与一些或全部天然环境(例如，天然环境可以为未改变的细胞)中共存的材料分开的序列。
标准分子遗传技术可用来鉴定和分离编码外多糖生物合成的调节剂的核酸。如本发明所用，“调节剂”是指一种(天然或非天然存在的)化合物，诸如生物大分子(例如，核酸，蛋白，非肽或有机分子)，其在本文所述的分析或筛选中，作为生物工艺中的抑制剂或激活剂(或两者)(例如，阻遏物，激活剂，σ因子，杀菌剂，反义分子，干扰分子，酶等)，通常(直接或间接)具有活性。“调节”是指一种化合物以统计学显著的方式增强或抑制(或两者)生物活性或工艺的功能性性质(例如，基因表达，酶活性，或受体结合)的能力。例如，利用本领域公知的方法(参见，例如，Sambrook等，Molecualr CloningA LaboratoryManual，2ndedition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，可构建来自鞘氨醇单胞菌种S-88(ATCC 31554)的基因组表达文库，转化到以荚膜或粘液形式，优选粘液形式表达外多糖的细菌(例如，鞘氨醇单胞菌菌株X031)中，以及筛选不再表达外多糖的重组细菌。
利用本发明此种方法，(约2,600个核苷酸的)核酸分子(SEQ IDNO3)被鉴定，并分离自鞘氨醇单胞菌种S-88基因组，该分子编码一种或多种直接或间接抑制鞘氨醇胶生物合成的多肽。此外，分离自SEQ IDNO3的573个核苷酸片段(SEQ ID NO1)被鉴定成足以抑制鞘氨醇单胞菌中的鞘氨醇胶生物合成，包括S-7，S-88，S-130，S-194，S-198和NW11。SEQ ID NO1也能够抑制黄单胞菌(例如，野油菜黄单胞菌(Xathomonas campestris)X59，ATCC 55298)中的黄原胶生物合成。在优选的实施方案中，外多糖生物合成的调节剂为编码多肽调节剂的核酸分子，调节剂优选为外多糖生物合成的负调节剂。即，表达编码外多糖生物合成的负调节剂的核酸的宿主细胞将抑制外多糖在该宿主细胞中的表达。
通过背景，并不希望受缚于理论，对SEQ ID NO3核酸序列的分析揭示了潜在的三种多肽被该序列编码，包括3-脱氧-D-阿拉伯糖基-heptulosonic acid-7-磷酸合酶(DAHPS)的同系物，称作MPG的新多肽，以及称作SpsN的新多肽。DAHPS参与芳香族氨基酸生物合成。此外，SEQ ID NO1编码SpsN，MPG和DAHPS的C端。因此，以及如本发明更详细所述，一种或多种MPG和SpsN可直接或间接起到鞘氨醇胶和黄原胶生物合成的调节剂的作用。实施例3描述spsN核酸序列的存在对抑制某些细菌外多糖生物合成是如何必须的和可能足够的。在优选的实施方案中，本发明提供如SEQ ID NO3或SEQ ID NO1所示的核酸分子，其编码至少一种能够在鞘氨醇单胞菌或黄单胞菌种中改变外多糖生产的多肽。此外，本发明应理解也涉及如SEQ ID NO3或SEQID NO1所示的核酸分子，其本身起到调节剂的作用，或编码另一用作调节剂的核酸。因此，在另一优选实施方案中，提供有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO1所示的核酸分子，其能够在鞘氨醇单胞菌或黄单胞菌种中改变外多糖生产。
尽管编码外多糖生物合成的调节剂的分离的核酸的具体实施方案以SEQ ID NOs3和1的形式描述于本发明的上下文中，提及的一种或多种分离的核酸包括这些序列的变体，所述变体基本相似在于它们编码结构相似的天然或非天然蛋白，多肽或肽，并且起到外多糖生物合成的调节剂的作用，诸如SEQ ID NO4或SEQ ID NO2。如本发明所用，核苷酸序列被认为是“基本相似”，如果(a)核苷酸序列来自从鞘氨醇单胞菌或黄单胞菌分离的SEQ ID NO3或1的编码区(包括，例如，序列部分或上述序列的等位变化)并能改变外多糖生物合成；(b)核苷酸序列能够与本发明核苷酸序列在中度或高度严格条件下杂交；(c)核苷酸序列是简并性的(即，利用不同密码子序列为相同氨基酸编码的序列)，结果在(a)或(b)定义的核苷酸序列的遗传密码中“摆动”；或(d)为(a)，(b)或(c)所述的任一序列的互补序列。多核苷酸变体可含有一个或多个替换，添加，缺失和/或插入，以便编码的多肽的活性优选未被基本上减少，如本发明所述。
在一个实施方案中，优选分离的核酸分子，其包含的序列在高度严格条件下维持与探针的杂交，其中所述探针由SEQ ID NO1或其互补序列组成。在优选的实施方案中，本发明提供由SEQ ID NO1或其互补序列组成的分离的核酸分子。因此，本发明某些分离的核酸对检测核酸的存在是有用的(所述核酸编码外多糖生物合成的调节剂，或其类似物，同系物，或衍生物)，或对表达能够改变外多糖生物合成的多肽是有用的。如本发明所用，“核酸分子”或“多核苷酸”是指核苷酸长度至少10个碱基的聚合物形式，或者核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述术语包括单链和双链形式的DNA或RNA或众多任一公知的天然和非天然的核酸化合物变体，例如，对降解具有更大抗性的核酸，诸如那些含有硫代磷酸酯的核酸。在某些实施方案中，编码外多糖生物合成的调节剂的核酸分子为DNA或RNA。
“中度严格杂交条件”和“高度严格杂交条件”为根据核苷酸碱基配对和氢键形成的现成原则，探针核苷酸序列与靶核苷酸序列之间杂交的条件，其中当部分靶序列基本上类似于探针序列的互补序列时，杂交将仅是容易可检测的。杂交条件随探针大小，以及随温度，时间和盐浓度，以本领域技术人员公知的方式而变化。例如，50个核苷酸探针的中度杂交条件包括在55-60℃下温育的缓冲液中杂交过夜，所述缓冲液含有5×SSPE(1×SSPE＝180mM氯化钠，10mM磷酸钠，1mMEDTA(pH7.7)，5×Denhardt氏溶液(100×Denhardt氏＝2％(w/v)胎牛血清白蛋白，2％(w/v)Ficoll，2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)和0.5％SDS。在中度严格条件下后杂交洗涤通常在0.5×SSC(1×SSC＝150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)或0.5×SSPE及55-60℃下进行。高度严格杂交条件通常包括在50％甲酰胺存在下于2×SSPE中42℃过夜，接着以约0.1×SSC-约0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下一次或多次洗涤30分钟或更长时间。
本发明编码外多糖生物合成的调节剂的分离的核酸可利用多种不同的方法获得。例如，如上所述，通过以与SpsN或MPG多肽反应的抗体进行筛选，核酸分子可获自cDNA或基因组表达文库(参见，例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，1989；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing，1987)。此外，可采用随机引发的PCR(参见，例如，Methodsin Enzymol.254275，1995)。而且，尤其在需要具体基因或基因家族时，还可采用随机引发的PCR的变体。在一个这样的方法中，引物之一是随机引物，而另一引物为基于氨基酸序列或编码外多糖生物合成的调节剂的核苷酸序列的简并引物。
