一种检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测人细小病毒B19的试剂盒，它包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示的引物对，扩增来自人细小病毒B19的基因。本发明提供的试剂盒可以扩增人细小病毒B19的基因片段，特异性强，灵敏度高，重复性好，用于快速检测血液制品，具有良好的应用前景。
【专利说明】—种检测人细小病毒BI 9的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测人细小病毒B19的试剂盒，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]人细小病毒B19 (Human parvovirus B19)是一种直径约为18~26nm的无包膜单链DNA病毒，属于细小病毒科红病毒属，可引起传染性红斑、急性关节炎，感染孕妇可造成胎儿水肿乃至胎儿死亡。一般通过呼吸道传播，也可经输血、血液制品以及血-胎途径传播。人细小病毒B19的直径小而且无包膜，灭活和去除工作非常困难，因此，需要建立一种B19的检测方法，有效检测血液制品中是否含有B19，以提高血液制品的安全性。
[0003]目前，B19的检测方法分为血清学、分子生物学和组织学检测三大技术。其中，以ELISA为代表的血清学检查和以PCR为代表的分子生物学检测较为容易。但由于B19病毒不易体外培养，抗原制备也比较困难，导致B19的血清学检测难以普遍应用。PCR检测则不需要培养病毒，也不需要制备抗原，更容易推广使用。
[0004]赵国强等，“荧光定量PCR检测B19病毒方法的建立”，郑州大学学报(医学版)2005年5月第40卷第3期等文献公开了采用QPCR特异检测B19病毒的方法，然而，这些方法都需要采用探针进行检测，以确保检测方法的特异性和准确度，导致检测成本太高。
[0005]需要寻找一种成本更为低廉的PCR检测方法。
【发明内容】
[0006]为解决上述问题，本发明提供了一种新的PCR检测人细小病毒B19的试剂盒和方
法。`
[0007]本发明检测人细小病毒B19的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示的引物对，扩增来自人细小病毒B19的基因。
[0008]所述试剂盒还包含阳性对照模板:含有核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示基因片段的DNA分子。
[0009]优选地,所述DNA分子是包含SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的重组质粒。进一步优选地，所述重组质粒为重组PMD19-T质粒。
[0010]本发明还提供了一种检测人细小病毒B19的方法，它包括如下步骤:
[0011](I)模板制备:提取待检样本中的DNA ；
[0012](2)扩增:采用核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示的引物对，以步骤(1)提取的样本DNA为模板，PCR扩增。
[0013](3)结果检测:对扩增结果进行检测，即可。
[0014]其中，步骤(1)中，所述待检样本为血液制品。
[0015]其中，步骤(2)中，所述PCR扩增以含有核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示基因片段的DNA分子为阳性对照模板。
[0016]优选地,所述DNA分子是包含SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的重组质粒。进一步优选地，所述重组质粒为重组PMD19-T质粒。
[0017]其中，所述的PCR为荧光定量PCR。
[0018]荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光结合物质或荧光标记的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
[0019]本发明进一步提供了 SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自人细小病毒B19的基因。
[0020]本发明通过设计特定的检测引物，在不使用探针的情况下特异扩增B19的基因，同时，灵敏度高，重复性好，准确度高，可有效检测血液制品中B19病毒的含量，具有良好的应用前景。
[0021]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容做进一步地详细说明。但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定。1:DNA maker，IOObp递增；2:B19DNA扩增产物；3:重组质粒扩增产物；4:阴性对照
