麻疹病毒检测方法、膜层析用试验用具及其测试试剂盒的制作方法

专利名称：麻疹病毒检测方法、膜层析用试验用具及其测试试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用可与麻疹病毒抗原结合的抗麻疹病毒单克隆抗体检测试样中 麻疹病毒的麻疹病毒检测方法。本发明还涉及一种检测麻疹病毒用侧向流动式膜层析用试 验用具及使用此用具的膜层析用测试试剂盒。本发明还涉及一种检测麻疹病毒用渗透式膜 层析用测试试剂盒。
背景技术：
麻疹病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，是一种直径100 250nm、具包膜的单链 RNA病毒。感染麻疹病毒后，麻疹病毒首先在呼吸器官上皮细胞繁殖，然后以淋巴结、脾脏、 胸腺等全身淋巴组织为中心增殖，引起淋巴细胞减少和免疫系统衰退等症状。麻疹病毒感 染性极强，一旦人感染上，还可能引起二次感染，因此麻疹感染的检查极为重要。作为检查有无感染麻疹病毒的方法已知有检查存在于被检者体内的麻疹病毒抗 体的方法。比如W093/22683中记述的一种方法是让至少含一个能用麻疹特异性免疫球蛋 白IgM识别的表位的重组麻疹核蛋白质抗原与人血清试样接触，检测是否存在与上述抗原 结合的麻疹特异性免疫球蛋白IgM。此外，W097/07400中也记述了一种检测样本中所含麻疹病毒的方法。具体而言， 作为将对病毒表层蛋白质有亲和性的分子固定在微小固体载体表面的病毒凝聚检查药，记 述了一种将抗麻疹病毒单克隆抗体固定在微小固体载体表面的麻疹病毒检查药。然而，W093/22683中记述的方法存在以下问题即使感染麻疹病毒，到IgM的抗体 价在感染者体内上升为止也要至少三天时间，因此，用上述方法无法早期发现麻疹病毒感 染。不仅如此，在感染麻疹病毒到IgM的抗体价上升期间用上述方法检查的话，还可能判断 为假阴性。另一方面，采用W097/07400中记述的方法，麻疹病毒本身存在与否虽然可以判 断，但在上述方法中必须使用阳性对照和阴性对照，检查作业复杂，不能迅速判定有无麻疹病毒。如上所述，麻疹病毒感染能力非常强，要求通过迅速、切实地检查有无麻疹病毒来 早期发现麻疹病毒，采取措施预防二次感染。用W093/22683和W097/07400上记述的方法 在迅速性和切实性上均不能提供满足上述要求的麻疹感染检查。

发明内容
因此，本发明包括一种从样本中检查麻疹病毒的方法，包括在固相上形成包含可与麻疹病毒核蛋白质结合且固定在固相上的第一单克隆抗 体、可与麻疹病毒核蛋白质结合且被标记的不同于上述第一单克隆抗体的第二单克隆抗体 和样本所含的麻疹病毒核蛋白质的复合物；及根据在该固相上形成的复合物的标记数检查 麻疫病毒。
所述方法，还包括通过混合样本和含非离子表面活性剂的样本处理液来制备测 定试样的步骤，其中，所述复合物形成步骤包括用已制备的所述测定试样形成复合物。所述方法，所述样本选自包括唾液、鼻涕、鼻腔拭液、鼻腔吸取液和咽喉拭液的组 群。所述第一单克隆抗体是从包括识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白第135位 到241位氨基酸序列的单克隆抗体、识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白第485位到 525位氨基酸序列的单克隆抗体及识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白第91位到134 位氨基酸序列的单克隆抗体在内的单克隆抗体组群中选择一个单克隆抗体，所述第二单克 隆抗体是从所述单克隆抗体组群选出的其他抗体。所述第一单克隆抗体是识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白第135位到241 位氨基酸序列的单克隆抗体和识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白第485位到525位 氨基酸序列的单克隆抗体其中之一，所述第二单克隆抗体是识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白第91位到134 位氨基酸序列的单克隆抗体。本发明还提供一种膜层析用试验用具，包括膜载体，具有固定有能与麻疹病毒核蛋白质结合的第一单克隆抗体的判断区；及标记附着垫，用于附着能与麻疹病毒核蛋白质结合且不同于上述第一单克隆抗体 的被标记第二单克隆抗体。所述试验用具，其特中所述判断区还固定能与麻疹病毒核蛋白质结合、不同于所 述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体的第三单克隆抗体。本发明再提供一种膜层析用测试试剂盒，包括前述膜层析用试验用具；及含有 非离子表面活性剂、用于与样本混合制备测定试样的样本处理液。所述测试试剂盒，还包括可盛放上述测定试剂、可插入所述试验用具的试验容器。本发明又提供一种膜层析用测试试剂盒，包括具备膜载体的试验用具，该膜载体含有固定有可与麻疹病毒核蛋白质结合的第一 单克隆抗体的判断区；及含有第二单克隆抗体的标记液，该第二单克隆抗体能与麻疹病毒核蛋白质结合、 且与第一单克隆抗体不同；所述测试试剂盒，所述判断区还可固定能与麻疹病毒核蛋白质结合、与所述第一 单克隆抗体和所述第二单克隆抗体不同的第三单克隆抗体；所述标记液还含有非离子表面活性剂。本发明同时提供一种杂交瘤，选自包括寄存于国家技术评估研究所专利微生物寄 存中心的保藏号为 NITE BP-563、NITE BP_564、NITE BP-565 和 NITE BP-566 的组群。本发明也提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由前述的杂交瘤产生。