其他方法也可用于获得编码外多糖生物合成的调节剂的分离的核酸分子。例如，通过本发明提供的序列信息用于合成可被标记的探针，诸如放射性标记，酶标记，蛋白标记，荧光标记等，核酸分子可被分离，并杂交至基因组文库或cDNA文库，所述文库构建在例如，设计的噬菌体，质粒，噬粒，或病毒载体中，从而在一种或多种选定的宿主细胞中复制或表达(参见，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。利用互补于如上所述的由SEQ ID NOS1和3提供的分离的核酸序列的5’和3’序列或互补于其变体的引物组，通过扩增也可获得代表RNA的DNA或基因组核酸序列。为方便克隆，限制性酶切位点也可插入引物中。因此，本发明包括的核酸分子可用作引物，在PCR扩增程序中，特异性扩增至少一种编码外多糖生物合成的调节剂的mRNA或DNA，尤其在衍生自鞘氨醇单胞菌或黄单胞菌的样品中(对于PCR程序，参见，例如U.S.专利No.4,683,195；U.S.专利No.4,965,188；和Innis等，PCR Strategies，Academic Press，San Diego，1995)。这种PCR扩增方法在本领域是公知的，并包括引物延伸PCR，实时PCR，逆转录酶PCR(Freeman等，BioTechniques 26112，1999)，反PCR(Triglia等，Nucleic Acids Res.168186，1988)，捕获PCR(Lagerstrom等，PCRMethods Applic.1111，1991)，差别引物延伸(WO 96/30545)，和其他本领域公知或后来开发的PCR扩增方法(参见，例如，Innis等，PCRStrategies，Academic Press，San Diego，1995)。
在操作中，PCR方法一般包括利用化学合成的引物分子，但是引物分子可通过酶法生成或重组产生。PCR引物一般包括两个核苷酸序列，一个为有义方向(5’→3’)而另一个为反义方向(3’→5’)，在优选鉴定特异基因或病症的条件下采用。同样的PCR引物，嵌套的寡聚物组或寡聚物的简并池也可在较少严格条件下用于检测和/或定量分析密切相关的DNA或RNA序列。这些核酸分子也可单独使用，或与探针组合使用来鉴定样品中的接触蛋白mRNA或DNA分子。这些核酸分子包括5’-GACGGATCCTTGCCGAGGTGCG-3’(SEQ ID NO5)，5’-CGACGGCCACTACTAGCGTTCGAACG-3’(SEQ ID NO6)，5’-GTCCGTCGGTATCTACGGCTTCGAACG-3’(SEQ ID NO7)，SEQ ID NO5为正向引物，而SEQ ID NO6和SEQ ID NO7为反向引物。
本发明核酸分子可由本领域公知的各种方法来制备。例如，利用本领域公知的合成方法或分子生物学技术，可制备核酸分子(参见，例如，Sambrook等，同上)。本发明核酸分子的长度，根据核酸分子所用目的，可由本领域技术人员容易选择。对PCR引物而言，核酸分子的长度优选在约10个核苷酸和约50个核苷酸之间，更优选在约12个核苷酸和约30个核苷酸之间，以及最优选在约15个核苷酸和约25个核苷酸之间。对于探针而言，核酸分子的长度优选在约20个核苷酸和约1000个核苷酸之间，更优选在约100个核苷酸和约500个核苷酸之间，以及最优选在约150个核苷酸和约400个核苷酸之间。
本发明提供的分离的SEQ ID NOS1和3核酸序列的变体(包括等位基因)可从合成或构建的天然变体(例如，多态性，突变株和其他血清型)而容易获得。许多方法已为生成突变株开发出来(参见，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。简而言之，为生成核苷酸替换的优选方法利用跨越待突变的碱基和含有突变碱基的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交至互补单链核酸，而第二链合成从寡核苷酸引发。制备的双链核酸转化至宿主细胞，诸如大肠杆菌，或其他原核生物，以及酵母或其他真核生物。标准筛选和载体扩增方案用来鉴定突变序列和获得高收率。
同样，编码外多糖生物合成的调节剂的核酸分子的缺失或插入可通过任一公知方法构建。例如，序列可以限制性酶或核酸酶消化，并再连接，从而序列被缺失，添加或替换。同样，多种转座子和其他插入元件可用于制备具有缺失和插入的重组子。因此，在一个例子中，如本发明所述，在spsN编码序列中含有Tn10Kan转座子的spsN突变株可根据本领域公知的方法制备。其他本领域中公知的生成变体序列的手段也可采用，无需过多的实验(例如，参见Sambrook等，同上，以及Ausubel等，同上)。而且，通过限制性酶制图，序列分析，杂交等，通常对变体序列实现确认。编码外多糖生物合成的调节剂并能够改变外多糖生物合成的变体在本发明的上下文中尤其是有用的。
本领域普通技术人员会意识到，其他spsN编码序列可以相似方式鉴定和分离。例如，spsN的类似物或衍生物，或来自其他种鞘氨醇单胞菌或其他相关细菌(诸如黄单胞菌或假单胞菌)的spsN同系物利用本发明所述的测定方法可被鉴定和分离。因此，在某些实施方案中，外多糖生物合成在鞘氨醇单胞菌或黄单胞菌中的优选调节剂包括如SEQID NO3或SEQ ID NO1中所述的核酸序列，以及能够改变外多糖生物合成的SEQ ID NO3或SEQ ID NO1的类似物或衍生物。如本发明所用，术语“衍生物”和“类似物”当其意为外多糖生物合成的调节剂时，表示维持与如上所述的亲本调节剂基本上相同(至少50％，以及优选大于70％，80％，90％，或95％)或增强的生物功能或活性的任何外多糖生物合成的调节剂。此种类似物和衍生物的生物功能或活性可通过标准方法(例如，平板测定法，凝胶分析，转录测定法，翻译测定法)，例如利用本发明所述和本领域公知的测定方法而确定。例如，类似物或衍生物可以是通过切割激活的前蛋白，或可以是通过氨基酸修饰而被激活或稳定化的前体，以生产外多糖合成的活性调节剂。或者，外多糖生物合成的调节剂或其类似物或衍生物可通过其特异性结合至一种或多种抗调节剂抗体的能力加以鉴定。
另一类似物或衍生物的例子包括外多糖生物合成的调节剂(例如，SpsN)，其与天然存在的调节剂的氨基酸序列相比，具有一个或多个保守性氨基酸替换。在常见氨基酸中，“保守性氨基酸替换”例如通过下列各组内氨基酸中的替换来说明(1)Gly，Ala，Val，Leu，和Ile，(2)Phe，Tyr，和Trp，(3)Ser和Thr，(4)Asp和Glu，(5)Gln和Asn，和(6)Lys，Arg和His，或其组合。此外，调节剂的类似物或衍生物可包括，例如，非蛋白氨基酸，诸如正常氨基酸的前体(例如，高丝氨酸和二氨基庚二酸)，代谢途径中的中间体(例如，六氢吡啶羧酸和正常氨基酸的D-对映体)，和氨基酸类似物(例如，铃兰氨酸，高脯氨酸，和刀豆氨酸)。
