一种快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法
【专利摘要】本发明涉及油藏微生物菌种资源研究领域，具体为一种用于快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法。该方法主要步骤如下：取目标油藏采出液在模拟油藏温度下富集培养，对富集培养液进行平板划线或稀释涂布，获得单菌落；分别挑取不同形态的单菌落接种于装有发酵培养基的96孔板的小孔内，覆盖上无菌透气膜，置于培养箱中培养；用灭菌牙签挑取96孔内的发酵液，选取发酵液能拉丝的菌株进行扩大培养和粘度测定验证，获得油藏本源的聚合物产生菌。本发明方法是一种简便，快捷，高通量的筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，为油藏聚合物产生菌的资源研究奠定了方法基础。
【专利说明】
一种快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及油藏微生物菌种资源研究领域，具体为一种用于快速高通量筛选油藏 本源聚合物产生菌的方法。
【背景技术】
[0002] 聚合物可以调整油层的吸水剖面，控制高渗地层的流度比；还可以选择性封堵地 层，改善地层渗透率，增大扫油面积，并降低水油比。在水驱过程中，聚合物可以增加水相的 粘度，降低水相的流动性，减少指进，提高波及系数与扫油效率，从而提高采收率。目前，所 使用的聚丙烯酰胺等化学聚合物耐温抗盐性差，一般只适用于矿化度低、二价金属离子含 量少的油藏。生物聚合物与化学聚合物相比，在高盐度下仍保持较高的粘度，抗剪切能力 强，剪切力存在下分子结构不发生变化、剪切力消失后粘度具有可恢复性。
[0003] 微生物提高采油率因其潜力大、成本低、环境友好，有望成为油田高含水开发后期 的主力驱油技术之一。利用微生物代谢产生生物聚合物是微生物提高采油率的机理之一。 因此，筛选出适合于不同油藏的聚合物产生菌种资源，具有重要意义。但是，目前从油藏采 出液中筛选聚合物产生菌的方法，工作量大，筛选效率较低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种快速高通量筛选油藏本源聚合物产生的方法，解决现 有筛选方法工作量大、操作繁琐、筛选效率低等问题，采用该方法可以简单、快速地筛选获 得目标油藏本源聚合物产生菌种资源。
[0005] 本发明所提供的筛选油藏本源聚合物产生菌株的方法，具体步骤如下：
[0006] -种快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，1)目标油藏采出液先在模拟 油藏温度下富集培养，然后，对富集培养液进行平板划线或稀释涂布，获得单菌落;2)挑取 单菌落接种于装有发酵培养基的微生物培养板或细胞培养板的小孔内，在培养板上覆盖无 菌透气膜，进行培养;3)培养结束后，用灭菌牙签挑取细胞培养板板孔内的发酵液，选取发 酵液能拉丝的菌株即为潜在的油藏本源聚合物产生菌。
[0007] 步骤1)取目标油藏采出液加入到装有富集培养基的培养瓶中，在模拟油藏温度 下、160-200rpm/min，富集培养 2-4 天；
[0008] 目标油藏采出液与富集培养基体积比为2-6:100;
[0009] 富集培养基配方为：可溶性淀粉3〇-45g，NaN〇3 0.5-1.5g，KH2P〇4 0.5-1.5g，MgS〇4 0.25-0.75g，KCl l-1.5g，NaCl l-1.5g,酵母膏l-1.2g，去离子水 1L。
[0010] 步骤2)将富集培养后分离到的单菌落，分别接种于装有0.08-0.12ml发酵培养基 的微生物培养板或细胞培养板的小孔内中，并至少留下一孔不接种作为空白对照，并在培 养板上覆盖无菌透气膜;在模拟油藏温度下、160-200rpm/min，培养2-4天；
[0011] 发酵培养基配方为：可溶性淀粉30-45g，NaN03 0.5-1.5g，KH2P04 0.5-1.5g，K2HP〇4 0 · 5-1 · 5g，MgS〇4 0 · 25-0 · 75g，去离子水 1L。
[0012] 步骤3)取出培养后的微生物培养板或细胞培养板，在超净工作台中，用灭菌的牙 签搅拌后，逐一挑取培养板上各小孔内的发酵液，观察发酵液是否具有拉丝特性，发酵液能 拉出肉眼可见丝线的菌株，即为潜在的油藏本源聚合物产生菌。
