流感血凝素组合物及其用途的制作方法

专利名称：流感血凝素组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学、公共健康、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供用于治疗、改善和/或预防流感的組合物、疫苗组合物和药物组合物。本发明的組合物、疫苗组合物和药物组合物包含RNA噬菌体的病毒样颗粒和至少ー种抗原，其中所述至少ー种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段。当施用于动物，优选人吋，所述组合物、疫苗组合物和药物组合物有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答，其中典型地和优选地，所述抗体应答针对流感病毒。因此，本发明还提供治疗、改善和/ 或预防流感病毒感染的方法。
背景技术：
由于禽流感病毒或猪病毒的流行性传播的可能性，高致病性禽流感病毒在家禽中的出现和不同亚型的禽流感病毒或猪病毒传染到人以及这些病毒随后在人群中直接传播的的病例数不断增加对公众健康造成重大威胁(Subbarao等，2007，Nature reviews 7 267-278)。存在三种类型的流感病毒A、B和C型流感。B型流感病毒几乎只感染人，且仅含有主要表面糖蛋白(血凝素(HA)和神经氨糖酸苷酶(NA))中的ー种。根据其主要表面糖蛋白(血凝素(HA)和神经氨糖酸苷酶(NA))的遗传性和抗原性的差异，A型流感病毒分为不同的亚型(Wright等，2001，Fields Virology 4th edn. ；Eds Knipe D. Μ. & Howley，P. Μ. 1533-1579)。已知至少有16种不同的HA抗原。这些亚型命名为 Hl 至Ij Η16。HA蛋白介导病毒附着于宿主細胞和病毒侵入細胞的細胞溶质过程中病毒-細胞膜的融合。流感病毒基因组由八个单链的负链RNA片段组成，其中第四大片段编码HA蛋白。流感HA是同源三聚体的整合膜糖蛋白，其存在于病毒粒子的表面上和受感染細胞上。HA蛋白通过跨膜区锚定在膜上，所述跨膜区是三个单体中各単体的跨越序列 (spanning sequence)。流感疫苗的主要保护性效力归因于抑制附着从而抑制細胞感染的抗血凝素抗体(Virelizier J. L.，1975 J. Immunol. 115 :434-439)。病毒附着的抑制保护个体抵抗感染或严重疾病。保护程度和抗-HA滴度的大小相关。HA糖蛋白合成为HAO前体， 其经翻译后切割成HAl和HA2亚基。这种切割在融合肽的N-末端发生，且对融合的发生是必不可少的(Steinhauer D. A. 1999 Virology 258:1-20)。融合过程要求HA形成同源三聚体(Danieli等，1996 J. Cell Biol. 133 :559-569)。流感病毒按照包括类型、地理来源、 株号、分离年份及HA和NA亚型的系统命名法进行描述，例如A/California/04/09 (HlNl) 来描述。已知至少有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(m_N9) (Murphy and Webster, " Orthomyxoviruses ‘ , in Virology, ed. Fields, B. N. , Knipe, D. Μ. ,Chanock, R. M. ,1091-1152 (Raven Press,New York 1990))。已经在感染人的A型流感病毒中鉴别出 16 种 HA 亚型中的六种，H1、H2、H3、H5、H7 和 H9(Cox 等，2003 Scandanavian J. of Immun. 59 1-15)。
针对HA的抗体可以中和流感病毒感染，并且是抗流感的自然免疫的基础 (し丄ements， “ influenza Vaccines“ ，in Vaccines :New Approaches to immunological Problems，ed. Ronald W.Eilis，pp. 129-150 (Butterworth-Heinemann，Stoneham， Mass. 1992)。HA分子内的抗原性变异导致流感的频繁爆发和通过接种控制感染的局限性。 流感病毒的HA部分是保护性免疫反应的靶标，且可由于抗原性漂移和抗原性转变而变化。抗原性漂移是指通过包含产生主要表面蛋白(血凝素和神经氨糖酸苷酶)的遗传物质的两种基因中的点突变而发生的小的、逐渐的变化。这些点突变不可预测地发生，并导致这些表面蛋白的微小变化。抗原性漂移产生可能不会被针对先前的流感病毒株的抗体识别的新病毒株。这是为什么人可以不止一次被流感病毒感染以及为什么全球性监测对于监控人流感病毒染色的进化从而选择应该包括在流感疫苗的年度生产中的那些病毒株非常关键的主要理由之一。在大多数年份中，流感疫苗中的三种病毒株的一种或两种进行更新以跟上流行的流感病毒的变化。为此，想要进行抗流感免疫的人们需要每年进行接种 (しenter ior Disease control and Prevention Subbarao 等，2007 Nature reviews 7: 沈7-278)。抗原性转变是A型流感病毒中观察到的现象。它是指产生目前不在人群中流行的新型的人A型流感病毒亚型的突然的、重大的变化。抗原性转变也可以通过直接的动物-人传播或通过混合人A型流感病毒和动物A型流感病毒基因以生成新的人A型流感亚型病毒(通过称为基因重整的过程)而发生。如果遇到以下三种情況，则可发生全球性的流感大流行(世界范围的传播)(i)A型流感病毒的新亚型被引入人群中；(ii)所述病毒引起人的重病；(iii)所述病毒可以很容易地以持续的方式在人和人之间传播。大多数市售流感疫苗在含胚的鸡蛋中制备。使用鸡蛋产生毎年的流感疫苗有着若干公知的缺点，特别是不能响应于流行病学的或流行性的状况快速地制备出疫苗。已经研究了基于抗原的重组表达的方法作为新的流感疫苗的替代品。在这些疫苗中，蛋白质抗原在原核和真核表达系统例如大肠杆菌、酵母、昆虫細胞和哺乳动物细胞中产生。用于流感的重组亚基疫苗的开发是有吸引力的选项，因为避免了培养病毒的需要。两个主要的问题阻碍了重组流感蛋白质的开发。一方面是低的表达水平，另一方面是在原核細胞中难于表达具有天然构象的蛋白质。例如，HA(流感疫苗的主要成分)被证实难以重组表达。已经报道了毕赤酵母中无锚定膜HA分子的表达(Saelens等，1999 Eur. J. Biochem. 260 :166-175)。在另ー项研究中，Mc Ewen 等(1992 Vaccine ；10 :405-411)证明，克隆到沙门氏菌的鞭毛蛋白基因中的包含H3亚型流感病毒HA分子的18个氨基酸残基表位的合成肽能够在肺中诱导局部IgA，并在小鼠模型中提供抗流感病毒激发的部分保护。 类似地，Jeon等Q002 Viral Immunology 15 165-176)报道，基于肺组织勻浆的红血球凝集分析，用蛋白片段HA91-261免疫的小鼠诱导出抗病毒激发的明显保护作用。kng等 (2008 PLoS one 3 :e2257)制备了其中HA抗原的球形头结构域和有效的TLR5配体鞭毛蛋白融合的疫苗。发明简述本发明的主要方面涉及组合物，其包含(a)病毒样颗粒(VLP)，其具有至少ー个第一附着位点，其中优选地所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；和(b)至少ー种抗原，其具有至少ー个第二附着位点，其中所述至少ー种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；且其中(a)和(b)通过所述至少ー个第一附着位点和所述至少ー个第二附着位点连接。目前，令人惊异的是我们已经发现本发明的組合物能够诱导免疫应答，特别是抗体应答，从而导致在流感动物模型中对抗流感病毒的致死性激发的高抗体滴度。发明详述佐剂本发明使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物或允许在宿主中产生储存的物质，当与本发明的疫苗组合物或药物组合物结合吋，其提供比単独的所述疫苗组合物或药物组合物所提供的增强的免疫应答。佐剂包括(a)矿物凝胶，优选氢氧化铝；(b)表面活性物质，包括溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、 肽、油状乳液、钥孔帽贝血蓝蛋白或ニ硝基酚；和(c)人佐剂，优选BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。佐剂还包括完全和不完全弗氏佐剂、改性的胞壁酰ニ肽、单磷酰基脂质免疫调节齐[J、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、MF-59、OM-174, 0M-197、0M-294 和病毒体 (virosomal)佐剂技木。优选的佐剂是含铝佐剂，优选铝盐，最优选氢氧化铝(Alum)。术语佐剂也包括这些物质的混合物。通常VLP描述为佐剂。然而，本申请上下文内使用的术语 “佐剂”是指本发明组合物、疫苗组合物和/或药物组合物包含的非VLP的佐剂。相反，术语佐剂涉及所述组合物、疫苗组合物和/或药物组合物的附加的不同组分。抗原如本发明所使用的，术语“抗原”是指如果经MHC分子呈递，能够被抗体或 T-细胞受体(TCR)结合的分子。本发明所使用的术语“抗原”也指T-細胞表位。抗原还能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或細胞免疫应答，从而导致B-和/或 T-淋巴細胞的激活。然而，至少在某些情况下，这可能要求所述抗原包含Th細胞表位或与 Th細胞表位连接和/或在佐剂中给出。抗原可以有ー个或多个表位(B-和T-表位)。上述的特异性反应意指所述抗原优选与其相应抗体或TCR反应(通常以高选择性的方式)，而不与可能由其他抗原引起的众多其他抗体或TCR反应。除非另有说明，本发明所使用的术语“抗原”不涉及包含于本发明組合物、疫苗组合物和/或药物组合物中的病毒样颗粒。“相应的”氨基酸位置(H3编号)流感病毒血凝素蛋白的HAl和HA2亚基的氨基酸序列是高度可变的。因此，这些亚基的氨基酸位置通常不直接编定，而是将它们映射至流感病毒參照株的HAl和HA2亚基氨基酸序列的氨基酸位置上，优选通过结构比对。通常用于本领域中且也用于本发明中的參照株是人A型流感病毒H31968 (Wi 1 son等1981，Nature 289 :366-373)。因此，优选通过结构比对，血凝素HAl亚基的氨基酸位置映射到人A型流感病毒H3 1968的HAl亚基(SEQ ID NO :7 上，且血凝素HA2亚基的氨基酸位置映射到人A 型流感病毒H31 968的HA2亚基(SEQ ID NO 76)上。因此所得到的氨基酸位置的编号系统通常称为“H3编号”。典型地且优选地，所述结构比对基于晶体结构数据进行。可获得亚型 Hl (Gamblin 等，2004 Science 303 :1838-1842 以及本发明引用的參考文献)、H3 (Wilson
1981, Nature 289 :366-373)、H5 Gtevens 等，2006，kience 312:404-410)的晶体结构数据。不能获得晶体结构的HA亚型的结构信息可通过基于氨基酸序列的结构模型构建获得。出于本发明的目的，结构模型构建优选通过软件SWISS-MODEL进行。产生基于结构数据的比对的工具和算法是本领域技术人员容易获得的(例如Weis WI等，1990，Refinement of the influenza virus hemagglutinin by simulated annealing. J Mol Biol. 1990Apr 20 ；212 (4) :737-61.)。典型地且优选地，A型流感病毒亚型HI、H2、H3、H5和H9的给定HAl或HA2亚基的氨基酸位置的映射基于Mevens等2004 (Science 303 1866-1870， supplemental online materials,Figure Si)提供的比对。B型流感病毒血凝素的结构从 Wang等，2008 (J.Virol，p. 3011-3020)得知。典型地且优选地，给定的B型流感病毒血凝素 HAl亚基的氨基酸位置的H3映射基于Tung等，2004 (J Gen Virol. 85 :3249-59)提供的比对。当给定的氨基酸序列可以映射(即结构上对准)參照氨基酸序列的连续部分(其中所述连续部分由特定氨基酸位置定义)时，则所述给定的氨基酸序列被称为对应于所述參照氨基酸序列上的所述氨基酸位置。典型地且优选地，对应于參照氨基酸序列上的特定氨基酸位置的给定氨基酸序列不包括不能映射到參照氨基酸序列上的任何侧翼序列。因此，术语“对应于SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸的氨基酸序列”、“对应于SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸的氨基酸序列”、“对应于SEQ ID NO 76的1位到176 位的氨基酸序列”或类似的表述例如“对应于由SEQ ID NO 75的115位到261位組成的氨基酸序列的氨基酸序列”是指可以映射(即结构上对准)至由所述位置号定义的參照氨基酸序列的连续片段的氨基酸序列。 流感病毒血凝素蛋白的胞外域(HA胞外域)如本发明所使用的，术语“流感病毒血凝素蛋白的胞外域” (HA胞外域)是指⑴蛋白质，其中所述蛋白质由以下亚基组成(a) 包含SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸或优选由其组成的HAl亚基，和(b)由 SEQ ID NO 76的1位到176位组成HA2亚基，和(ii)与其具有至少70%、优选至少80%、 更优选至少80 %、再更优选至少85 %、再更优选至少90 %、再更优选至少95 %、再更优选至少96%、再更优选至少97%、再更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列同一性的任何蛋白质，其中更优选地，所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。