类似物或衍生物的其他实施方案包括外多糖生物合成的调节剂，其维持与亲本分子至少约60％的同一性(即，“亲本”分子将取决于起始点，亲本是否是例如野生型SpsN，或SpsN的类似物)，更优选至少约70％，80％，90％，以及最优选至少约95％的同一性。如本发明所用，“同一性百分比”或“同一性％”为利用通常具有默认参数的计算机执行算法，通过比较对象多肽，肽，或其类似物或衍生物的全部序列与测试序列而得到的百分比值。利用任何标准软件程序，诸如以由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产的Lasergene生物信息学计算程序组提供的那些程序，可进行序列比较。诸如BLAST或ALIGN等算法的参考文献可发现在，例如Altschul，J.Mol.Biol.219555-565，1991；或Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992；以及优选使用BLAST(如本发明所用，BLAST是指一种或多种下列检索算法BLASTn，MEGABLAST，BLASTp，PSI-BLAST，PHI-BLAST，BLASTx，tBLASTn，tBLASTx，RPS-BLAST，CDART，VecScreen，trace BLAST等)，其在国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)网址(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上以及对与数据库，诸如GenBank比较的结果是可获得的。通过确定最佳比对，比较多个核苷酸或氨基酸序列的其他方法对本领域技术人员是众所周知的(参见，例如，Peruski和Peruski，The Internet and the New BiologyTools forGenomic and Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)；Wu等(编)，“Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic acidsand Proteins”，在Methods in Gene Biotechnology，第123-151页(CRCPress，Inc.1997)；以及Bishop(编)，Guide to Human Genome Computing，2ndEdition，Academic Press，Inc.，1998)。
如本发明所用，两种或更多种肽或多肽之间的“相似性”一般通过将一种肽或多肽的氨基酸序列与另一种或多种与前者具有保守性氨基酸替换的肽或多肽相比而确定。此外，如本领域公知，基于亲本化合物，诸如MPG(SEQ ID NO4)或SpsN(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，可确定一组同系物，类似物，或衍生物的共有序列。在优选实施方案中，多肽调节剂包含SEQ ID NO2的氨基酸序列，以及在甚至更优选的实施方案中，调节剂由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成。
类似物或衍生物也可以是外多糖生物合成的调节剂的融合蛋白。融合蛋白或嵌合体包括一个或多个外多糖生物合成的调节剂与非调节剂肽或多肽，诸如多肽标志(例如，表位标志或6×His标志)，载体，或酶的融合。肽也可具有可检测标记或“标志”(即，肽被标记)，诸如放射性标记，荧光标记，质谱学标志，生物素等。
肽可通过重组技术生产，以及多种不同的宿主系统适用于生产外多糖生物合成的调节剂及其类似物或衍生物，包括细菌(例如，大肠杆菌)，酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae))，昆虫(例如，Sf9)，以及哺乳动物细胞(例如，CHO，COS-7)。许多表达载体已被开发出来，并且对各宿主而言是可得到的。在优选实施方案中，在细菌中具有功能(即，能够复制)的载体用于本发明中，甚至更优选载体是宽宿主范围的质粒，诸如pRK311(Ditta等，Plasmid 13149，1985)和pMMB(EH)(Furste等，Gene 48119，1986)。然而，有时可优选的载体在其他宿主或一种以上宿主中具有功能。在大肠杆菌中克隆和表达的载体和步骤论述在本发明，以及例如在Sambrook等(1987)和在Ausubel等(1995)。
“载体”是指能够指导所需多肽表达的核酸组件。载体可包括与目的核酸编码序列或分离的核酸分子可操作连接的表达控制序列(例如，转录启动子/增强子元件)。载体的组成为DNA，RNA或两者组合(例如，DNA-RNA嵌合体)。任选地，视需要，载体可包括多腺苷酸序列，一个或多个限制性位点，以及一个或多个可选择性标记，诸如新霉素磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。另外，取决于所选的宿主细胞和所用的载体，诸如复制起点，附加的核酸限制性位点，增强子，赋予可诱导性或可阻遏性转录的序列以及可选择标记等的其他遗传元件，也可插入在此所述的载体。
“克隆载体”是指能够在宿主细胞中自主复制的核酸分子，诸如质粒，粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少数几个限制性核酸内切酶识别位点，在所述位点处可以可确定方式无需丧失载体的必要生物功能插入外源核苷酸序列。克隆载体也通常含有适用于鉴定和选择转化有克隆载体的细胞的标记基因(例如，抗生素抗性编码基因)。标记基因通常编码提供抗生素，四环霉素，卡那霉素，氨苄青霉素等抗性的蛋白。
如本发明所用，“核酸表达构建体”是指含有在宿主细胞中表达的核酸序列的核酸分子构建体。通常，目的核酸序列的表达置于表达控制序列(例如，启动子)的控制之下，以及任选，置于至少一个调节元件的控制之下。这种表达的序列据说是“可操作连接至”启动子。同样，调节元件和启动子是可操作连接的，如果调节元件改变(即，统计学显著性增加或降低)启动子的活性。如本发明所用，“表达控制序列”是指指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，表达控制序列位于基因的5’区，邻近结构基因的转录起始位点。如果表达控制序列为可诱导启动子，则转录速率可例如通过添加诱导剂增加，或通过添加抑制剂减少。相比之下，诱导剂或抑制剂并不影响组成型启动子转录的速率。
本领域普通技术人员能够选择合适的表达控制序列，和合适的宿主，例如用于表达分离的核酸序列，所述序列编码具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的肽或其变体，其中所述变体包含的氨基酸序列与SEQID NO4相比具有保守性氨基酸替换或至少80％的序列同一性，以及其中所述变体能够改变外多糖生物合成。在优选的实施方案中，提供有重组表达载体，其包含至少一个与如SEQ ID NO1或3所述的核酸分子或其变体可操作连接的启动子，编码至少一种能够在鞘氨醇单胞菌中改变外多糖生物合成的多肽。
编码外多糖生物合成的调节剂的DNA序列可被导入适于特定宿主的表达载体。在某些实施方案中，核酸序列可被克隆至载体或表达载体以生成融合蛋白。融合伴侣可选择多肽标志，以便利于融合蛋白的分离。融合载体可阻止宿主蛋白酶降解调节剂，或融合伴侣可进一步用于转运融合肽至包涵体，胞质，外膜，或胞外环境。因此，本发明预期重组表达载体，其包含至少一种与如SEQ ID NO1或3所不的核酸分子或其变体可操作连接的启动子，编码至少一种多肽，以能够在鞘氨醇单胞菌中改变外多糖生物合成的融合蛋白表达。通常，与外多糖生物合成的调节剂融合的蛋白部分将由第二核酸序列编码，优选第二核酸序列编多肽标志或酶，正如本发明所述和本领域公知。在某些实施方案中，表达载体启动子优选被调节，并且在某些情形下，载体优选是在鞘氨醇单胞菌，假单胞菌，或黄单胞菌中复制的质粒。在优选实施方案中，质粒为pRK311，含有SEQ ID NO1(X029，ATCCPTA-5127)或SEQ ID NO3。