[0013] 将油藏本源聚合物产生菌进行扩大培养和粘度测定验证，获得油藏本源的聚合物 产生菌:选取潜在的油藏本源聚合物产生菌（即培养板内发酵液能拉丝的菌株)接种于装有 发酵培养基的摇瓶中，挑取2-3接种环培养板内能拉丝的发酵液于70ml-100ml发酵培养基 中，在模拟油藏温度下、160-200rpm/min，进行扩大培养4-6天;然后，测定发酵液的粘度，进 一步验证菌株产胞外聚合物的能力，于35°C、粘度计转子转速为50rpm条件下，测定发酵液 粘度高于20(通常为20-8000)mpa · s的菌株即为最终获得的目的菌株。
[0014]利用旋转粘度计（如Brookfield博力飞粘度计)对潜在的聚合物产生菌的发酵液 进行粘度测定，待粘度计调零校正后，向粘度计的测量杯中加入70-100ml发酵液，启动粘度 计转子进行粘度检测，待读数稳定l〇min-15min以上后，读取粘度计所显示的数值作为发酵 液的粘度值。
[0015] 步骤2)挑取单菌落时，挑取尽可能多的不同形态的单菌落;而相同形态的单菌落 中挑取至少一个。
[0016] 可溶性淀粉为用大米、玉米、小米、土豆的淀粉制备的可溶性淀粉中的一种或二种 以上。
[0017]模拟油藏温度是指采出液的来源油藏的温度。
[0018] 模拟油藏温度为25-45Γ。
[0019] 微生物培养板或细胞培养板为96孔板
[0020] 本发明的有益效果：
[0021 ] 1)将96孔板加入到菌种筛选过程中，提高了筛选通量和速度。
[0022] 2)利用发酵液是否拉丝作为聚合物产生菌的筛选标准，简单实用，并且提高了筛 选效率。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例1高通量筛选聚合物产生菌的发酵液拉丝效果图。
【具体实施方式】
[0024] 1)培养基的制备：
[0025] 富集培养基的制备：用电子天平分别称量：40g可溶性淀粉，0.5g NaN03,0.5g KH2P〇4,0.25g MgS〇4，lg KCl，lg NaCl，lg酵母膏，在去离子水中混匀后使用容量瓶中定容 到1L，加氢氧化钠调节PH值至7.2，分装后于115°(：灭菌3〇1^11。
[0026] 发酵培养基的制备：用电子天平分别称量：40g可溶性淀粉，0.5g NaN03,0.5g KH2P〇4，0 · 5g K2HP〇4，0 · 25g MgS〇4，在去离子水中混匀后使用容量瓶中定容到1L，加氢氧化 钠调节PH值至7.2，分装后于115°(：灭菌3〇1^11。
[0027] LB培养基的制备：用电子天平分别称量：10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母膏，在去离 子水中混匀后使用容量瓶中定容到1L，加氢氧化钠调节PH值至7.2，分装后于121°C灭菌 20min〇
[0028] 2)油藏采出液的富集培养:在超净工作台中，取5ml油藏采出液加入到装有100ml 富集培养基的250ml三角瓶中。然后，在模拟油藏温度下、180rpm/min，培养3天。
[0029]富集培养基配方为：可溶性淀粉40g，NaN03 0.5g，KH2P〇4 0.5g，MgS〇4 0.25g，KCl lg，NaCl lg,酵母膏lg，去离子水定容1L。
[0030] 3)获得单菌落:用灭菌的接种环取一环富集培养液，在超净工作台中，划线到LB平 板上;将划线后的LB平板在恒温培养箱中于模拟油藏温度下倒置培养1天。
[0031 ] 4)单菌落的高通量培养:挑取菌落形态不同（东秀珠，蔡妙英等.2001.常见细菌系 统鉴定手册.科学出版社.北京.）的单菌落分别接种到每孔装有〇. lml发酵培养基的微生物 96孔培养板中，在恒温培养箱中于模拟油藏温度下培养3天。
[0032]发酵培养基配方为：可溶性淀粉40g，NaN03 0.5g，KH2P〇4 0.5g，K2HP〇4 0.5g，MgS〇4 0.25g，去离子水定容1L。
[0033] 5)发酵液拉丝法筛选具有聚合物产生潜力的菌株:将培养完成的96孔培养板放入 超净工作台中，用灭菌的牙签略作搅拌后，逐一挑取各个小孔内的发酵液，发酵液能拉出肉 眼可见丝线的菌株，为阳性菌株，记为"+" ；发酵液不能拉丝的菌株，记为。
[0034] 6)菌株产聚合物的验证：用接种环分别挑取5)中筛选出的阳性菌株的发酵液2-3 接种环接种到装有70ml-100ml发酵培养基的250ml摇瓶中。在模拟油藏温度下，180rpm/ min，培养5天。培养结束后，使用粘度计对菌株的发酵液进行粘度测定，验证该快速高通量 筛选方法的准确性，并最终获得油藏本源聚合物产生菌菌种资源。
[0035] 以下通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步具体的说明，但是本发明并 不限于如下实施例。