术语“流感病毒血凝素蛋白的胞外域”优选是指选自下组的蛋白质(i)由(a)由SEQ ID NO :75的11位氨基酸到3 位氨基酸组成的HAl亚基和(b)由SEQ ID NO 76的1位到176位组成的HA2亚基构成的蛋白质；(ii)由(a)由SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸组成的HAl亚基和(b)由SEQ ID NO 76的1位到176位组成的HA2亚基构成的蛋白质；(iii)由(a)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HAl亚基和(b)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HA2亚基构成的蛋白质，其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HAl亚基由对应于SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸的氨基酸序列組成，和其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HA2亚基由对应于SEQ ID NO 76的1位到176位氨基酸的氨基酸序列組成；(iv)由(a)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HAl亚基和(b)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HA2亚基构成的蛋白质，其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HAl亚基由对应于SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸的氨基酸序列組成，和其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HA2亚基由对应于SEQ ID NO 76的1位到176位氨基酸的氨基酸序列組成；和(ν)与⑴、(ii)、(iii)或(iv)所定义的任何ー种蛋白质具有至少70 %、优选至少80 %、更优选至少80 %、再更优选至少85 %、再更优选至少 90 %、再更优选至少95 %、再更优选至少96 %、再更优选至少97 %、再更优选至少98 %和最优选至少99%的氨基酸序列同一性的蛋白质，其中更优选地，所述HA胞外域是天然存在的 HA胞外域。在本发明的HA胞外域中，所述HAl亚基(a)典型地且优选地经由至少ー个，优选经由ー个或两个，共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中优选所述共价键选自肽键和ニ硫键。非常优选地，所述HAl亚基(a)经由至少ー个，优选经由ー个或两个，共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中至少ー个所述共价键是ニ硫键。非常优选地，所述HAl亚基(a)通过遗传方式与所述HA2亚基(b)的N末端融合，其中所述HAl亚基(a)进ー步通过至少一个，优选ー个，ニ硫键与所述HA2亚基(b)结合。应理解，在本发明的某些实施方式中，所述HAl和所述HA2亚基之间的肽键可在融合产物成熟过程中被切割，其中所述ニ硫键保持完整。因此，所述HAl亚基(a)优选恰好经由ー个共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中所述共价键是ニ硫键。然而，本发明也包括HA胞外域是HAl和HA2的融合产物而其中所述HAl和所述 HA2亚基之间的肽键保持完整的情況。因此，在本发明的更优选的HA胞外域中，所述HAl亚基(a)通过遗传方式与所述HA2亚基(b)的N末端融合，其中所述HAl亚基(a)通过ー个第一共价键和通过至少ー个，优选ー个，第二共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中所述第一共价键是肽键和其中所述至少ー个第二共价键是ニ硫键。“天然存在”对于流感病毒或相对于流感病毒株来说，术语“天然存在”是指存在于天然宿主群体，优选人群，中的流感病毒或流感病毒株。典型地且优选地，天然存在的流感病毒或流感病毒株从所述群体的被感染个体分离。对于流感病毒血凝素蛋白或对于HA 胞外域而言，术语“天然存在”是指天然存在的流感病毒或天然存在的流感病毒株的流感病毒血凝素蛋白或HA胞外域。所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段如本发明所使用的，术语“所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段”是指流感病毒血凝素蛋白的一部分，且包含A或B型流感病毒的流感病毒血凝素蛋白胞外域，优选流感病毒血凝素蛋白胞外域的HAl亚基的至少80个、或至少100个、或至少150个、或至少180个、或至少190个、或至少200个、或至少210个、或至少220个、或至少230个、或至少250个、或至少270个、或至少290个、或至少310个或至少320个连续氨基酸。术语所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段也包括流感病毒血凝素蛋白的部分，其中所述片段通过所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的N和/或C末端的一个或更多个氨基酸的缺失来衍生。所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段优选包含其ニ级结构的特定元件。基于可从现有技术获得的结构数据，本领域技术人员可很容易地确认这种结构元件。在非常优选的实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含流感病毒血凝素蛋白的至少ー个八链的胶冻卷桶(Jelly roll barrel)和至少ー个α-螺旋。在优选实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含受体结合域或优选由受体结合域組成。在进ー步的优选实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段还包含痕迹酯酶域。典型地且优选地，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含至少ー对和至多四对能形成分子内ニ硫键的半胱氨酸残基。更优选地，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含两对能形成分子内ニ硫键的半胱氨酸残基。优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段通过在真核或原核表达系统中，优选原核表达系统中，最优选大肠杆菌中的重组表达获得。典型地且优选地，当与本发明的病毒样颗粒结合时，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段能够诱导红血球的红血球凝集，其中所述红血球优选来源于鸡、火鸡、马或人类。因此当在0. 50μ g或更低的偶联物/1 μ 1的红血球的浓度下观察到红血球凝集吋，与本发明病毒样颗粒结合的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段被认为能够诱导红血球的红血球凝集。因此红血球凝集试验优选按照实施例35所描写的进行。所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的HAl亚基的5 位A或B型流感病毒的天然存在的氨基酸序列可以具有异源氨基酸残基的插入。例如，位置“Ma”是指如Russell等， 2004 (Virology 325 =287-296)的

图1所描述的插入。因此，对于A型流感病毒亚型Hl，5 位的氨基酸是赖氨酸。结合本发明所使用的术语“结合的”或“结合”是指化学和/或物理相互作用，两个分子通过该作用连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。优选的非共价相互作用是离子相互作用、疏水相互作用或氢键。优选的共价相互作用是共价键，最优选酯键、醚键、磷酯键、酰胺键、肽键、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。附着位点，第一如本发明所使用的，“第一附着位点”是指VLP天然存在的或人工添加到VLP上的，且第二附着位点可以连接至其上的元件。优选第一附着位点包含化学反应性基团或者是化学反应性基团，优选氨基、羧基、巯基、羟基、胍基(gimnidinyl)、组氨基或其組合。非常优选地，所述第一附着位点包含氨基或者是氨基。因此，术语第一附着位点也包括蛋白质、多肽、肽以及优选氨基酸残基。术语第一附着位点还包括其他的反应化学残基，包括糖、生物素、荧光素、视黄醇和洋地黄毒甙。在优选实施方式中，所述第一附着位点是化学反应性基团，优选氨基酸残基的氨基，最优选赖氨酸残基的氨基。在进ー步的优选实施方式中，所述第一附着位点是氨基或羧基，优选氨基酸残基的氨基或羧基。优选所述第一附着位点位于VLP的表面上，最优选位于VLP的外表面上。另外优选地，多个第一附着位点存在于VLP的表面上，优选存在于VLP的外表面上，典型地且优选地以重复构型存在。在优选的实施方式中，所述第一附着位点通过至少一个共价键，优选通过至少ー个肽键与VLP 结合。在进ー步的优选实施方式中，所述第一附着位点天然存在于VLP。在非常优选的实施方式中，所述第一附着位点是VLP包含的蛋白质的氨基酸残基的氨基，其中更优选所述第一附着位点是VLP蛋白包含的赖氨酸残基的氨基。在还进一歩的优选实施方式中，所述第一附着位点是VLP包含的外壳蛋白的氨基酸残基的氨基，其中更优选所述第一附着位点是 VLP的外壳蛋白包含的赖氨酸残基的氨基。或者，在优选实施方式中，所述第一附着位点是人工添加到VLP上的。附着位点，第二如本发明所使用的，“第二附着位点”是指抗原天然存在的或人工加到抗原上的，且第一附着位点可以连接至其上的元件。所述抗原的第二附着位点优选是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖或化学反应性基团，例如氨基、羧基或巯基。在优选实施方式中，所述第二附着位点是化学反应性基团，优选氨基酸的化学反应性基团。在非常优选的实施方式中，所述第二附着位点是巯基，优选氨基酸的巯基，最优选半胱氨酸残基的巯基。在进ー步的优选实施方式中，所述第二附着位点是氨基或羧基，优选氨基酸残基的氨基或羧基。因此，术语“具有至少ー个第二附着位点的抗原”是指含有抗原和至少ー个第二附着位点的构造体。在一个实施方式中，所述第二附着位点是抗原内天然存在的。在另ー个实施方式中，所述第二附着位点(优选通过接头)人工添加到所述抗原上。因此，具有至少ー个第二附着位点的抗原(其中所述第二附着位点不是天然存在于所述抗原内的)典型地且优选地还包含“接头”。在优选实施方式中，所述第二附着位点通过至少一个共价键，优选通过至少ー个肽键与所述抗原结合。接头本发明所使用的“接头”或者将所述第二附着位点与抗原结合，或者其包含第二附着位点、基本上由第二附着位点組成或由第二附着位点組成。优选地，所述“接头” 包含第二附着位点或由第二附着位点組成，其中更优选所述第二附着位点是ー个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。含有至少ー个氨基酸残基的接头也称为氨基酸接头。在非常优选的实施方式中，所述接头是氨基酸接头，其中优选所述氨基酸接头仅由氨基酸残基組成。本发明接头的进一步优选的实施方式是包含巯基或半胱氨酸残基的分子。接头与抗原的结合优选借助于至少一个共价键，更优选借助于至少ー个肽键。在VLP和抗原通过基因融合连接的情况中，接头可以不存在或者优选是氨基酸接头，更优选仅由氨基酸残基組成的氨基酸接头。有序和重复的抗原阵列如本发明所使用的，术语“有序和重复的抗原阵列，，是指抗原的重复模式。有序和重复的抗原阵列的特征在于相对于病毒样颗粒抗原在空间排列上的一般和优选的高度均勻性。在本发明的一个实施方式中，重复模式是几何模式。优选的有序和重复的抗原阵列由与RNA噬菌体的VLP偶联的抗原形成。有序和重复的抗原阵列由通过与RNA噬菌体的VLP接合的抗原形成的有序和重复的抗原阵列典型地且优选地具有抗原的严格重复的拟晶体秩序，优选具有1到30纳米，优选2到15纳米，更优选2到10纳米， 还更优选2到8纳米和再更优选1. 6到7纳米的间隔。多肽本发明所使用的术语“多肽”是指通过酰胺键(又名肽键)线性连接的単体 (氨基酸)組成的分子。它表示氨基酸的分子链，且不涉及产物的特定长度。因此，肽、ニ 肽、三肽、寡肽和蛋白质也包括在多肽的定义中。多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、 磷酸化等也包括在内。序列同一性(氨基酸序列)两个给定的氨基酸序列之间的序列同一性百分比通过任何标准算法确定，优选通过Bestfit程序中实施的算法确定。典型地且优选地应用所述算法的缺省參数设置，优选Bestfit算法的缺省參数设置。该方法适用于确定本发明公开的任何蛋白质、多肽或其片段的氨基酸序列之间的序列同一性。外壳蛋白术语“外壳蛋白”是指病毒蛋白，优选指病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚基，其能够结合入病毒衣壳或VLP中。术语外壳蛋白包括天然存在的外壳蛋白以及重组表达的外壳蛋白。还包括外壳蛋白的突变体和片段，其中所述突变体和片段保持形成VLP的能力。病毒样颗粒(VLP)如本发明所使用的，其是指非复制性的或非感染性的，优选非复制性和非感染性的病毒颗粒，或是指非复制性的或非感染性的，优选非复制性和非感染性的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣売。本发明所使用的术语“非复制性的”是指不能复制VLP所包含的基因組。本发明所使用的术语“非感染性的”是指不能进入宿主細胞。优选地，本发明的病毒样颗粒是非复制性的和/或非感染性的，因为它缺少全部或部分病毒基因组或基因组功能。在一个实施方式中，病毒样颗粒是病毒颗粒，其中病毒基因组已被物理或化学地灭活。通常且更优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和感染性组分。本发明的病毒样颗粒可以包含明显不同于其基因组的核酸。本发明病毒样颗粒的典型和优选的实施方式是病毒衣売，例如相应病毒、噬菌体(优选RNA噬菌体)的病毒衣売。