如本发明所用，“宿主细胞”是指含有克隆载体或核酸表达构建体的任何原核生物或真核生物细胞。该术语还包括那些经重组改造后在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆的核酸序列的原核生物或真核生物细胞。宿主细胞优选为原核生物细胞，更优选为细菌，甚至更优选为鞘氨醇单胞菌，黄单胞菌或假单胞菌。鞘氨醇单胞菌为最优选。在某些优选实施方案中，宿主细胞为产鞘氨醇胶细菌，诸如生产结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S-7，S-88，S-198和NW11的鞘氨醇单胞菌种。在一个实施方案中，本发明提供宿主细胞鞘氨醇单胞菌，诸如α027，含有质粒X029(ATCC PTA-5127)。在另一实施方案中，宿主细胞为黄单胞菌。
增强的外多糖生物合成根据本发明的另一方面，提供有鉴定和分离能够过量生产外多糖的细菌的方法。具体而言，外多糖生物合成的调节剂可用于鉴定对外多糖生物合成的调节剂不再反应的产外多糖细菌。例如，生产外多糖的细菌菌落在琼脂平板上会有粘液样外观，而非生产者会有非粘液样外观。将编码外多糖生物合成的调节剂的重组表达载体导入产外多糖细菌会抑制外多糖表达，这表示细菌在琼脂平板上会有非粘液样外观。从这些受抑制菌株可筛选出甚至在外多糖生物合成的调节剂的存在下能够表达外多糖的自发突变株或诱导突变株。
在某些实施方案中，提供有制备能够超生产粘液形式的外多糖的细菌的方法，包括将粘液形式的外多糖的生产受抑制的细菌与诱变剂接触，其中细菌(i)含有重组表达载体，该载体包括至少一个与核酸分子可操作连接的启动子，所述核酸分子编码至少一种能够改变外多糖生产的多肽，以及(ii)表达(i)部分的多肽，以便外多糖生产受到抑制；然后从中鉴定在能够抑制外多糖生产的多肽的存在下能够超生产粘液形式的外多糖的细菌。
术语“超生产”是指第一菌株比第二菌株生产统计学上显著多的外多糖的能力，第一菌株直接或间接衍生自第二菌株。如果第一菌株获自第二菌株的单轮突变和/或选择，则第一菌株“直接衍生自”第二菌株。如果第一菌株获自第二菌株的多轮突变和/或选择，则第一菌株“间接衍生自”第二菌株。
在一个优选实施方案中，提供有制备能够超生产粘液形式的外多糖的细菌的方法，包括(A)将(a)诱变剂与(b)能够生产粘液形式的外多糖的细菌接触，其中细菌(i)含有重组表达载体，该载体包括至少一个与编码至少一种多肽的核酸分子可操作连接的启动子，其中核酸分子编码至少一种能够改变外多糖生产的多肽，以及(ii)表达(i)的至少一种多肽，以便外多糖生产在足以生产被诱变细菌的条件和时间下被抑制；以及(B)从所述被诱变细菌中鉴定一种或多种能够超生产粘液形式的外多糖的细菌。在某些优选实施方案中，细菌为鞘氨醇单胞菌，诸如S-60，S-7，S130，S-7，S-194，S-198，和NW11，诱变剂为例如甲磺酸乙酯(EMS)，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，或本领域公知的另一合适的诱变剂。在另一优选实施方案中，外多糖生物合成的调节剂由SEQID NO1或3编码，并且优选由含有编码氨基酸序列SEQ ID NO2或4的序列的核酸分子编码。在一个特别优选的实施方案中，亲本细菌为鞘氨醇单胞菌α027，而对外多糖生物合成的调节剂不再反应的α027的突变株为鞘氨醇单胞菌α062(ATCC PTA-4426)(更多详情参见实施例)。在另一实施方案中，亲本细菌为野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)X59，而对外多糖生物合成的调节剂不再反应的X59的突变株为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)α449(ATCC PTA-5064)。优选地，突变菌株比亲本菌株(以统计学上显著方式)生产更多的外多糖，诸如至少约10％-约20％以上，优选至少约20％-约30％以上，以及更优选至少约30％-约40％以上。
外多糖的生产本发明的另一方面涉及增强的外多糖的生产。例如，为了生产鞘氨醇胶外多糖，将基因突变的鞘氨醇单胞菌培养在本领域众所周知并且在U.S.专利No.5,854,034中综述的合适发酵条件之下。简而言之，培养基因突变的鞘氨醇单胞菌用的合适培养基为含水培养基，一般含有碳源，诸如，碳水化合物，包括葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，或麦芽糊精；氮源，诸如无机铵，无机硝酸盐，有机氨基酸或类蛋白材料(proteinaceous material)，诸如水解酵母，大豆粉或酪蛋白；酒糟可溶物(distiller’s soluble)或玉米浆；无机盐和维生素。各种不同的发酵培养基可支持本发明的鞘氨醇胶的细菌生产。碳水化合物以变量包含在发酵液中，但通常介于约1％和约5％重量的发酵培养基之间。碳水化合物可在发酵前一次性加入或者在发酵过程中加入。氮量范围为约0.01％-约0.2％重量的含水培养基。可采用单一碳源或氮源，也可采用其混合物。在发酵鞘氨醇单胞菌中发现有用的无机盐为含有钠，钾，铵，硝酸根，钙，磷酸根，硫酸根，氯，碳酸根等相似离子的盐。痕量金属，诸如镁，锰，钴，铁，锌，铜，钼，碘和硼，也可有利地包括在内。另可有利地采用维生素，诸如生物素，叶酸，硫辛酸，烟酰胺，泛酸，吡哆醇，核黄素，硫胺和维生素B12及其混合物。
一般而言，发酵可在约25-35℃(包括端点值)的温度下进行，并在28-32℃(包括端点值)的温度内获得最佳生产率。通过标准体积放大法制备种菌，包括摇瓶培养物和小规模深层搅拌发酵。制备种菌的培养基可以与生产培养基相同，或可以是任一本领域众所周知的标准培养基，诸如LB或YM培养基。碳水化合物在种子培养基中的浓度可减少至少于约1％重量。一个以上的种子阶段可用于获得接种的所需体积。典型的接种体积范围为约0.5％-约10％的总终发酵体积。发酵容器通常包括搅拌器以搅拌内容物。容器还可具有自动pH和消泡控制。生产培养基加入容器中，并在原位通过加热杀菌。或者，碳水化合物或碳源可在加入前单独灭菌。早先生长的种子培养物添加至冷却的培养基(一般在约28℃-约32℃的发酵温度下)，以及搅拌的培养物发酵约48小时-约96小时，产生的发酵液的粘度为约15,000厘泊(cp)-约20,000cp，以及约10-约15g/L粘液形式的鞘氨醇胶外多糖。对应亲本鞘氨醇单胞菌菌株的发酵通常会提供粘度为约25,000cp-约50,000cp的发酵液。
在此方面，本发明提供粘液形式的外多糖，其获自在深层搅拌和通气的液体培养物中生长的鞘氨醇单胞菌或黄单胞菌。液体培养物中的溶氧浓度在培养24之后优选超过约5％的水饱和度。利用荚膜菌株进行相似发酵，24后导致0％溶氧。由粘液形式的外多糖提供的更低粘度改进了通气条件，使得鞘氨醇单胞菌在培养物中能生产外多糖更长的时间段。在本发明另一方面，以半批量方法进行发酵，其中来自一个发酵的细菌用作随后发酵的种菌。在该方面，例如，已从其生产的外多糖中分离的鞘氨醇单胞菌可添加至新鲜发酵液，或新鲜发酵液可添加至剩余鞘氨醇单胞菌。因此，本发明的该方面排除了提供单独的种子培养的需要。