[0036] 实施例1:
[0037]应用本发明方法从某油田七中区油藏采出液中筛选聚合物产生菌，具体过程如 下：
[0038]在超净工作台中，取某油田的油藏采出液5ml，加入到装有100ml富集培养基的 250ml摇瓶中，并于39°C，180rpm/min的条件下，进行为期3天的富集培养。
[0039]用灭菌的接种环取一环富集培养液在LB平板上划线，平板在培养箱中经过24h培 养后，于超净工作台中，用灭菌牙签挑取平板上的93个单菌落接入每孔装有0. lml发酵培养 基的96孔板中，并覆盖透气膜，于39°C，180rpm/min的条件下，培养3天。其中，d5，d6，d7三个 孔为不接菌的对照。
[0040] 对各个小孔内的发酵液进行拉丝检测，筛选具有聚合物产生潜力的菌株，将培养 后的96孔板放入超净工作台中，轻轻揭开透气膜，记录下目标孔编号后，用灭菌的牙签略作 搅拌后挑取发酵液，能拉出肉眼可见丝线的发酵液，为阳性菌株，记为"+"。获得了 10株具有 聚合物产生潜力的菌株，结果如表1所不，编号分别为al，a8，a9，d2，dl2，e3，f5，gl，g3和 hl0〇
[0041] 用接种环分别挑取全部93个菌株的发酵液2接种环分别接种到装有70ml发酵培养 基的250ml摇瓶中，于39°C，180rpm/min的条件下，培养5天。培养结束后，测定发酵液粘度， 对阳性菌株的产聚合物能力进一步验证，获得某油藏本源的聚合物产生菌。为了验证发明 方法的可靠性，结果为阴性的菌株，在此也进行了扩大培养和粘度检测，实际应用时可不做 此步。各个菌株发酵液相应的粘度值如表1所示。
[0042]实施例1的结果(如表1所示)表明，发酵液拉丝结果为阴性的菌株，后期扩大培养， 检测其发酵液的粘度与不接菌的对照发酵液类似，均小于2mpa · s;而阳性菌株，后期扩大 培养，检测其发酵液的粘度在36.7-2384mpa · s之间，证明了此方法作为聚合物产生菌筛选 方法的可靠性。在96孔板中，除去d5，d6，d7三个不接菌的对照，对93个菌株通过发酵液拉丝 检测，可以排除83个阴性菌株，只需对10个阳性菌株进行下一步的扩大培养，粘度测定验证 表明，10个阳性菌株均为聚合物产生，充分显示出了该快速高通量筛选方法的高效性和可 靠性。
[0043]表1:某油田七中区油藏采出液中聚合物产生菌筛选结果 [0044]
[0045]
[0046] 实施例2:
[0047] 应用本发明方法从某油田采油二厂油藏采出液中筛选聚合物产生菌，
[0048] 具体过程如下：
[0049]在超净工作台中，取油藏采出液5ml，加入到装有100ml富集培养基的250ml摇瓶 中，并于45°C，180rpm/min的条件下，进行为期3天的富集培养。
[0050]用灭菌的接种环取一环富集培养液在LB平板上划线，平板在培养箱中经过24h培 养后，于超净工作台中，用灭菌牙签挑取平板上的单菌落接入每孔装有〇. lml发酵培养基的 96孔板中，并覆盖透气膜，于45°C，180rpm/min的条件下，培养3天。其中，hlO，hll，hl2Sf 孔为不接菌的对照。
[0051 ]对各个小孔内的发酵液进行拉丝检测，筛选具有聚合物产生潜力的菌株，将培养 后的96孔板放入超净工作台中，轻轻揭开透气膜，记录下目标孔编号后，用灭菌的牙签略作 搅拌后挑取发酵液，能拉出肉眼可见丝线的发酵液，为阳性菌株，记为"+"。获得了 8株具有 聚合物产生潜力的菌株，结果如表2所不，编号分别为b2，b6，b7，d4，d8，el，g4和g9。
[0052] 用接种环分别挑取8个阳性菌株的发酵液2接种环分别接种到装有100ml发酵培养 基的250ml摇瓶中。于45°C，180rpm/min的条件下，培养5天。培养结束后，测定发酵液粘度， 对阳性菌株的产聚合物能力进一步验证，获得某油藏本源的聚合物产生菌。8个菌株发酵液 相应的粘度值如表2所示。
[0053] 结果表明，经96孔板培养，发酵液拉丝检测后，筛到8株阳性菌，经扩大培养后，测 定发酵液粘度为68-1672mpa · s，即8株菌均为聚合物产生菌。
[0054]表2:某油田采油二厂油藏采出液中聚合物产生菌筛选结果 [0055]
[0056]
[0057] 本发明方法是一种简便，快捷，高通量的筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，为油 藏聚合物产生菌的资源研究奠定了方法基础。
【主权项】