术语“病毒衣売”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚基组成的高分子装配体，其中优选所述病毒蛋白亚基是所述病毒的外壳蛋白。通常，存在60、120、180、240、300、360和超过360个病毒蛋白亚基，优选外壳蛋白亚基。典型地且优选地，这些亚基的相互作用导致形成具有固有的重复性组织的病毒衣売，其中所述结构通常是球形或管形的。例如，RNA噬菌体的衣壳具有二十面体対称的球形形状。病毒样颗粒的一个特征是其亚基的高度有序的和重复性的排列。RNA噬菌体的病毒样颗粒如本发明所使用的，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指含有RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段、优选基本上由其組成或由其組成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，是非复制性的和/或非感染性的，且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的ー个或多个基因，且通常也缺少编码负责使病毒附着于宿主或进入宿主的ー种或多种蛋白的ー个或多个基因。该定义也包括 RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中上述ー个或多个基因仍然存在但是是失活的，并因此也导致 RNA噬菌体的非复制性的和/或非感染性的病毒样颗粒。来源于RNA噬菌体的优选VLP显示二十面体対称性且由180个亚基(単体)組成。使RNA噬菌体的病毒样颗粒具有非复制性和/或非感染性的优选方法是通过物理、化学灭活，例如UV照射、甲醛处理，典型地且优选地通过遗传学操作。重组VLP 本发明所使用的术语“重组VLP”是指通过包括至少ー个重组DNA技术的步骤的方法获得的VLP。典型地且优选地，重组VLP通过在宿主中，优选细菌细胞中的重组病毒外壳蛋白的表达而获得。免疫刺激核酸如本发明所使用的，术语免疫刺激核酸是指能够诱导和/或增强免疫反应的核酸。免疫刺激核酸包括核糖核酸和特別是脱氧核糖核酸，当核糖核酸和脱氧核糖核酸两者可以是双链或单链的。优选的ISS-NA是脱氧核糖核酸，其中更优选所述脱氧核糖核酸是单链的。优选地，免疫刺激核酸包含至少ー个含有非甲基化C的CpG基序。非常优选的免疫刺激核酸包含至少ー个CpG基序，其中所述至少ー个CpG基序包含至少ー个 (优选ー个)CG 二核苷酸，或优选由至少ー个(优选ー个)CG 二核苷酸组成，其中所述C是非甲基化的。优选的但非必须的，所述CG 二核苷酸是回文序列的一部分。术语免疫刺激核酸也指包含修饰碱基，优选4-溴-胞嘧啶的核酸。在本发明的情况中特别优选的是能刺激树状细胞中产生IFN-α的ISS-NA。可用于本发明目的的免疫刺激核酸例如描述在 W02007/068747A1 中。寡核苷酸如本发明所使用的，术语“寡核苷酸”是指含有2个或更多个核苷酸，优选约6到约200个核苷酸，更优选20到约100个核苷酸，最优选20到40个核苷酸的核酸序列。非常优选地，寡核苷酸包含约30个核苷酸，更优选寡核苷酸包含正好30个核苷酸， 最优选寡核苷酸由正好30个核苷酸組成。寡核苷酸是聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸， 且优选选自下组(a)未修饰的RNA或DNA，和(b)修饰的RNA或DNA。修饰可以包括骨架或核苷酸类似物。寡核苷酸优选选自下组(a)单链和双链DNA，(b)作为单链和双链区域的混合物的DNA，(c)单链和双链RNA，(d)作为单链和双链区域的混合物的RNA，和(e)含有为单链的区域或更优选双链的区域或单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂交分子。 优选的核苷酸修饰/类似物选自下组(a)肽核酸，(b)肌苷(inosin)，(c)三苯甲基化碱基，(d)硫逐磷酸酷，(e)烷基硫逐磷酸酷，(f) 5-硝基吲哚脱氧呋喃糖基(5-nitroindole desoxyribofuranosyl), (g) 5_甲基脱氨氧胞苷和(h) 5，6_ ニ氢_5，6_ ニ羟基脱氧胸苷。 硫代磷酸酯化Hphosphothioated)核苷酸在細胞或生物体中抵抗降解，并因此是优选的核苷酸修饰。仅由磷酸ニ酯结合的核苷酸组成的未修饰寡核苷酸通常活性高于修饰的核苷酸，因此通常在本发明的情况中是优选的。最优选的是仅由磷酸ニ酯结合的脱氧核苷酸组成的寡核苷酸，其中更优选所述寡核苷酸是单链的。进ー步优选的是能刺激細胞(优选树状細胞)中产生IFN-α的寡核苷酸。非常优选的能刺激细胞产生IFN-α的寡核苷酸选自 A型CpG和C型CpG0CpG基序如本发明所使用的，术语“CpG基序”是指包括被在中央CpG(的3'和 5'侧)侧翼的至少ー个碱基(优选一个或ニ个核苷酸)围绕的非甲基化中央CpG (即非甲基化CpG 二核苷酸，其中所述C是非甲基化的)的核苷酸模式。典型地且优选地，本发明所使用的CpG基序包含非甲基化的CpG 二核苷酸和在其5'和3'末端的两个核苷酸或由其組成。不被理论束缚，在CpG侧翼的碱基赋予CpG寡核苷酸活性的重要部分。含有非甲基化CpG的寡核苷酸如本发明所使用的，术语“含有非甲基化CpG的寡核苷酸”或“CpG”是指包含至少ー个CpG基序的寡核苷酸，优选寡脱氧核苷酸。因此，CpG 包含至少ー个非甲基化的胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸。例如，优选的CpG刺激/激活来源于脊椎动物骨髄的細胞，例如对其具有促有丝分裂效应或者诱导或増加其細胞因子表达。例如， CpG可用于激活B細胞、NK細胞和抗原呈递細胞，例如树状細胞、单核細胞和巨噬細胞。优选地，CpG涉及包含3'端紧接鸟嘌呤核苷的非甲基化胞嘧啶的寡脱氧核苷酸，优选单链寡脱氧核苷酸，其中所述非甲基化的胞嘧啶和所述鸟嘌呤核苷经由磷酯键连接，其中优选所述磷酯键是磷酸ニ酯键或硫代磷酸酯键，其中更优选所述磷酯键是磷酸ニ酯键。CpG可以包括核苷酸类似物(例如包含硫逐磷酸酯键(phosphorothioester bond)的类似物)，且可以是双链或单链的。通常，双链分子在体内更加稳定，而单链分子具有更高的免疫活性。 优选地，如本发明所使用的，CpG是长度至少约十个核苷酸且包含至少ー个CpG基序的寡核苷酸，其中更优选所述CpG长度为10到60个、更优选15到50个、还更优选20到40个、还更优选约30个和最优选正好30个核苷酸。CpG可以由甲基化和/或非甲基化的核苷酸组成，其中所述至少ー个CpG基序包含至少ー个CG 二核苷酸，其中所述C是非甲基化的。所述CpG也可以包含甲基化和非甲基化序列延伸，其中所述至少ー个CpG基序包含至少ー个 CG 二核苷酸，其中所述C是非甲基化的。非常优选地，CpG涉及包含3'端紧接鸟嘌呤核苷的非甲基化胞嘧啶的单链寡脱氧核苷酸，其中所述非甲基化胞嘧啶和所述鸟嘌呤核苷通过磷酸ニ酯键连接。CpG可以包括核苷酸类似物，例如包含硫逐磷酸酯键的类似物，且可以是双链或单链的。通常，磷酸ニ酯CpG是如下所示的A型CpG，而硫代磷酸酯稳定的CpG是B 型CpG。本发明情况中优选的CpG寡核苷酸是A型CpG。A型CpG 如本发明所使用的，“ A型CpG”或“D型CpG”是指含有至少ー个CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。A型CpG优先刺激T細胞的活化和树状細胞的成熟，且能够刺激 IFN-α产生。在A型CpG中，至少ー个CpG基序的核苷酸通过至少一个磷酸ニ酯键连接。A 型CpG包含至少ー个磷酸ニ酯键CpG基序，其可在其5 ‘端和/或(优选和)其3 ‘端被硫逐磷酸酯键结合的核苷酸侧邻。优选地，CpG基序且因此优选的CG 二核苷酸及其含有至少一个，优选两个核苷酸的直接侧邻区域由磷酸ニ酯核苷酸組成。优选的A型CpG仅由磷酸 ニ酷(PO)键核苷酸組成。典型地且优选地，多聚G基序包含至少ー个，优选至少三个，至少 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G (鸟嘌呤核苷)，最优选至少10个G ；或多聚G基序由至少ー个，优选至少三个，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G (鸟嘌呤核苷)， 最优选至少10个G組成。优选地，本发明的A型CpG包含回文序列或由回文序列組成。回文序列回文序列是，当以具有规则碱基对(Α/Τ ；C/G)的双链核酸形式存在吋， 其由沿5' -3'方向具有相同序列的两条单链组成的核苷酸序列。
包装的本发明所使用的术语“包装的”是指免疫刺激核酸相对于VLP的状态。本发明所使用的术语“包装的”包括可以是共价(例如通过化学偶联)或非共价(例如，离子相互作用、疏水性相互作用、氢键等)的结合。该术语也包括免疫刺激核酸的包被或部分包被。因此，免疫刺激核酸可以被VLP包被而不存在实际的结合，特别是共价结合。在优选的实施方式中，所述免疫刺激核酸包装在VLP内，最优选以非共价方式包装在VLP内。在所述免疫刺激核酸是DNA，优选含有非甲基化CpG的寡核苷酸的情况下，术语“包装的”意味着所述免疫刺激核酸，优选所述含有非甲基化CpG的寡核苷酸不能被利用进行核酸酶水解，优选不能被利用进行DNA酶水解(例如DNA酶I或Benzonase)，其中优选所述可利用性通过 W02003/024481A2的实施例11-17所描写的方法检测。ー个、一或ー种当术语“ー个”、“一”或“ー种”用于本公开中吋，除非另有说明， 它们是指“至少ー个”或“一个或多个”。一方面，本发明涉及一种组合物，其包含(a)具有至少ー个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中优选所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；和(b)具有至少ー 个第二附着位点的至少ー种抗原，其中所述至少ー种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域 (HA胞外域)或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；且其中(a) 和(b)通过所述至少ー个第一附着位点和所述至少ー个第二附着位点连接。在优选的实施方式中，所述HA胞外域是蛋白质，其中所述蛋白质由以下亚基组成(a)HAl亚基，其包含SEQ ID NO 75的11位氨基酸到3 位氨基酸或优选由其組成，和 (b)HA2亚基，其由SEQ ID NO :76的1到176位组成。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒的HA胞外域， 其中优选所述A型流感病毒属于天然存在的A型流感病毒株。在进ー步的优选实施方式中，所述天然存在的A型流感病毒株选自下组(a) A/California/04/2009 (HlNl) (Genbank 登录号ACP41105. 1) (SEQ ID NO. 74) ； (b) A/Brisbane/59/2007 (HlNl) (Genbank 登录号ACA^844. 1) (SEQ ID NO. 73) ； (c) A/Albany/1/1968 (H2N2) (Genbank 登录号 AB052247. 1) ； (d) A/northern shoveler/California/HKWF 1U8/2007 (H2N7) (Genbank 登录号ACF47420. 1) ； (e)A/Uruguay/716/2007 X_175(H3N2) (Genbank 登录号ACD47234. 1) (SEQ ID NO. 40) ； (f)A/ruddy turnstone/New Jersey/Sg-00542/2008(H4N6)(Genbank 登录号ACN86642. 1) ； (g) A/Viet Nam/1203/2004 (H5N1) (Genbank 登录号ΑΒΡ51977· 1) (SEQ ID NO. 41) ； (h) A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (Genbank g 录号ABW06108. 1) (SEQ ID NO. 42) ;(i)A/Egypt/2321-NAMRU3/2007(H5Nl) (Genbank 登录号ABP96850.1) (SEQ ID NO.43) ； (j)A/northern shoveler/California/HKWF383/2007 (H6N1) (Genbank 登录号ACE76614. 1) ； (k) A/Canada/rv504/2004 (H7N3) (Genbank 登录号 ABI85000. 1) ； (1)A/duck/Mongolia/119/2008(H7N9)(Genbank 登录号:ΒΑΗ22785· 1)； (m)A/mallard/Minnesota/Sg-00570/2008(H8N4) (Genbank 登录号ACN86714. 1) ； (n)A/ HK/2108/2003 (H9N2) (Genbank 登录号ΑΒΒ58945· 1) ； (ο) A/Korea/KBNP-0028/2000 (Η9Ν2) (Genbank 登录号ABQ57378. 1) ； (ρ) A/chicken/Anhui/AH16/2008 (Η9Ν2) (Genbank 登录号 ACJ35235. 1) ； (q) A/ruddy turnstone/New Jersey/Sg-00490/2008 (H10N7) (Genbank 登录号ACN86516. 1) ； (r) A/ruddy turnstone/New Jersey/Sg-00561/2008 (H11N9) (Genbank 登录号ACN86684. 1) ； (s) A/ruddy turnstone/New Jersey/Sg-00484/2008 (H12N5) (Genbank 登录号ACN86498. 1) ;(t) A/herring gull/Norway/10_2336/2006 (H13N6) (Genbank 登录号CAQ77191. 1) ； (u) A/mallard duck/Astrakhan/263/1982 (H 14N5) (Genbank 登录号ABI84453. 1) ； (v) A/Australian shelduck/ffestern Australia/1756/1983 (H15N2) (Genbank 登录号ABB90704. 