不管用于生产外多糖的条件如何，外多糖的回收优选包括沉淀步骤。然后，沉淀的外多糖可通过离心回收。回收结冷胶和文莱胶的典型方法如下。发酵后立即将培养液加热至至少90℃以杀死活细菌。接着，外多糖通过近2倍体积(即，等量的培养物体积)的异丙醇沉淀而与培养液分离，沉淀的外多糖纤维收集，挤压，干燥，和研磨。醇通过蒸馏去除。在此最简单的方法中，多糖维持与细胞的连接，以便当干燥和研磨的多糖重悬浮于水中时，溶液不是透明的。在结冷胶的情形下，导入额外步骤从细菌细胞中纯化出多糖，从而重悬的产物更为透明。在醇沉淀前，培养液被离心和/或过滤，同时温度维持在高粘度状态和易离心或过滤的液化状态之间的临界转变温度之上。不同鞘氨醇胶的这些方法描述在例如，U.S.专利No.4,326,052(结冷胶)；U.S.专利No.4,326,053(结冷胶)；U.S.专利No.4,342,866(文莱胶)；U.S.专利No.3,960,832(S-7)；以及U.S.专利No.4,535,153(S-88)。
在某些实施方案中，本方面提供超生产外多糖的方法，包括在足以使得外多糖生产的条件和时间下培养细菌，其中所述细菌在表达至少一种由核酸分子编码、能够改变外多糖生产的多肽时，超生产粘液形式的外多糖；以及从培养物中分离粘液形式的外多糖。优选地，细菌为鞘氨醇单胞菌，诸如那些生产结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，或NW11的菌株，更优选鞘氨醇单胞菌株α062(ATCC PTA-4426)，α063，α065，和α069。在优选的实施方案中，培养通过发酵进行，细菌生产约5g-约80g的外多糖/L培养物，更优选约10g-约70g，甚至更优选约20g-约60g。发酵的最佳条件为约48小时-约96小时，温度为约25℃-约35℃。优选地，外多糖通过醇沉淀分离，其中约1-约1.5体积的醇优选添加至培养物中。优选地，发酵培养物的终粘度为约5,000cp-约40,000cp，更优选约10,000cp-约35,000cp，以及最优选约15,000cp-约30,000cp。
本说明书中引用和/或申请资料页中列出的上述所有U.S.专利，U.S.专利申请公布，U.S专利申请，外国专利，外国专利申请和非专利公布皆以其全文在此引作参考，如同本发明所阐述的那样。
实施例实施例1白色，高葡萄糖抗性的鞘氨醇单胞菌的制备鞘氨醇单胞菌X287(ATCC PTA-3487)用于接种50ml 1/4YM-(含1％或5％葡萄糖)的125ml挡板摇瓶中，30℃下静置两周。当把培养物涂布在1/4YM+平板上，在这种温育延长之后，没有外多糖-阴性突变株出现。同样的培养物涂布在含10％葡萄糖的1/4YM平板上。分离的菌落(83)被挑选出来用于接种2ml含3％葡萄糖的1/4YM，然后以300rpm振荡、30℃下温育40小时。将这些培养物涂布在高葡萄糖平板上，挑选出12个菌落，并以X729-X741保存。12个突变株中有6个通过目测为白色突变株。
菌落用于接种2ml YM-的小试管，并在30℃下以300rpm振荡24小时(称作种子-1)。然后，100μl的这些培养物用于接种5ml B10G3，所述培养以一定角度放置，并以300rpm温育24小时(称作种子-2)。接着，5ml种子-2添加至20ml B10G3的125ml挡板摇瓶，200rpm振荡下温育头17小时，然后400rpm振荡直到46小时。10g终培养液室温下通过2.0体积的异丙醇(IPA)沉淀。样品在60℃下真空干燥2小时。
高葡萄糖抗性，白色突变株

亲本结冷胶粘液

株系X733接种在125ml挡板摇瓶，并温育48小时。培养液涂布在1/4YM+平板上，生成粘液-荚膜形式的菌落和数个黄色菌落。颜色指示剂显示的迹象在一定程度上预测突变稳定性。白色粘液菌落之一被挑选出来以X996保藏。
利用500ml挡板摇瓶，以0.1％接种量，将X996培育在含有3％和6％葡萄糖的100ml B10中，160rpm，24小时。
24小时pH/OD600/活细胞数B10 3％葡萄糖 6.30/9.95/2.4×1010B10 6％葡萄糖 6.32/7.88/1.7×1010当接种率低时，难以繁殖性培育该X996突变株。当在高搅拌速率下温育时，该突变株生长不良。
利用125ml挡板摇瓶，将该X996温育在30ml补充有7％葡萄糖的B10培养基中30小时。
低接种率抑制了X996细胞生长。该培养基室温下保存一周，无需振荡。然后将培养物涂布在1/4YM 10％葡萄糖平板上。在含有高葡萄糖的1/4YM平板上分离鞘氨醇单胞菌α016-α018。
实施例2不再对SpsN反应的鞘氨醇单胞菌的鉴定该实施例描述通过下列步骤鉴定能抑制spingan和黄原胶的生物合成的DNA序列(1)制备鞘氨醇单胞菌S-88基因组DNA的表达文库；(2)将所述表达文库转化至鞘氨醇单胞菌S-7中；以及(3)筛选外多糖S-7生产在鞘氨醇单胞菌S-7中的抑制(即，在平板上涂布细菌培养物，并观察非粘液外观的菌落)。合成引物SEQ ID NO5(22聚体)和SEQID NOS6和7(分别为26和27聚体)，与模板Z964(pBluescript KS-BH，7166p，其为Z939(pRK311-s88nc2，2.7kb)的片段)一起用于产生尤其编码功能性spsN的573bp片段(SEQ ID NO1)。将该573bp PCR片段(SEQID NO1)克隆至质粒pRK311，两个独立克隆(X026和X029)进一步测试如下

X025＝pRK311-MPG(385bp，22聚体-26聚体)；X026＝pRK311-MPG+SpsN(573bp，22聚体-27聚体)；X028＝pRK311-MPG(385bp，22聚体-26聚体)；X029＝pRK311-MPG+SpsN(573bp，22聚体-27聚体)；Z959-1至-3＝带有pRK311-s88nc2 EH2700bp spsN::Tn10Kn的独立克隆；Z967＝pRK311-BH716bp；+表示转化结合子在选择平板上生产外多糖，以及-表示转化结合子在选择平板上不生产外多糖。
这些结果表明，编码SpsN的核酸分子(例如，X029)能够抑制鞘氨醇单胞菌S-7，S-130，S-194，S-198，S-88，NW11，和黄单胞菌X59中的聚合物合成。
从测序的扩增子的分析中，将spsN(外多糖生物合成的调节剂)定位于DAHPS(3-脱氧-D-阿拉伯糖基-heptulosonic acid 7-磷酸合酶)下游。DAHPS调节芳香族氨基酸生物合成。活性PCR产物克隆至pRK311，称作X029(pRK311-spsN，Tetr)。该表达载体含有SEQ ID NO1，转化结合至鞘氨醇单胞菌α016，称作α027，其具有抑制的聚合物生产表型。然后，该α027以EMS处理后发现的突变体在药物压力Tet(即，在编码外多糖生物合成的调节剂SpsN的X029存在下)下显示外多糖-阳性表型。在这些条件下，有些外多糖-阳性表型可能是由于在SpsN或其他地方的突变。在无药物条件下选择去除质粒X029(即，编码SpsN)后，株系α061-α076被挑选和保存，以进一步测试(例如，生物质量产量)。这些株系培育在含有4ml B10培养基和5％葡萄糖的玻璃管中24小时。然后，3ml培养物接种至25ml含有3％葡萄糖的B10种子培养基的125ml挡板摇瓶，300rpm，48小时。从各摇瓶中，10g培养液通过2体积的IPA沉淀。沉淀的材料于60℃下干燥6小时。