[0023]图2特异性扩增检测曲线
[0024]图3QPCR的熔解曲线；
[0025]图4QPCR的标准曲线；`
[0026]图5样品检测结果与实际值之间的相关性。
【具体实施方式】
[0027]试验材料:
[0028]1.病毒株
[0029]人细小病毒B19阳性血浆(成都蓉生药业有限责任公司血源检测中心保存)；猪细小病毒 PPV (Porcine parvovirus, ATCC,批号:2547326);伪狂犬病毒 PRV (Pseudorabiesvirus,中国兽医监察所，批号:198777);牛细小病毒BPV (Bovine parvovirus,成都生物制品研究所，批号:20111118);鼠细小病毒MVM (Minute virus of mice, ATCC，批号:58073406)。
[0030]2.主要试剂及用品
[0031]高纯度病毒核酸提取试剂盒(HighPure Viral Nucleic Kit, Roche,11858874001);质粒回收试剂盒(Takara);静脉用丙种球蛋白(IVIG，成都蓉生药业有限责任公司)；L、P和S三种20nm滤器分别购自三个不同的生产厂家，均为常规市售品。
[0032]实施例1引物的设计及阳性模板的制备
[0033]1.方法
[0034]1.1引物的设计与合成
[0035]根据NCBI上B19病毒的序列(NC_000883)，在B19的VPl区上设计引物，上游引物(Pl)为 5’ -GGCACCTCTCAA AACACT-3’ (SEQ ID NO:1);下游引物(P2)为 5’ -CCACTCCTTGCTG ATACTC-3’ (SEQ ID NO:2)。委托 Takara 公司合成。
[0036]1.2采用设计的引物扩增B19基因
[0037]1.2.1核酸提取
[0038]用High Pure Viral Nucleic Kit试剂盒提取B19阳性血浆以及含有B19阳性血浆IVIG的核酸，以试剂盒提取的B19阴性血浆的核酸作为阴性对照，-40°C条件下保存。
[0039]1.2.2扩增和鉴定
[0040]以B19的基因组DNA为模板，以Pl和P2为引物，PCR扩增:
[0041]反应体系(总体积25 μ I):反应预混液(PrimeSTARftHS,货号R040A，Takara公司)12.5 μ 1、引物 1μ I (lOOpmol)、样品 DNA 模板 I μ I (I μ g)、以 ddH20 补足至 25 μ I。
[0042]反应条件:95°C变性5min ；94°C lmin, 52°C lmin, 72°C 45s，后 3 步进行 30 个循环；
4°C保存。
[0043]用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
[0044]1.3阳性对照模板(标准品)(重组质粒PMD19-T-VP1)的构建及鉴定
[0045]步骤1.2电泳鉴定后，胶回收扩增得到的片段，与PMD19-T载体连接，得重组质粒，转化ToplO感受态菌，将菌落PCR初步鉴定正确的阳性质粒菌株送Invitrogen测序，并用质粒回收试剂盒回收，得PMD19-T-VP1重组质粒，用紫外分光光度计分别在260nm和280nm的条件下测定所回收质粒的纯度和浓度，稀释到108COpies/l.! I后，_40°C保存备用。
[0046]以构建的PMD19-T-VP1重组质`粒为模板，以Pl和P2为引物，PCR扩增，扩增的反应体系和反应条件同前述1.2.2。
[0047]用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
[0048]2、检测结果
[0049]实验结果如图1所示，采用本发明引物扩增B19基因，得到了长度为160bp (泳道
2)的扩增片段，其序列如下:
[0050]SEQ ID NO:3:
[0051 ] 5，-GGCACCTCTCAAAACACTAGAATATCCTTACGCCCTGGGCCAGTGTCTCAGCCATATCACCACTGGGACACAGATAAATATGTCACAGGTATAAATGCCATTTCTCATGGTCAAACCACATATGGTAATGCTGAAGATAAAGAGTATCAGCAAGGAGTGG-3，
[0052]以包含前述扩增片段的重组质粒PMD19-T-VP1为模板，也可以唯一扩增得到长度为160bp的基因片段(泳道3)，说明制备得到的重组质粒PMD19-T-VP1可以作为阳性模板(标准品)使用。
[0053]实验结果说明，本发明设计的引物可以有效扩增B19的基因。
[0054]实施例2本发明引物的特异性检测
[0055]1、方法