1) ; (w) A/herring gul l/Norway/10_1623/2006 (H16N3) (Genbank 登录号CAQ77189. 1) ； (χ) A/California/07/2009 (HlNl) (Genbank 登录号 ACP44189. 1)和(y) A/Perth/16/2009 (H3N2) (Genbank 登录号ACS71642. 1)。在非常优选的实施方式中，所述天然存在的A型流感病毒株是A/CalifOrnia/07/2009(HlNl) (Genbank 登录号ACP44189. 1)或 A/Perth/16/2009 (H3N2) (Genbank 登录号ACS71642. 1)。在本发明的优选实施方式中，所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 禾口 H16 的胞夕卜域。优选地， 所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型HI、H2、H3、H5、H7和H9的胞外域，其中更优选地，所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型HI、H2、H3、H5和H9的胞外域，其中再更优选地所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型HI、H3和H5的胞外域。此外更优选所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型HI、H2和H3的胞外域。 在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型Hl的胞外域。 在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H3的胞外域。 在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H3的胞外域。 在其他优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H5的胞外域。在进ー步的优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :39所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :39具有至少 70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :40所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :40具有至少 70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :41所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO 41具有至少 70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i)SEQ ID NO :42所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :42具有至少70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i)SEQ ID NO :43所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :43具有至少 70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i)SEQ ID NO :73所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :73具有至少 70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i)SEQ ID NO :74所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :74具有至少 70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域是B型流感病毒的HA胞外域，其中优选所述B型流感病毒属于天然存在的B型流感病毒株。在优选实施方式中，所述天然存在的 B 型流感病毒株选自下组(a) B/Brisbane/33/2008 (Genbank 登录号AC拟9387. 1) ； (b) B/ Guangzhou/01/2007 (Genbank 登录号ABX71684. 1)和(c) B/Brisbane/60/2008 (Genbank 登录号:ACN29383. 1)。在进ー步的优选实施方式中，所述抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域，其中优选所述流感病毒血凝素蛋白的胞外域是三聚体形式。在进ー步的优选实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述三聚体形式可通过包括以下步骤的方法获得α)通过将噬菌体Τ4蛋白fibritin或其功能片段的三聚化域与所述流感病毒血凝素蛋白胞外域，优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的c末端融合而重组形成构建体；αυ在基于真核或原核細胞的系统中，优选在杆状病毒/昆虫細胞系统中表达所述构建体；(iii)纯化所述三聚体形式。在优选实施方式中，所述噬菌体T4蛋白fibritin的三聚化域是SEQ ID NO :95或其功能片段。在非常优选的实施方式中，所述噬菌体T4蛋白fibritin的三聚化域是SEQ ID N0:95。该构建体的表达优选在Hi5或sf21昆虫細胞中，优选在sf21昆虫細胞中进行。 所述抗原还可以在所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端引入His-标签，以使得能够纯化。所述His-标签优选包含与包含三聚化序列的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端融合，优选与所述流感病毒血凝素的胞外域的C末端融合的3到6个组氨酸残基，优选6
17个组氨酸残基。在进ー步的优选实施方式中，所述抗原是所述HA胞外域的片段，其中优选所述HA 胞外域的所述片段是所述HA胞外域的所述HAl亚基或所述HA胞外域的所述HAl亚基的片段。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的11位到3 位的氨基酸序列，或优先由对应于SEQ ID NO 75的11位到3 位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段由对应于SEQ ID N0:75 的11位到3 位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO :75的115位到261位的氨基酸序列，或优先由对应于SEQ ID NO: 75的115位到261位的氨基酸序列組成。在其他优选的实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的50位到261位的氨基酸序列，或由对应于SEQ ID NO 75的50位到261位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的98和195位的酪氨酸，对应于SEQ ID NO 75的153位的色氨酸和对应于SEQ ID NO 75的183位的组氨酸的氨基酸残基。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含至少ー个ニ硫键，优选至少2个ニ硫键，更优选至少3个，还更优选至少4个ニ硫键。因此，在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO :75的97和139位的半胱氨酸残基，优选所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID N0:75的64、76、97、139位的半胱氨酸残基，更优选所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的52、64、76、97、 139、277、281、305位的半胱氨酸残基。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段是所述HA胞外域的HAl 亚基的片段。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的57位到270位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的57位到270位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的57位到276位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的57位到276位的氨基酸序列組成。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的46位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的46位到310位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的46位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的46位到310位的氨基酸序列組成，其中所述HA胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1) (Genbank 登录号ACP44189. 1)或 A/Perth/16/2009 (H3N2) (Genbank 登录号ACS71642. 1)的 HA 胞外域具有至少70 %、优选至少80 %、更优选至少80 %、还更优选至少85 %、还更优选至少 90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的46位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO :75的46位到310位的氨基酸序列組成，其中所述HA胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008 (Genbank 登录号AC拟9387. 1)、B/Guangzhou/01/2007 (Genbank 登录号ABX71684. 1)或 B/Brisbane/60/2008 (Genbank登录号AC拟9383. 1)的HA胞外域具有至少70%、优选至少 80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列組成，其中所述HA胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1) (Genbank 登录号ACP44189. 1)或 A/Perth/16/2009 (H3N2) (Genbank 登录号ACS71642. 1)的 HA 胞外域具有至少70 %、优选至少80 %、更优选至少80 %、还更优选至少85 %、还更优选至少 90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO :75的42位到310位的氨基酸序列組成，其中所述HA胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008 (Genbank 登录号ACN^387. 1)、B/Guangzhou/01/2007 (Genbank 登录号ABX71684. 1)或 B/ Brisbane/60/2008 (Genbank登录号AC拟9383. 1)的HA胞外域具有至少70%、优选至少 80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的M位到276位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的M位到276位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID N0:75 的M位到270位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的M位到270位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID N0:75 的5 到276位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的5 到276位的氨基酸序列組成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID N0:75的 54a到270位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的5 到270位的氨基酸序列組成。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是与选自下组的氨基酸序列具有至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列(a) SEQ ID NO :67的2到277位；(b) SEQ ID NO 68的2到 273 位；(c) SEQ ID NO :69 的 2 到 230 位；(d) SEQ ID NO :70 的 2 到 230 位；(e) SEQ ID NO 71 的 2 到 224 位；(f) SEQ ID NO :72 的 2 到 221 位;(g) SEQ ID NO 84 ； (h) SEQ ID NO 85 ； (i)SEQ ID NO 86 ； (j)SEQ ID NO 88 ； (k) SEQ ID NO :89 ；禾ロ (I)SEQ ID NO :90。