干重α06113.18g/Lα06213.94有点荚膜-粘液α06314.16平板上粘液α06411.85α06515.77平板上粘液α06612.13α06713.47
α06813.66α06914.13平板上粘液α07013.94α07113.60α07212.81α07313.10α07412.06α0759.29α07610.862ml培养物接种至30ml含有5％葡萄糖的B10种子培养基的125ml挡板摇瓶中，以200rpm温育40小时，并以300rpm温育直到72小时。
下表说明突变株(即，α062，α063，和α065)比原始X287粘液突变株生产高出20％的生物质量。

培养基中的组分如下


实施例3对SpsN不再反应的鞘氨醇单胞菌株与其亲本株之间的外多糖生产的比较将原始粘液株系X287和α062与突变株α062在若干42L发酵测试下进行比较。400ml 24小时摇瓶培养物制备成这些试验的1％出发培养液。株系ATCC31464为X287的亲本，用作形成荚膜的结冷胶的野生型株。
42L/70L-发酵测试(40g/L葡萄糖)

42L/70L-发酵测试(45*-50g/L葡萄糖)

发酵液通过2体积IPA沉淀，随后在60℃下干燥6小时。终粘度为4-12rpm。
发酵得分(生物质量收率)如下




α062(G158)的培养液与ATCC31461(G157)的比较。结果示于下表。
利用70L发酵罐(45g/L葡萄糖)

实施例4对SpsN不再反应的黄单胞菌的鉴定DNA序列含有X029(ATCC PTA-5127)的生物聚合物抑制因子，通过杂交转化结合至野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)X55(ATCC 13951)和X59(ATCC 55298)。聚合物生产受抑制的菌落在含有四环素选择平板上分离成α287，α300，和α301。
黄原胶生产受抑制的α300(X59:X029)转化结合子以化学诱变剂EMS处理。即使在药物压力下对抑制因子X029不反应的突变菌落首先被分离，然后药物敏感的突变株α449(ATCC PTA-5064)，α474，α485，α499，α501，α525，α526，α544在无药物压力下选择以去除X029抑制因子。这些突变株在26ml YM+3 & 葡萄糖培养基的125ml挡板摇瓶中温育48小时。这些突变株性能示于下表。
X59及其突变株之间的比较


α449和α501与亲本X59相比，即使活细胞数相同，32小时后生成了10-20％多的生物质量。这表明这些突变株的聚合物累积速度快于亲本X59。
图1显示α449培养物的活细胞数和OD600之间关系。为了实现最佳种子培养物，基于下阶段生产发酵的OD600值，使细胞数最大化。
图2显示利用SEB-022-SF+MSP培养基的α449 42L生产发酵。空心圈代表X59或α449在SEB-022-MSP的6L发酵罐中发酵所得的黄原胶产量；实心圈代表α449利用SEB-022-SF+MSP(也称作“SFM”)在70L发酵罐中发酵后的生物质量(包括细胞和黄原胶)；以及三角代表发酵ATCC13951的黄原胶产量。图2中ATCC 13951发酵的数据来自Letisse等，Applied Microbiology和Biotechnology 55(4)417-22，2001。MSP是指消化的大豆蛋白。
葡萄糖80g/L时，终产物收率为57.3g/L。该突变株对抑制因子X029不反应，并在28℃，溶氧(DO)30％和pH6.5的条件下，累积较高水平的黄原胶。
α449 400ml种子培养物接种至SEB-022-SF+MSP(蔗糖＝80g/L)培养基，并利用70L发酵罐温育70小时。该培养基含有0.69g/L总氮(0.6g/L来自大豆和0.09g/L来自MSP)。终培养液OD为11.3，pH为6.55，以及活细胞数为2.0×1010/ml。终培养液粘度为34,900cp/16,300cp/9,420cp-12rpm/30rpm/60rpm，利用Brookfield粘度计的4#轴。
该实施例中所用SEC-022-SF+MSP培养基的组分如下蔗糖80.0g/LMSP 1.0g/L(N＝0.09)MgSO40.5g/LK2HPO42.0g/L大豆蛋白7.6g/L(N＝0.6)4％DF2891ml/L痕量1ml/L该实施例中所用SEC-022-MSP培养基的组分如下蔗糖60.0g/LMSP 1.0g/L(N＝0.09)MgSO40.5g/LK2HPO42.0g/L大豆蛋白7.6g/L(N＝0.6)4％DF2891ml/L痕量1ml/L保藏信息1.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2003年4月4日，保藏号ATCC PTA-5127。
2.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2003年4月4日，保藏号ATCC PTA-5128。
3.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2001年6月28日，保藏号ATCC PTA-3487。
4.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2001年6月28日，保藏号ATCC PTA-3486。
5.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2001年6月28日，保藏号ATCC PTA-3485。
6.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2001年6月28日，保藏号ATCC PTA-3488。
7.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期1992年2月18日，保藏号ATCC 55298。
8.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2002年6月4日，保藏号ATCC PTA-4426。
9.ATCC美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A，保藏日期2003年3月19日，保藏号ATCC PTA-5064。
<110>信越化学工业株式会社(Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.)<120>利用调节剂生产生物聚合物的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS OF USING AREGULATOR OF BIOPOLYMER PRODUCTION)<130>SCT065718-47<150>US 10/897,981<151>2004-7-23<160>11<210>1<211>573<212>DNA<213>Sphingomonas sp.