[0056]分别按实施例1中1.2.1的方法提取B19、PRV、BPV、MMV、PK-15的DNA作为模板，PCR扩增，每个样品设置三个复孔，B19 (孔1、孔2、孔3)、PRV (孔4、孔5、孔6)、BPV (孔7、孔 8、孔 9)、MMV (孔 10、孔 11、孔 12)、PK-15 (孔 13、孔 14、孔 15):
[0057]反应体系(总体积为15 μ l):Eva Green 预混液(SsoFast? HvaGrccnS Supermix,172-5201，Bio-rad 公司)7.5 μ 1、上下游引物各 0.5 μ 1、模板 DNAl μ I (以 ddH20 补足15μ I)。[0058]反应条件:95°C5min ；95°C 10s，52°C IOs 和 72°C 10s，后 3 个步骤重复 40 个循环。
[0059]查看扩增曲线。
[0060]2、结果
[0061]如图2所示，在PCR过程中的每个循环收集荧光信号，随着反应循环次数的增加，孔I~孔3中的样品，荧光强度增强，呈平滑的指数曲线，说明孔I~孔3中的样品模板进行了有效扩增；而孔4~15中的样本，在整个反应过程中检测不到荧光信号的变化，说明孔4~15中的样本没有发生扩增。
[0062]因此，本发明引物可以扩增B19基因(孔I~孔3)，但不会扩增PRV、BPV、MMV、PK-15的基因(孔4~15)。
[0063]实验结果说明，本发明引物可以特异扩增B19的基因，而不会扩增其他病毒或者细胞的基因，特异性强。
[0064]实施例3本发明引物的灵敏度检测
[0065]1、方法
[0066]将B19高浓度阳性血浆按下表1进行稀释，得含有不同滴度的B19的样品；
[0067]按实施例1中1.2.1的方法分别提取样品核酸作为模板，PCR扩增，在不同的时间重复3次，每次各浓度做8个平行管:
[0068]反应体系(总体积为15 μ I):Eva Green预混液7.5 μ 1、上下游引物各0.5 μ 1、模板 DNAl μ I (以 ddH20 补足 15μ I)。
[0069]反应条件:95°C5min ；95°C 10s，52°C IOs 和 72°C 10s，后 3 个步骤重复 40 个循环。
[0070]查看扩增曲线，如果在40个CP值内有扩增反应曲线计为检出，如果在40个CP值内无扩增反应曲线计为未检出。
[0071]2、结果
[0072]灵敏性实验结果见表1:
[0073]表1QPCR方法检测B19的灵敏性
【权利要求】
1.一种检测人细小病毒B19的试剂盒，其特征在于:包含核苷酸序列如SEQ ID N0:1~2所示的引物对，扩增来自人细小病毒B19的基因。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含阳性对照模板:含有核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示基因片段的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述DNA分子是含有核苷酸序列如SEQID NO:3所示基因片段的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:所述重组质粒为重组PMD19-T质粒。
5.一种检测人细小病毒B19的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)模板制备:提取待检样本中的DNA； (2)扩增:采用核苷酸序列如SEQID N0:1~2所示的引物对，以步骤(1)提取的样本DNA为模板，PCR扩增； (3)结果检测:对扩增结果进行检测，即可。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述待检样本是血液制品。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述PCR扩增以含有核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示基因片段的DNA分子为阳性对照模板。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述DNA分子是含有核苷酸序列如SEQID NO:3所示基因片段的重组质粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述重组质粒为重组PMD19-T质粒；优选地，所述PCR是荧光定量PCR。
10.SEQ ID ΝΟ:1~2所示核苷酸序列的用途，其特征在于:其用于扩增或检测来自人细小病毒B19的基因。
【文档编号】C12N15/11GK103820581SQ201410098048
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】郑朝共, 许锬, 容新宗, 黄琰 申请人:成都蓉生药业有限责任公司