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是选自下组的氨基酸序列(a) SEQ ID NO :67 的 2 到 277 位；(b) SEQ ID NO 68 的 2 到 273 位；(c) SEQ ID NO :69 的 2 到 230 位；(d) SEQ ID NO :70 的 2 到 230 位；(e) SEQ ID NO :71 的 2 到224 位；禾ロ (f) SEQ ID NO 72 的 2 到 221 位;(g) SEQ ID NO 84 ； (h) SEQ ID NO 85 ； (i) SEQ ID NO 86 ； (j)SEQ ID NO :88 ； (k) SEQ ID NO 89 ；禾ロ (I)SEQ ID NO :90。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是与SEQ ID NO 87具有至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在进ー步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是 SEQ ID NO :87ο在进ー步的优选实施方式中，具有至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原还包含接头，其中所述接头包含所述第二附着位点或由所述第二附着位点組成。在优选实施方式中，所述接头经由ー个肽键与所述抗原结合，其中优选所述接头选自下组(a)半胱氨酸残基；(b)CGG和(c)GGC。具有至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原还可以在所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端引入His-标签。因此，在进ー步的优选实施方式中，具有至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原包含SEQ ID NO 67到72中的任何一个，或优选由SEQ ID NO 67到72中的任何ー个組成。因此，本领域技术人员应理解，重组产生的多肽的N末端甲硫氨酸残基可被切割棹。 因此，在进ー步的优选实施方式中，所述至少ー种抗原包含SEQ ID NO :84到90中的任何一个。在进ー步的优选实施方式中，本发明组合物能以Ιμ 的红血球中小于 0. 50 μ g的所述组合物的浓度诱导红血球的红血球凝集。因此，红血球凝集试验优选在实施例35所描写的条件下进行。本发明优选涉及W02007/068747A1的46_52页公开的病毒的病毒样颗粒，所述文献以引用方式合并于此。在优选实施方式中，所述VLP是重组VLP。重组VLP通过在宿主细胞中，优选在細菌細胞中，最优选在大肠杆菌中表达外壳蛋白而获得。在其他优选实施方式中，所述VLP是RNA噬菌体的VLP。本发明优选涉及 W02007/068747A1的49-50页公开的RNA噬菌体的病毒样颗粒，所述文献以引用方式合并于此。RNA噬菌体的外壳蛋白的特別有利之处是它们能够容易地在細菌表达系统，特别是在大肠杆菌中表达。因此，在本发明的ー个优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA 噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。优选的RNA噬菌体的外壳蛋白是如 W02007/068747A1的SEQ ID NO :3到23所公开的外壳蛋白。在优选的实施方式中，所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成，其中优选所述重组外壳蛋白是RNA噬菌体的重组外壳蛋白。在其他优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体 Qi3、RNA噬菌体AP205或RNA噬菌体CpCb5的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。 在其他优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成， 所述重组外壳蛋白包含或优选由选自下组的氨基酸序列組成(a) SEQ ID ΝΟ:10 β外壳蛋白)；(b)SEQ ID NO :1 禾ロ SEQ ID NO 2 的混合物 _A1 蛋白)；(c) SEQ ID NO :19(AP205
外壳蛋白)；(d) SEQ ID NO :92(cpCb5 R21); (e)SEQ ID NO :93(cpCb5 K21);和(f) SEQ ID NO :94(CpCb5 K21 双 CyS)。在一个优选的实施方式中，所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。因此，在进ー步的优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。在其他优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含含有SEQ ID NO :1或优选由SEQ ID NO :1組成的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。WO 02/056905公开了进一歩优选的RNA噬菌体，特別是噬菌体Qi3和噬菌体fr的病毒样颗粒，所述公开以引用方式全部合并于此。特別是，WO 02/056905的实施例18包含制备噬菌体Q β的VLP颗粒的详细说明。在其他优选实施方式中，所述VLP是噬菌体ΑΡ205的VLP。因此，在进ー步的优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体ΑΡ205的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。在其他实施方式中，所述病毒样颗粒包含含有或优选由SEQ ID Ν0:19組成的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。其他优选的噬菌体ΑΡ205的VLP是公开于 W02004/007538，特別其实施例1和实施例2中的那些。在其他优选实施方式中，所述VLP是RNA噬菌体tpCb5的VLP。因此，在进ー步的优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体cpCb5的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。在其他实施方式中，所述病毒样颗粒包含含有或优选由SEQ ID N0:92到94 中的任何ー个，优选SEQ ID NO :92組成的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。在另一方面，本发明涉及制备本发明組合物的方法，包括(a)提供具有至少ー个第一附着位点的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；(b)提供具有至少ー种第二附着位点的至少ー种抗原，其中所述至少ー种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；和(c)将所述病毒样颗粒和所述至少ー种抗原組合以制备所述组合物，其中所述至少ー种抗原和所述病毒样颗粒通过第一和第二附着位点连接。在优选的实施方式中，通过表达，优通过由在細菌系统，优选大肠杆菌中的表达来提供具有至少ー种第二附着位点的至少ー种抗原。在ー个优选实施方式中，具有至少ー个第一附着位点的所述病毒样颗粒和具有所述至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原经由至少ー个肽共价键连接。编码所述抗原的基因与编码外壳蛋白的基因在内部同框接合或优选地同框接合到编码外壳蛋白的基因的N末端或C末端，其中融合蛋白优选保持形成病毒样颗粒的能力。进ー步的实施方式包括如 Kozlovska，Τ. Μ.等，Intervirology 39 :9-15 (1996)，Pushko P.等，Prot. Eng. 6 883-891 (1993)、WO 92/13081或US 5, 698, 424中所描述的抗原与外壳蛋白序列的融合。在进ー步的优选实施方式中，具有至少ー个第一附着位点的所述病毒样颗粒和具含有所述至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原经由至少ー个非肽共价键连接。在进一歩的优选实施方式中，所述第一附着位点和所述第二附着位点经由至少ー个非肽共价键连接。衣壳和抗原性蛋白经由ニ硫键的连接特別地对于含有巯基部分的分子不稳定， 而且在血清中比例如在硫醚连接更不稳定(Martin FJ.和Papahadjopoulos D. (1982)， Irreversible Coupling οι Immunog丄ooulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257 :286-288)。因此，在进ー步的非常优选的实施方式中，具有至少ー个第一附着位点的所述病毒样颗粒和具有所述至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原之间的结合或连接不包括硫-硫键。在其他非常优选的实施方式中，所述至少ー个第一附着位点不是或不包含巯基。在再另外的非常优选的实施方式中，所述至少ー个第一附着位点不是或不包含半胱氨酸的巯基。在优选的实施方式中，所述第一附着位点包含或优选是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，其中优选所述赖氨酸残基是由所述病毒样颗粒包含的赖氨酸残基，且其中更优选所述赖氨酸残基是由RNA噬菌体的重组外壳蛋白包含的赖氨酸残基，最优选是由RNA噬菌体 Qi3、RNA噬菌体AP205或RNA噬菌体cpCb5的重组外壳蛋白包含的赖氨酸残基。在非常优选的实施方式中，所述赖氨酸残基是SEQ ID NO :1、19或SEQ ID NO :92到93中任一的赖氨酸残基。在另ー个优选实施方式中，所述第二附着位点包含或优选是巯基，优选半胱氨酸的巯基。在进ー步的优选实施方式中，所述至少ー个第一附着位点包含氨基且所述第二附着位点包含巯基。在进ー步的优选实施方式中，所述第一附着位点是氨基且所述第二附着位点是巯基。在更进一歩的优选实施方式中，所述第一附着位点是赖氨酸残基的氨基，其中优选所述赖氨酸残基是所述病毒样颗粒的外壳蛋白包含的赖氨酸残基，且所述第二附着位点是半胱氨酸残基的巯基。在进ー步的优选实施方式中，具有至少ー个第一附着位点的所述病毒样颗粒包含 RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成，其中所述重组外壳蛋白包含SEQ ID N0:l、19或SEQ ID NO :92到94中任一的氨基酸序列，或优选由SEQ ID N0:l、19或SEQ ID NO 92到94中任一的氨基酸序列組成，且其中所述第一附着位点包含或优选是所述氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。在进ー步的优选实施方式中，所述重组外壳蛋白包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列或由SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成，且所述第一附着位点包含或优选是SEQ ID NO 1的赖氨酸残基的氨基。在进ー步的优选实施方式中，仅ー个所述第二附着位点中通过至少ー个非肽共价键和所述第一附着位点结合，导致所述抗原与所述病毒样颗粒的単一和一致的结合类型， 其中与所述第一附着位点结合的所述仅ー个第二附着位点是巯基，且其中所述抗原和所述病毒样颗粒通过所述结合发生相互作用，以形成有序和重复的抗原阵列。使用异双官能交联剂连接抗原与VLP使得抗原能够以定向方式与VLP偶联。因此，在ー个优选实施方式中，具有至少ー个第一附着位点的所述病毒样颗粒与具有所述至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原经由化学交联连接，典型地和优选地通过使用异双官能交联剂连接。在优选实施方式中，所述异双官能交联剂包含(a)与VLP的优选的第一附着位点，优选与氨基，更优选与赖氨酸残基的氨基反应的官能团，和(b)与优选的第二附着位点，优选与巯基，最优选与半胱氨酸残基的巯基反应的另外的官能团，其是抗原所固有的或人工添加到抗原上的，且任选地可以通过还原使得可用于反应。因此，优选的异双官能交联剂包含与氨基具有反应性的官能团和与巯基具有反应性的官能团。非常优选的异双官能交联剂选自下组SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、 SuIfo-SMPB, SuIfo-SMCC, Sulfo_KMUS、SVSB和SIA，其中最优选所述异双官能交联剂是 SMPH0上述交联剂全部在与氨基反应后导致酰胺键的形成和在与巯基反应后导致硫醚键的形成。在优选实施方式中，具有至少ー个第二附着位点的所述至少ー种抗原还包含接头，其中优选所述接头包含所述第二附着位点或由所述第二附着位点組成。在优选实施方式中，所述接头结合所述至少ー个第一附着位点和所述至少ー个第二附着位点。在本发明进ー步的优选实施方式中，接头经由至少ー个共价键，优选经由至少ー个(优选ー个)肽键与抗原结合。在进ー步的优选实施方式中，具有所述至少ー个第二附着位点的所述至少一种抗原包含接头，其中所述接头包含所述第二附着位点，且其中优选所述接头经由ー个肽键与所述抗原结合，且其中更优选所述接头包含半胱氨酸残基或由半胱氨酸残基組成。优选地，所述接头包含所述第二附着位点或由第二附着位点組成。在进ー步的优选实施方式中，所述接头包含巯基，优选半胱氨酸残基。在另ー个优选实施方式中，所述接头包含或优选是半胱氨酸残基。在进ー步的优选实施方式中，所述接头选自下組(a) CGG ;(b) N-末端甘氨酸接头，优选GCGGGG ； (C)GGC;· (d) C-末端甘氨酸接头，优选GGGGCG。能用于本发明的其他接头公开于例如W02007/039552A1 (第32页第111和112段)。在优选实施方式中， 所述接头添加至抗原的C末端。