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1 5 10 15Thr Leu Ser Arg Ala Ala Phe Gly Ala Trp Phe Asp Thr Pro Gly Ser20 25 30Thr Val Gln Gly Trp Glu Thr Asp Gly Lys Arg Ala Asn Thr Lys Val35 40 45Met Asn Gln Ile Ala Ala Met Gly Ile Ala Glu His Ala Asp Trp His50 55 60Val Ala Val Arg Asp Val Glu Ser Ala Met Ala Ser Trp Thr Pro Asp65 70 75 80Ser Trp Thr Arg Ala Glu Ala Arg Gln Met Pro Gln Tyr Pro Asp Lys85 90 95Ser Ala Leu Asp Ala Ala Thr Arg Gln Leu Ser Ser Tyr Pro Pro Leu100 105 110Val Phe Ala Gly Glu Ala Arg Glu Leu Thr Thr Glu Leu Gly Lys Val115 120 125Ala Arg Gly Glu Ala Phe Leu Leu Gln Gly Gly Asp Cys Ala Glu Ser130 135 140Phe Ala Glu Phe His Pro Asn Asn Ile Arg Asp Thr Phe Arg Val Ile145 150 155 160Leu Gln Met Ala Val Val Leu Thr Phe Ala Ser Lys Leu Pro Thr Val165 170 175Lys Leu Gly Arg Met Ala Gly Gln Phe Ala Lys Pro Arg Ser Ala Asp180 185 190Thr Glu Val Ile Asp Gly Val Glu Leu Pro Ser Tyr Arg Gly Asp Asn195 200 205Val Asn Asp Ile Ala Phe Thr Pro Glu Ala Arg Ile Pro Asp Pro Gln210 215 220Arg Met Val Gln Gly Tyr Ser Gln Ser Ala Ala Thr Leu Asn Leu Leu225 230 235 240Arg Ala Phe Ala Gly Gly Gly Tyr Ala Asn Leu His Gln Val His Lys245 250 255Trp Thr Leu Asp Phe Met Gly Lys Ser Pro Trp Ser Ala Lys Phe Ala260 265 270Asp Val Ala Asp Arg Ile Gly Glu Ala Leu Asp Phe Met Glu Ala Cys275 280 285Gly Ile Asn Pro Asp Thr Val Pro Gln Leu Lys Gly Thr Ala Phe Tyr290 295 300Thr Ser His Glu Ala Leu Leu Leu Pro Tyr Glu Gln Ala Leu Thr Arg305 310 315 320Gln Asp Ser Leu Thr Gly Asp Trp Tyr Asp Thr Ser Ala His Phe Leu325 330 335Trp Ile Gly Asp Arg Thr Arg Phe Glu Gly Ser Ala His Val Glu Phe340 345 350Leu Arg Gly Ile Gly Asn Pro Ile Gly Met Lys Cys Gly Pro Ser Leu355 360 365Glu Pro Asp Ala Leu Leu Arg Leu Leu Asp Thr Leu Asn Pro Gly Arg370 375 380Val Pro Gly Arg Met Thr Leu Ile Thr Arg Tyr Gly His Asp Lys Ile385 390 395 400Glu Thr Gly Leu Pro Lys Leu Val Arg Ala Val Lys Arg Glu Gly His405 410 415
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<400>9atgatcgcaa gacgggtgcg gaccgagaat ttctcctcgc gcgcgcgatc ccagccctcg 60accaccgggg gctgcggcgt gggcagcggg gtcttgggaa aggcgatcgg cgtcgcgacc 120ggtccggcca cggcggtcgt caggtcggca tcggtcagcg gcgtgacgaa ttcgcagcca 180tag 183<210>10<211>105<212>DNA<213>Sphingomonas sp.
<400>10atgcccggcg gcgcgttgct cagcggagca gcgcgcccgc cagcgcccac aggccatagc 60cgagcacgaa caccagcatt caggcgatca ccgcgctgcc ggtga 105<210>11<211>1587<212>DNA<213>Sphingomonas sp.
<400>11atgacgacgt tagccggttc caagatccgc cagtatcgcg aagaacgcac cctcagccgc 60gccgccttcg gtgcctggtt cgacacgcca ggctctaccg tgcagggctg ggagaccgac 120ggcaagcgcg ccaataccaa ggtgatgaac cagattgcgg cgatgggaat cgccgagcat 180gcggactggc acgtcgccgt ccgcgacgtg gagagtgcaa tggcaagctg gacccccgat 240agctggacgc gcgccgaagc gcgccagatg ccacaatatc cggacaagag cgcgctcgac 300gccgccaccc ggcagctgag cagctatccg ccgctggtct tcgccggaga agcgcgcgag 360ctcaccaccg agctgggcaa ggtcgcgcgc ggcgaggcct tcctgctcca gggcggcgac 420
tgcgccgaga gcttcgccga gttccatccg aacaacatcc gcgacacctt ccgcgtgatc 480ctgcagatgg cggtggtcct caccttcgcc tcgaagctgc cgacggtgaa gctcggacgg 540atggccggcc agttcgccaa gccgcgctcg gccgataccg aggtgatcga cggtgtcgag 600ctgcccagct accgcggcga taacgtcaac gacatcgcct tcacgcccga ggcgcggatc 660cccgatccgc agcggatggt gcagggctac agccagtcgg cggcgacgct caatctgctg 720cgcgcctttg cgggtggcgg ctatgcgaac ctgcatcagg tgcacaagtg gacgcttgat 780ttcatgggca agagcccctg gtcggccaag ttcgccgatg tcgccgaccg gatcggcgag 840gcgctcgact tcatggaggc gtgcgggatc aaccccgata ccgtgccgca actgaagggc 900accgacttct acaccagcca cgaggcgctt ctgctcccct atgagcaggc gctgacccgg 960caggacagcc tgaccggcga ctggtacgat acctcggcgc acttcctgtg gatcggcgac 1020cgcacccgct tcgagggctc ggcgcatgtc gagttcctgc gcggcatcgg caatccgatc 1080gggatgaagt gcgggccgag cctcgagccc gacgcgctgc tgcggctgct cgacacgctc 1140aacccgggcc gcgtgcccgg ccgcatgacg ctgatcacgc gctatggcca cgacaagatc 1200gagacgggcc tgcccaagct ggtccgcgcg gtgaagcgcg agggccatcc ggtggtgtgg 1260agctgcgatc cgatgcacgg caacgtcgtc aaggccgcga acggctacaa gacgcggccg 1320ttcgaccgga tccttgccga ggtgcgcggc ttcttcgccg tccaccgcgc cgagggcacc 1380ttcgccggcg gcatccatgc cgagatgacc ggtcagaatg tgaccgagtg caccggcggc 1440gcgatcgcga tcaccgagca gggcctggcc gatcgctacc acacgcattg cgacccgcgg 1500ctcaacgcgg gtcagagcct ggagctggcc ttcctactcg ccgagatgct caacgacgaa 1560atggcggagc gtcgcaaggc cgccgcc 158权利要求