1. 一种快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在于：1)目标油藏采出 液先在模拟油藏温度下富集培养，然后，对富集培养液进行平板划线或稀释涂布，获得单菌 落;2)挑取单菌落接种于装有发酵培养基的微生物培养板或细胞培养板的小孔内，在培养 板上覆盖无菌透气膜，进行培养;3)培养结束后，用灭菌牙签挑取细胞培养板板孔内的发酵 液，选取发酵液能拉丝的菌株即为潜在的油藏本源聚合物产生菌。2. 按照权利要求1所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在于： 步骤1)取目标油藏采出液加入到装有富集培养基的培养瓶中，在模拟油藏温度下、160-200rpm/min，富集培养2-4天； 目标油藏采出液与富集培养基体积比为2-6:100; 富集培养基配方为：可溶性淀粉30_45g，NaN03 0.5-1.5g，KH2P〇4 0.5-1.5g，MgS〇4 0.25-0.75g，KCl l-1.5g，NaCl l-1.5g,酵母膏l-1.2g，去离子水 1L。3. 按照权利要求1所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在于： 步骤2)将富集培养后分离到的单菌落，分别接种于装有0.08-0.12ml发酵培养基的微生物 培养板或细胞培养板的小孔内中，并至少留下一孔不接种作为空白对照，并在培养板上覆 盖无菌透气膜;在模拟油藏温度下、160-200rpm/min，培养2-4天； 发酵培养基配方为:可溶性淀粉3〇-458，恥勵30.5-1.58，1012?〇4〇.5-1.58，1( 2册〇4〇.5-1.5g，MgS〇4 0.25-0.75g，去离子水 1L。4. 按照权利要求1所述的高快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在 于:步骤3)取出培养后的微生物培养板或细胞培养板，在超净工作台中，用灭菌的牙签搅拌 后，逐一挑取培养板上各小孔内的发酵液，观察发酵液是否具有拉丝特性，发酵液能拉出肉 眼可见丝线的菌株，即为潜在的油藏本源聚合物产生菌。5. 按照权利要求1所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在于： 将油藏本源聚合物产生菌进行扩大培养和粘度测定验证，获得油藏本源的聚合物产生 菌:选取潜在的油藏本源聚合物产生菌（即培养板内发酵液能拉丝的菌株)接种于装有发酵 培养基的摇瓶中，挑取2-3接种环培养板内能拉丝的发酵液于70ml-100ml发酵培养基中，在 模拟油藏温度下、160-200rpm/min，进行扩大培养4-6天;然后，测定发酵液的粘度，进一步 验证菌株产胞外聚合物的能力，于35°C、粘度计转子转速为50rpm条件下，测定发酵液粘度 高于20mpa · s的菌株即为最终获得的目的菌株。6. 按照权利要求5所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在于： 利用旋转粘度计对潜在的聚合物产生菌的发酵液进行粘度测定，待粘度计调零校正后，向 粘度计的测量杯中加入7 0 -10 0 m 1发酵液，启动粘度计转子进行粘度检测，待读数稳定 10min-15min以上后，读取粘度计所显示的数值作为发酵液的粘度值。7. 按照权利要求1所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在于： 步骤2)挑取单菌落时，挑取尽可能多的不同形态的单菌落;而相同形态的单菌落中挑 取至少一个。8. 按照权利要求2或3所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特征在 于： 可溶性淀粉为用大米、玉米、小米、土豆的淀粉制备的可溶性淀粉中的一种或二种以 上。9. 按照权利要求1、2、3或5所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其特 征在于:模拟油藏温度是指采出液的来源油藏的温度。10. 按照权利要求1、2、3或5所述的快速高通量筛选油藏本源聚合物产生菌的方法，其 特征在于:模拟油藏温度为25-45Γ。
【文档编号】C12N1/02GK106085862SQ201610398618
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】张颖, 郭超, 赵峰, 史荣久, 崔庆锋, 韩斯琴
【申请人】中国科学院沈阳应用生态研究所, 中国石油天然气股份有限公司勘探开发研究院廊坊分院