在进ー步的优选实施方式中，所述组合物还包含至少ー种免疫刺激物质。可用于本发明的免疫刺激物质通常是本领域已知的，且尤其是公开在W02003/0M481A2中。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质与所述病毒样颗粒结合。在进ー 步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质与所述病毒样颗粒混合。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质选自下组(a)免疫刺激核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸(lipoteichonic acid) ； (e)咪唑并喹啉(imidazoquinoline)化合物；(f)鞭毛蛋白 (flagelline) ； (g)脂蛋白；和(h) (a)到(g)至少ー种物质的任意混合物。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质是免疫刺激核酸，其中优选所述免疫刺激核酸选自下组(a)核糖核酸；(b)脱氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d) (a)、(b)和 /或(c)的任意混合物。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是核糖核酸，且其中所述核糖核酸是宿主細胞源的RNA。在其他优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是聚-(I:C)或其衍生物。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是脱氧核糖核酸，其中优选所述脱氧核糖核酸是含非甲基化CpG的寡核苷酸。在进ー步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是A型CpG。在进ー步的优选实施方式中，将所述免疫刺激核酸，且因此优选所述脱氧核糖核酸，且因此更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中。在进ー步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含回文序列。在进ー步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。在进ー步的优选实施方式中，所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO :96)。在进ー步的优选实施方式中，所述回文序列的5'末端和3'末端侧邻鸟嘌呤核苷实体。在进ー步的优选实施方式中，所述回文序列的5'末端侧邻至少3个和至多15个鸟嘌呤核苷实体，且其中所述回文序列的3'末端侧邻至少3个和至多15个鸟嘌呤核苷实体。在进ー步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成(a) “ G6-6" GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID NO 97) ； (b) “ G7 -T' GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO 98) ； (c)〃 G8_8〃 GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGG GGG(SEQ ID NO 99) ； (d)“ G9-9" GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO :100)；禾ロ (e) 〃 G10" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO 101)。在进ー步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO 101)或由序列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO :101)组成。在其他优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸仅由磷酸ニ酯键核苷酸组成，其中优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到所述VLP中。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，不能被用于DNA酶水解。在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸不能被用于Benzonase水解。 在进ー步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其由序列G GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO :101)组成，其中所述含非甲基化 CpG 的寡核苷酸仅由磷酸ニ酯键核苷酸组成，且其中优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到所述 VLP 中。本发明的另一方面是包含本发明组合物或优选由本发明组合物組成的疫苗组合物，其中优选所述疫苗組合物包含有效量的本发明组合物，且其中更优选所述疫苗組合物包含治疗有效量的本发明组合物。在此“有效量”是指产生所需生理学效应，优选免疫效应的量。在此“治疗有效量”是指产生所需治疗效果的量。在本发明的情况中，所需的治疗效果是预防或改善动物，优选人中的流感病毒感染。本发明的有利特征是所述组合物甚至在不含佐剂的情况下的高免疫原性。因此， 在优选实施方式中，所述疫苗組合物不含佐剂。此外，不含佐剂使得不良副作用的发生最小化。因此，在施用疫苗组合物之前、同时或之后将不将佐剂施用于同一患者。在进ー步的优选实施方式中，所述疫苗組合物还包含至少ー种佐剂。因此当施用佐剂时，所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明组合物或疫苗组合物之前、同时或之后发生。本发明的另一方面是包含(1)本发明的組合物或疫苗组合物；和( 药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明的組合物和/或疫苗组合物以药学可接受的形式施用于个体。如果本发明药物组合物的施用可以被被接受个体，优选被人耐受，则本发明的药物组合物被称为是药学可接受的。药学上可接受的载体或赋形剂可以包含盐、缓冲液、佐剂或用于改善偶联物效力的其他物质。适用于制备疫苗組合物或药物组合物的材料的实例例如在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Osol，A，ed.，Mack Publishing Co., (1990))中提供。这包括无菌水溶液(例如，生理盐水)或非水性溶液和悬浮液。非水性溶剂的实例是丙ニ醇、聚乙ニ醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酷。载体或包封敷料可用于增加皮肤渗透并提高抗原吸收。本发明的另一方面涉及免疫方法，优选涉及抗流感(最优选抗流行性感冒)的免疫方法，所述方法包括将本发明的組合物、疫苗组合物或药物组合物施用于动物，优选施用于人。另ー方面，本发明涉及治疗、改善和/或预防动物，优选人中的流感病毒感染，优选A型流感病毒感染的方法，所述方法包括将本发明的組合物、疫苗组合物或药物组合物施用于所述动物，优选施用于所述人。另ー方面，本发明涉及本发明的組合物、疫苗组合物或药物组合物，其用作药物。另ー方面，本发明涉及本发明的組合物、疫苗组合物或药物组合物，其用于治疗、改善和/或预防流感病毒感染，优选A型流感病毒感染。另ー方面，本发明涉及治疗、改善和/或预防流感，优选A型流感的方法，所述方法包括将本发明的組合物、疫苗组合物或药物组合物施用于动物，优选施用于人，其中优选所述组合物、所述疫苗組合物和/或所述药物組合物以有效量，优选免疫有效量施用于所述动物，更优选施用于所述人。因此免疫有效量是指能够引起所述个体，优选所述人中的可检测免疫应答，优选抗体应答的量。在一个实施方式中，所述组合物、疫苗组合物和/或药物组合物通过注射、灌注、 吸入、ロ服施用或其他适当的物理方法施用于所述动物，优选施用于所述人。在优选实施方式中，所述组合物、疫苗组合物和/或药物组合物通过肌内、静脉内、跨粘膜、透皮、鼻内、腹膜内、皮下或直接进入淋巴结的方式施用于所述动物，优选施用于所述人。在另一方面，本发明涉及本发明的組合物、疫苗组合物和/或药物组合物用于治疗、改善和/或预防流感，优选A型流感的用途。本发明的另一方面是本发明的組合物、疫苗组合物和/或药物组合物在制备治疗、改善和/或预防流感，优选A型流感的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及抗原，其中所述抗原是本文定义的HA胞外域或HA胞外域的片段。在优选的实施方式中，所述抗原是本文定义的HA胞外域的片段。在进ー步的优选实施方式中，所述抗原是包含对应于SEQ ID NO :75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列組成的HA胞外域的片段。在进ー 步的优选实施方式中，所述抗原是包含对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列組成的HA胞外域的片段，其中所述HA胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1) (Genbank登录号 ACP44189. 1)或 A/Perth/16/2009 (H3N2) (Genbank 登录号ACS71642. 1)的 HA 胞外域具有至少70%、优选至少80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少 99%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。在进ー步的优选实施方式中，所述抗原是包含对应于SEQ ID N0:75的42位到 310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列組成的HA胞外域的片段，其中所述HA胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008 (Genbank 登录号AC拟9387. 1)、B/Guangzhou/01/2007 (Genbank 登录号ABX71684. 1)或 B/ Brisbane/60/2008 (Genbank登录号AC拟9383. 1)的HA胞外域具有至少70%、优选至少 80%、更优选至少80%、还更优选至少85%、还更优选至少90%、还更优选至少95%、还更优选至少96%、还更优选至少97%、还更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。应理解，本文描述的所有技术特征和实施方式，特别是用于描述本发明组合物及其组分的技术特征和实施方式，可単独或以任何可能的組合方式应用于本发明的所有方面，特别是应用于疫苗组合物、药物组合物、方法和用途。
具体实施例方式实施例1 :ecHA A/PR/8/34(HlNl)的克隆、表达和纯化
A)pFastBacl_GP67 的产生载体pFastBacl_GP67(SEQID NO :33)是pFastBacl Qnvitrogen)的衍生物，其中将GP67的信号肽引入到多个克隆位点的前面以用于分泌蛋白。载体通过将退火的寡核苷酸对 PH155(SEQ ID NO :20)和 PH156(SEQ ID NO :21)和退火的寡核苷酸对 PH157 (SEQ ID NO :22)和 PH158(SEQ ID NO :23)和退火的寡核苷酸对PH159 (SEQ ID NO :24)和 PH160 (SEQ ID NO 25)和退火的寡核苷酸对PH161(SEQ ID NO :26)和 PH162(SEQ ID NO :27) —起接合到BamHI-EcoRI消化的pFastBacl质粒中以获得pFastBacl_GP67而构建。所得质粒在其多个克隆位点具有 BamHI、EcoRI、PstI、XhoI、SphI、Acc65I、KpnI 和 Hindi11 限制性位点。B)小鼠适应的流感病毒A/PR8/34 (Hmi)的ecHA的克隆和测序通过使用引物Uni 12 (SEQ ID NO 28)反转录从A型流感病毒PR8感染的MDCK细胞的上清液中提取的vRNAs(-)，然后使用引物BM-HA-I (SEQ ID NO 29)和BM-NS-890R(SEQ ID NO 30)进行PCR从而制备(HAO PR8)株的HAO的cDNA。来自PR8的ecHA的翻译序列是 SEQ ID NO :39οC) pFastBacl_GP67_HA_PR8 的产生编码氨基酸11-329 (HAl)、接着来自小鼠适应的PR8 (见B项下)的氨基酸 1-176 (HA2) [HA氨基酸位置基于H3编号]、接着来自噬菌体T4 fibritin的三聚化序列 (foldon)、6xHis-标签和含有半胱氨酸的接头)的DNA被优化以在哺乳动物細胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。用寡聚核苷酸PH163(SEQ ID NO :31) 和PH164(SEQ ID NO :32)扩增优化的核苷酸序列。用BamHI和)(hoi消化所得DNA片段并克隆到BamHI-XhoI消化的表达载体pFastBacl_GP67中，从而得到质粒pFastBacl_GP67_ HA_PR8 (SEQ ID NO :34)。该质粒编码由与SEQ ID NO :44的N末端融合的含有来自小鼠适应的PR8的HAO (由与HA2的aa 1-176的N末端融合的HAl的aall_3^组成，HAl和HA2 的aa位置基于H3编号)(SEQ ID NO 39)的N末端组成的融合蛋白。与SEQ ID NO 44的 N末端融合的SEQ ID NO 34的融合蛋白称为ecHA_PR8。