1.一种分离的核酸分子，包含在高度严格条件下与探针维持杂交的序列，其中所述探针由SEQ ID NO1或其互补序列组成。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码至少一种能够在鞘氨醇单胞菌种(Sphingomonas sp.)中改变外多糖生产的多肽。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述至少一种编码的多肽包含与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列。
4.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述至少一种编码的多肽包含带有保守性氨基酸替换的SEQ ID NO2的氨基酸序列。
5.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述至少一种多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述至少一种多肽由SEQID NO2的氨基酸组成。
7.一种分离的核酸分子，包含如SEQ ID NO1所述的核苷酸序列或其互补序列。
8.权利要求1-7任一项的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为DNA或RNA。
9.一种重组表达载体，包含至少一种与权利要求2的核酸分子可操作连接的启动子。
10.权利要求9的重组表达载体，其中所述至少一种多肽以融合蛋白表达，所述融合蛋白包含由第二核酸序列编码的多肽产物。
11.权利要求10的重组表达载体，其中所述第二核酸序列编码多肽标志或酶。
12.权利要求9的重组表达载体，其中所述启动子被调节。
13.权利要求9的重组表达载体，其中所述载体为质粒。
14.权利要求13的重组表达载体，其中所述质粒为X029(ATCCPTA-5127)。
15.一种重组表达载体，包括至少一种与核酸分子可操作连接的启动子，所述核酸分子包含如SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。
16.一种宿主细胞，包含权利要求9-15任一项的重组表达载体。
17.权利要求16的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核生物细胞。
18.权利要求17的宿主细胞，其中所述原核生物细胞为鞘氨醇单胞菌细胞。
19.权利要求16的宿主细胞，其中所述宿主细胞为产鞘氨醇胶的细菌。
20.权利要求18的宿主细胞，其中所述鞘氨醇单胞菌细胞能够生产选自结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，和NW11的鞘氨醇胶。
21.权利要求19或20的宿主细胞，其中所述鞘氨醇胶以荚膜或粘液形式生产。
22.权利要求19的宿主细胞，其中产鞘氨醇胶细菌为鞘氨醇单胞菌株系α252(ATCC PTA-5 128)，X287(ATCC PTA-3487)，X530(ATCCPTA-3486)，Z473(ATCC PTA-3485)，或X031(ATCC PTA-3488)。
23.权利要求16的宿主细胞，其中所述宿主细胞为产黄原胶细菌。
24.权利要求23的宿主细胞，其中产黄原胶细菌为黄单胞菌。
25.权利要求23的宿主细胞，其中产黄原胶细菌为黄单胞菌株系X59(ATCC55298)或X55(ATCC13951)。
26.权利要求16的宿主细胞，其中所述至少一种表达的多肽或融合蛋白改变外多糖生产在所述宿主细胞中的水平。
27.一种分离的细菌，甚至在表达由权利要求2-6任一项的核酸分子编码的多肽时，仍生产粘液形式的外多糖。
28.权利要求27的细菌，其中细菌为鞘氨醇单胞菌。
29.权利要求28的细菌，其中所述鞘氨醇单胞菌能够生产选自结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，和NW11的外多糖。
30.权利要求27的细菌，其中所述细菌为鞘氨醇单胞菌株系α062(ATCC PTA-4426)。
31.权利要求27的细菌，其中所述细菌为黄单胞菌。
32.权利要求31的细菌，其中所述细菌为黄单胞菌株系α449(ATCC PTA-5064)。
33.选自鞘氨醇单胞菌株系α062(ATCC PTA-4426)及其突变株或衍生物的分离的细菌，或其混合物，其中所述细菌在表达由权利要求2-6任一项的核酸分子编码的多肽时，仍能够生产粘液形式的外多糖。
34.选自黄单胞菌株系α449(ATCC PTA-5064)及其突变株或衍生物的分离的细菌，或其混合物，其中所述细菌甚至在表达由权利要求2-6任一项的核酸分子编码的多肽时，仍能够生产粘液形式的外多糖。
35.一种超生产外多糖的方法，包括在足以使细菌培养物中的外多糖生产的条件和时间下培养细菌，其中所述细菌甚至在表达由权利要求2-6任一项的核酸分子编码的多肽时，仍超生产粘液形式的外多糖；和从培养物中分离粘液形式的外多糖。
36.权利要求35的方法，其中所述细菌为鞘氨醇单胞菌。
37.权利要求36的方法，其中所述鞘氨醇单胞菌能够超生产选自结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，和NW11的外多糖。
38.权利要求35的方法，其中所述细菌为鞘氨醇单胞菌株系α062(ATCC PTA-4426)。
39.权利要求35的方法，其中所述细菌为黄单胞菌株系α449(ATCC PTA-5064)。
40.权利要求35-38任一项的方法，其中培养包括发酵。
41.权利要求40的方法，其中所述细菌生产约20g-约60g的外多糖/L培养物。
42.权利要求40的方法，其中发酵在约25℃-约35℃温度下进行约48小时-约96小时。
43.权利要求40的方法，其中分离外多糖包括醇沉淀。
44.权利要求43的方法，其中醇沉淀包括向培养物中添加约1-约1.5倍培养物体积的醇。
45.权利要求44的方法，其中发酵培养物的粘度为约15,000cp-约40,000cp。
46.能够超生产粘液形式的外多糖的细菌的制备方法，包括(A)在足以生产被诱变细菌的条件和时间下，使(a)诱变剂与(b)能够生产粘液形式的外多糖的细菌接触，其中所述细菌(i)含有重组表达载体，所述载体包括至少一种与编码至少一种多肽的核酸分子可操作连接的启动子，其中所述核酸分子为权利要求2-6任一项的核苷酸序列，以及(ii)表达(i)的所述至少一种多肽，以便外多糖生产被抑制；和(B)在所述被诱变细菌中鉴定一种或多种能够超生产粘液形式的外多糖的细菌。
47.权利要求46的方法，其中所述诱变剂为甲磺酸乙酯。
48.权利要求46的方法，其中所述细菌为鞘氨醇单胞菌。
49.权利要求48的方法，其中所述鞘氨醇单胞菌能够生产选自结冷胶，文莱胶，鼠李糖胶，diutan，alcalan，S7，S88，S198，和NW11的外多糖。
50.权利要求46的方法，其中所述细菌为黄单胞菌。
51.由权利要求46-49任一项的方法生产的细菌。
52.鞘氨醇单胞菌株系α062(ATCC PTA-4426)。
53.黄单胞菌株系α449(ATCC PTA-5064)。
全文摘要
本发明提供能够在鞘氨醇单胞菌中调节外多糖生产的核酸序列及其变体，以及提供利用所述核酸序列生成可超生产粘液形式的外多糖的细菌的方法。
文档编号C12P19/00GK101072873SQ20058002488
公开日2007年11月14日 申请日期2005年7月25日 优先权日2004年7月23日
发明者山崎元秀 申请人:信越化学工业株式会社