D)重组杆状病毒的产生、ecHA的制备和纯化使用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统(Invitrogen)用质粒 pFastBacl_GP67_ HA_PR8产生表达ecHA-PR8的重组杆状病毒。为了表达，在27 °C下培养Hi5昆虫細胞 (Invitrogen)并用重组杆状病毒以5的MOI感染和孵育72小吋。感染后(p. i. )72小时收获含有重组表达的蛋白ecHA-PR8的上清液。通过TFF使用GE中空纤维盒UFP-5-C-35 ； 5' 000NMWC使得上清液浓缩10倍。浓缩的上清液应用于Ni2+-NTA琼胶糖柱Oliagen， Hilden, Germany)。用清洗缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，20mM 咪唑，pH 8.0)彻底清洗柱子后，用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，200mM咪唑，pH 8.0)洗脱蛋白。相对于pH 7. 2的PBS透析纯化的蛋白并贮存在_80°C下直到进ー步使用。实施例2 来自A/touguay/716/2007 X_175(H3N2)的ecHA的克隆、表达和纯化3'端侧邻BamHI限制性位点且5'端侧邻AscI限制性位点的编码接有来自A/ Uruguay/716/2007 X_175(H3N2) (NCBI 登录号 ACD47234. 1)的氨基酸 1-176 (HA2) [HA 氨基酸位置基于H3编号]的氨基酸11-3 (HAl)的DNA被优化以在昆虫細胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg, Germany)。用 BamHI 和 AscI 消化所得 DNA 片段(SEQ ID NO 35)并克隆入BamHI-AscI消化的表达载体pFastBacl_GP67_HA_PR8 (如实施例1所述)中，得到质粒 pFastBacl_GP67_HA_A/Uruguay/7l6/2007 NYMC X-I75C,简称为 pFastBacl_ GP67_HA_A_Uruguay。该质粒编码由与实施例IC所述的aa接头(SEQ ID NO 44)的N末端融合的包含来自流感病毒A/touguay/716/2007 X-175的HAO (由与HA2的aa 1-176的N末端融合的HAl的aa 11-329组成，HAl和HA2的aa位置基于H3编号)(SEQ ID NO 40)的 N末端组成的融合蛋白。与SEQ ID NO :44的N末端融合的SEQ ID NO :40的融合蛋白称为 ecHA-Uruguay。ecHA-Uruguay如在实施例ID中所述制备和纯化。实施例3:来自 A 型流感病毒 H5m 株 A/Viet Nam/1203/2004、A/ Indonesia/5/2005 和 A/Egypt/2321_NAMRU3/2007 的 ecHA 的克隆、表达和纯化3'端侧邻BamHI限制性位点且5'端侧邻AscI限制性位点的编码接有来自 A/Viet Nam/1203/2004 (H5N1) (NCBI 登录号 ABP51977. 1)、A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (NCBI 登录号 ABW06108. 1)和(A/Egypt/2321-NAMRU3/2007 (H5N1))株(NCBI 登录号 ABP96850. 1)的氨基酸1-176 (HA2) [HA氨基酸位置基于H3编号]、氨基酸11-329 (HAl)的 DNA被优化以在昆虫细胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。 用BamHI和AscI (SEQ ID NO :36，37，38)消化所得DNA片段并克隆入BamHトAscI消化的表达载体 pFastBacl_GP67_HA_PR8 中，得到简称为 pFastBacl_GP67_HA_A_VietNam 的质粒 pFastBacl_GP67_HA_A/Viet Nam/1203/2004,称为 pFastBacl_GP67_HA_A_Indonesia 的 pFastBacl_GP67_HA_A/lndonesia/5/2005 以及简称为 pFastBacl_GP67_HA_A_Egypt 的 pFastBacl_GP67_HA_A/Egypt/2321-NAMRU3/2007。该质粒将编码由与实施例 IC 所述的 aa 接头(SEQ ID NO :44)的N末端融合的包含来自相应病毒株(ecHAAVietNam. SEQ ID NO: 41, ecHAAIndonesia SEQ ID NO :42 禾ロ ecHAAEgypt SEQ ID NO :43)的 HAO (由与 HA2 的 aa 1-176的N末端融合的HAl的aa 11-329组成，HAl和HA2的aa位置基于H3编号)的 N末端组成的融合蛋白。具有SEQ ID NO :44的相应融合蛋白将分别称为ecHA-Vietnam、 ecHA-Indonesia和ecHA-Egypt。这些蛋白如实施例ID所述进行制备和纯化。实施例 4 来自 A 型流感病毒 Hmi 株 A/Brisbane/59/2007 和 A/California/04/09 的ecHA的克隆、表达和纯化3'端侧邻BamHI限制性位点且5'端侧邻AscI限制性位点的编码接有来自 A/Brisbane/59/2007(NCBI 登录号 ACA28844. 1)和 A/California/04/09(NCBI 登录号 ACP41105. 1)的氨基酸1-176 (HA2) [HA氨基酸位置基于H3编号]的氨基酸11-329 (HAl) 的DNA被优化以在昆虫细胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。 用BamHI和AscI消化所得DNA片段并克隆入BamHI-AscI消化的表达载体pFastBacl_ GP67_HA_PR8 中，得到简称为 pFastBacl_GP67_HA_A_Brisbane 的质粒 pFastBacl_GP67_A/ Brisbane/59/2007 和简称为 pFastBacl_GP67_HA_A_California 的质粒 pFastBacl_GP67_ A_California_04_09。这些质粒将编码由与实施例ID所述的aa接头(SEQ ID NO 44)的N 末端融合的包含来自相应病毒株(ecHAA/Brisbane/59/2007_ACA28844. 1,SEQ ID NO :73和 ecHAA_Cal ifornia/04/2009_ACP41105. 1, SEQ ID NO :74)的 HAO (由与 HA2 的 aa 1-176 的 N 末端融合的HAl的aa 11-3 組成，HAl和HA2的aa位置基于H3编号)的N端組成的融合蛋白。具有SEQ ID NO :44的相应融合蛋白将分别称为cHA-Brisbane和ecHA-California。 这些蛋白将如实施例IC所述进行制备和纯化。实施例5 :ecHA-PR8 (HlNl)与Q0和AP205病毒样颗粒的偶联
27
PBS (pH 7. 2)中包含lmg/ml的来自实施例1的纯化ecHA_PR8蛋白(与SEQ ID NO 44的N-末端基因融合的SEQ ID NO 39)的溶液在室温下用3折摩尔过量的TCEP孵育 5min以还原C末端半胱氨酸残基。4ml的lmg/ml的Q β VLP蛋白在20mM HEPES (pH 7. 2)中的溶液在室温下与85. 2 μ 1的SMPH溶液(DMS0中的50mM)反应30min。反应溶液在4°C下分別在12和2小时内相对于两个20mM HEPES (pH为7. 2)的41换液进行透析。Iml衍生化和透析的Q β溶液与3700、1850或925 μ 1的经TCEP处理的ecHA_PR8 [lmg/ml]混合并在室温下孵育4h以发生化学交联，从而分别形成疫苗批次Qi3 -ecHA(PR8)-l、Qi3 -ecHA(PR8)-2 或Qi3-ecHA(PR8)-3。未偶联蛋白用kpharose CL4B柱通过尺寸排阻层折除去。偶联产物在还原条件下在4-12%的ニ-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。凝胶的考马斯(Coomassie) 染色显示分子量相对于Q β単体和ecHA-PR8单体增加的几个带，从而清楚地显示ecHA-PR8 蛋白与Q0VLP的成功交联。偶联带的光密度定量显示不同疫苗批次的以下偶联密度 Q β -ecHA(PR8)-1 :40ecHA/VLP, Q β -ecHA(PR8)-2 :29ecHA/VLP 以及 Q β -ecHA(PR8)-3 17ecHA/VLP。为了与 AP205VLP 偶联，5ml 的 lmg/ml AP205VLP 在 20mM HEPES (pH 7.2)中的溶液在室温下与106. 5 μ 1的SMPH溶液(DMS0中50mM)反应90min。反应溶液在4°C下分别在12、2和2小时内相对于三个20mM HEPES (pH 7. 2)的51换液进行透析。2ml衍生化和透析的AP205溶液与5500 μ 1的经TCEP处理的ecHA_PR8 (HlNl)混合并在室温下孵育 4h以化学交联，从而形成AP205-ecHA(PR8)。未偶联蛋白用kpharose CL4B柱通过尺寸排阻层析去除。偶联产物在还原条件下在4-12%的ニ-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。考马斯 (Coomassie)染色的凝胶显示分子量相对于VLP単体和ecHA-PR8单体增加的几个带，从而清楚地证明ecHA-PR8蛋白与AP205VLP的成功交联。偶联带的光密度定量显示偶联密度为 30ecHA/VLPo实施例6:ELISA为测定HA特异性抗体滴度，ELISA板用实施例1获得的ecHA-PR8、实施例2 获得的ecHA-Uruguay或从ftOtein Sciences获得的重组流感HA蛋白(rHA) (rHA_A/ Brisbane/59/2007, rHA_A/Vietnam/1203/2004, rHA_A/Indonesia/05/2005, rHA_A/ California/04/2009, rHA_B/Florida/04/2006)涂覆，或者所述 ELISA 板用浓度为 1 μ g/ml 的实施例3和实施例4获得的ecHA蛋白涂覆或浓度为10 μ g/ml的Q β或AP205VLP涂覆。 封闭所述板，然后与系列稀释液的小鼠血清一起孵育。用酶标记的杭-小鼠IgG、杭-小鼠 IgGl或抗-小鼠IgG^1抗体检测结合的抗体。总IgG抗体滴度确定为达到饱和时测定的 50%的光密度(0D450nm，)所需的稀释度的倒数。对于IgGl和IgG^i，计算终点滴度。显示了平均抗体滴度。实施例7 流感病毒PR8的红血球凝集抑制滴度的測定測定小鼠血清抑制流感病毒PR8导致的鸡红血球凝集的能力。为使非特异性抑制剂失活，首先用受体破坏酶(RDE，kiken，Japan)处理血清。简言之，将三份RDE添加至一份血清中并在37°C下孵育过夜。通过在56°C孵育30min使RDE失活。取决于血清的稀释度，添加0到6份PBS以使血清的最终稀释度为1 4到1 10。在ν-底微量滴定板中使 RDE-处理的血清连续地两倍稀释。将调节至8HAU/50ul的等体积流感PR8病毒添加到各孔。 覆盖板并在室温下孵育30min，然后添加PBS中的鸡红血球。通过搅拌混合平板、覆盖， 并使RBC在室温下放置lh。HAI滴度确定为包含非凝集RBC的最后ー排的稀释度的倒数。为测定对抗其他流感病毒株的HAI滴度，使用相应的病毒株(代替流感病毒A/PR/8/34)来进行RBC凝集。对于这些其他的流感病毒株，可能必须使用来自不同物种(例如火鸡或马) 的RBC进行凝集。实施例8 鼠科动物流感模型以下A型流感病毒用于不同的研究:A/PR/8/34 (HlNl)、A/FM/1/47 (HlNl)、A/ Aichi/2/68(X31) (H3N2)和A/WSM33 (HlNl)。为测定各病毒的致死剂量，在用异氟烷浅麻醉下经鼻给予小鼠系列稀释的病毒Ox 50 μ 1)。感染后至少20天监控被感染小鼠的体重和体温。处死损失超过30%的初始体重或体温等于或低于30°C的小鼠。根据Reed and Munch (Reed LJ等· 1938. Am. J. Hyg. 27，493-497)的方法计算各病毒株的LD50滴度。为测定不同疫苗的效力，用指定化合物免疫小鼠并用相应实施例中所示的致死剂量的同源或异源流感病毒GLD50或10LD50)激发小鼠，并如上所述进行监控。处死损失超过30%的初始体重或体温等于或低于30°C的小鼠。感染后20天各处理组的存活动物％表示在相应实施例中。实施例9 :Qi3 -ecHA(PR8)和AP205-ecHA(PR8)疫苗对抗致死的同源流感病毒激发在第0 天用 50、5 或 0. 5μ g 的 Q^-ecHA(PR8)_l、Q^-ecHA(PR8)_2 或 Q β -ecHA (PR8) -3 (实施例5中获得的)或者45或4. 5 μ g的ecHA (PR8)(实施例1中获得的)或配制在200 μ 1 PBS中的50 μ g的Q β VLP皮下免疫每组三只雌性balb/c小鼠。在第20天通过眼窝后放血收集血清，并使用实施例6和7中所述的ecHA(PR8)-特异性ELISA 或红血球凝集抑制(HAI)试验进行分析。在第21天用4LD50的小鼠适应的流感病毒A/ PR/8/34激发所有小鼠并如实施例8中所述监控20天内的存活率。该实验的结果显示于表 1中。如表1所示，用三种Qi3 -ecHA(PR8)偶联物的任何ー种以每种测试浓度免疫的所有动物都在致死性激发中存活下来，而仅用载体Ο β)免疫的所有动物均死亡。在接受两种测试浓度的仅ecHA(PR8)的动物中观察到部分保护作用。类似地，与仅用ecHA(PR8)免疫的动物相比，接受Q β -ecHA(PR8)的所有动物中ecHA-PR8特异性滴度和HAI滴度显著提高。诱导的HAI滴度与抗-ecHA(PR8)抗体ELISA滴度成正比，提示诱导的抗体识别病毒上的天然 HA。这些结果显示，ecHA-PR8与Qi3 VLP的偶联，即使是低偶联密度下，显著增强ecHA-PR8 的免疫原性，而当抗原与使得载体诱导表位抑制的风险最小化的VLP偶联时，QiiVLP的免疫应答显著降低。此外，用0.5yg具有低偶联密度(17HA/VLP)的Q β-ecHA (PR8)的单次免疫能够完全保护小鼠以对抗同源流感病毒A/PR8/34的致死激发。表1:
权利要求
1.组合物，包含(a)病毒样颗粒(VLP)，其具有至少ー个第一附着位点，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；和(b)至少ー种抗原，其具有至少ー个第二附着位点，其中所述至少ー种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；其中(a)和(b)通过所述至少ー个第一附着位点和所述至少ー个第二附着位点连接。
2.权利要求1的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是蛋白，其中所述蛋白由以下亚基组成(a) HAl亚基，包含SEQ ID NO :75的11位氨基酸到3 位氨基酸或优选由其组成，和(b)HA2亚基，由SEQ ID NO :76的1到176位组成。
3.前述任ー权利要求的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白的胞外域。
4.前述任ー权利要求的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是选自 A 型流感病毒血凝素蛋白亚型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、 H15和H16的A型流感病毒血凝素蛋白亚型的胞外域，且其中优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型HI、H2和H3的A型流感病毒血凝素蛋白亚型的胞外域。
5.前述任ー权利要求的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是天然存在的流感病毒血凝素蛋白胞外域。
6.前述任ー权利要求的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :39所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :39具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1至5中任一的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :40所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :40具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
8.权利要求1至5中任一的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :41所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :41具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9.权利要求1至5中任一的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :42所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO :42具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
10.权利要求1至5中任一的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :43所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO 43 具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
11.权利要求1至5中任一的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组⑴SEQ ID NO :73所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO 73 具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
12.权利要求1至5中任一的組合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组(i) SEQ ID NO :74所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO 74具有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
13.权利要求1的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是B型流感病毒血凝素蛋白的胞外域。
14.前述任ー权利要求的組合物，其中所述抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域，且其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是三聚体形式。
15.权利要求1至13中任一的組合物，其中所述抗原是所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段是所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的HAl亚基或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述HAl亚基的片段。
16.权利要求15的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含流感病毒血凝素蛋白的至少ー个八链胶冻卷桶和至少ー个α-螺旋。
17.权利要求15或16任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含受体结合域或优选由其組成。
18.权利要求15至17任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段还包含痕迹酯酶域。
19.权利要求15至18任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的98和195位的酪氨酸，对应于SEQ ID NO 75的153位的色氨酸和对应于SEQ ID NO 75的位的组氨酸的氨基酸残基。
20.权利要求15至19任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO :75的半胱氨酸残基，优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的64、76、97、139位的半胱氨酸残基，更优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的52、64、76、97、139、277、281、305 位的半胱氨酸残基。
21.权利要求15至20任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的57位到276位的氨基酸序列或优选由其組成。
22.权利要求15至21任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的46位到310位的氨基酸序列或优选由其組成。
23.权利要求15至22任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的42位到310位的氨基酸序列或优选由其組成。
24.权利要求15至23任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的M位到276位的氨基酸序列或优选由其組成。
25.权利要求15至M任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的M位到270位的氨基酸序列或优选由其組成。
26.权利要求15至25任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的5 位到276位的氨基酸序列或优选由其组成。
27.权利要求15至沈任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO 75的5 位到270位的氨基酸序列或优选由其组成。
28.权利要求15至27任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域与 A 型流感病毒株 A/California/07/2009 (HlNl) (Genbank 登录号ACP44189. 1)或 A/ Perth/16/2009 (H3N2) (Genbank登录号ACS71642. 1)的HA胞外域具有至少70%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是天然存在的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域。
29.权利要求15至27任一的組合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域与 B 型流感病毒株 B/Brisbane/33/2008 (Genbank 登录号AC拟9387. 1)、B/ Guangzhou/01/2007 (Genbank 登录号ABX71684. 1)或 B/Brisbane/60/2008 (Genbank 登录号AC拟9383. 1)的HA胞外域具有至少70%的氨基酸序列同一性，且其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是天然存在的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域。
30.前述任ー权利要求的組合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其組成或者由其組成。
31.前述任ー权利要求的組合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体ΑΡ205或RNA噬菌体CpCb5的重组外壳蛋白、基本上由其組成或者由其組成。
32.前述任ー权利要求的組合物，其中所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、基本上由其組成或者由其組成，所述重组外壳蛋白包含选自下组的氨基酸序列或优选由其組成(a) SEQ ID NO 1 ； (b)SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 的混合；(c) SEQ ID NO 19 ； (d) SEQ ID NO 92 ； (e)SEQ ID NO 93 禾ロ (f)SEQ ID NO 940
33.前述任ー权利要求的組合物，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。
34.前述任ー权利要求的組合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由其組成或由其組成。
35.前述任ー权利要求的組合物，其中所述病毒样颗粒包含含有SEQID Ν0:1或优选由其組成的重组外壳蛋白、基本上由其組成或者由其組成。
36.前述任ー权利要求的組合物，其中所述第一附着位点和所述第二附着位点经由至少ー个非肽共价键连接。
37.前述任ー权利要求的組合物，其中所述第一附着位点包含或优选是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。
38.前述任ー权利要求的組合物，其中所述第二附着位点包含或优选是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。
39.包含有效量的前述任ー权利要求的組合物的疫苗组合物，其中所述疫苗組合物还包含佐剂。
40.一种药物組合物，其包含(a)权利要求1-38中任一项的组合物或权利要求39的疫苗组合物；和(b)药学上可接受的载体。
41.ー种免疫方法，所述方法包括向动物，优选向人，施用权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物或权利要求40的药物组合物。
42.权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物或权利要求40的药物組合物，其用作药物。
43.权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物或权利要求40的药物組合物，其用于治疗流感的方法中。
44.一种治疗、改善和/或预防流感的方法，所述方法包括向动物，优选向人，施用免疫有效量的权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物和/或权利要求40的药物组合物。
全文摘要
本发明属于医学、公共健康、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供用于治疗、改善和/或预防流感的组合物、疫苗组合物和药物组合物。本发明的组合物、疫苗组合物和药物组合物包含RNA噬菌体的病毒样颗粒和至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段。当施用于动物，优选人时，所述组合物、疫苗组合物和药物组合物有效诱导免疫应答，特别是抗体应答，其中典型地和优选地，所述抗体应答针对流感病毒。因此，本发明还提供治疗、改善和/或预防流感病毒感染的方法。
文档编号A61K47/48GK102573915SQ201080019069
公开日2012年7月11日 申请日期2010年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者A·杰格勒纳, M·巴赫曼, P·桑丹 申请人:赛托斯生物技术公司