图1为侧向流动式膜层析用(免疫层析用)测试试剂盒的简要结构图。图2为图1所示膜层析用测试试剂盒的试验用具的(a)平面图、(b)侧视图。图3为样本处理容器的分解平面图。
图4为图1所示膜层析用测试试剂盒的使用状态图。图5为膜层析用试验用具的其他例示图。图6为渗透式膜层析用测试试剂盒的简要结构图。图7为图6所示试验用具的(a)平面图、(b)从X_X箭头方向的剖面图。图8为麻疹病毒核蛋白质位点缺失示意图。
具体实施例方式下面，参考附图详细说明本发明涉及的样本分析仪的具体实施方式
。在本说明书中所说的“单克隆抗体”还包含单克隆抗体的片段及其衍生物。具体 而言，可列举出有Fab、Fab'、F(ab' )2和评￥片段等。单克隆抗体的亚类不限于IgG，也 可以是IgM。抗麻疹病毒单克隆抗体使用能与麻疹病毒核蛋白质结合的抗麻疹病毒单克隆抗 体。一般认为核蛋白质比诸如包膜等其他结构蛋白质抗原性强且在患者样本中含量多，因 此可以提高抗麻疹病毒单克隆抗体检测的灵敏度。抗麻疹单克隆抗体可以用常规免疫学手法，在被免疫动物身上免疫麻疹病毒抗 原，用被免疫动物的细胞培育杂交瘤来获得。能产生2649抗体的杂交瘤MV2-2649、能产生 3241抗体的杂交瘤MV2-3241、能产生3707抗体的杂交瘤MV2-3707、能产生320抗体的杂 交瘤 MV3-320 分别以保藏号 NITE BP_563、NITE BP-564、NITEBP-565、NITE BP-566 寄存于 国家技术评估研究所专利微生物寄存中心(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足 2-5-8 ；保藏日2008年4月16日)。麻疹病毒抗原可以由麻疹感染者的生物试样提炼而成。麻疹病毒抗原也可以通过 将编码麻疹病毒核蛋白质的DNA插入质粒中，将其导入宿主细胞使其表达来获得。将抗原在被免疫动物身上免疫时，最好使用佐剂。使用佐剂可以提高被免疫动物 对抗原的免疫应答性。对佐剂的种类没有特别限定，比如可以使用福氏完全佐剂(FCA)、 福氏不完全佐剂(FIA)、单磷酰脂质A(MPL，商品名Ribi)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM，商品名 RIBI)、单磷酰脂质A和海藻糖二霉菌酸酯混合液(MPL+TDM，商品名RIBI佐剂系统)、百日 咳疫苗(Bordetella pertussisVaccine)、胞壁酰二肽(MDP)、明巩佐剂(ALUM)等。也可 以将其中几种佐剂组合起来使用。最好首次免疫时用FCA，第二次以后免疫时使用FIA和 RIBI。可以根据佐剂的有无投放和投放途径以及被免疫动物的种类等适当变更免疫日 程。以下就以小鼠作为被免疫动物进行免疫的情况进行说明。作为首次免疫，向腹腔内、皮下或肌肉中注射混有佐剂的麻疹病毒抗原溶液。所注 射的混有佐剂的麻疹病毒抗原溶液体积最好为0. 05ml 1ml，麻疹病毒抗原的含量最好为 10 200 u g。不用佐剂时，也可以通过增大麻疹抗原含量进行腹腔注射来进行免疫。首次 免疫后，每隔约2 4周进行1 6次追加免疫。追加免疫约1 4周后，通过静脉注射麻 疹病毒抗原溶液进行最终免疫。最终免疫约3 5天后，从小鼠分离脾细胞，即可得到抗体 产生细胞。如上制作的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。骨髓瘤细胞的来源不限，可以使用 来源于小鼠、大鼠和人等的细胞，但最好使用来源于与被免疫动物同种的动物的骨髓瘤，尤以来源于同种同系动物的骨髓瘤为宜。当使用小鼠作为骨髓瘤来源时，比如最好使用小鼠 骨髓瘤 P3X63-Ag8、P3X-63-Ag8-Ul、P3NSl_Ag4、SP2/o_Agl4、P3X63_Ag8/653 等骨髓瘤细胞 株。骨髓瘤细胞中有的会产生免疫球蛋白轻链，用此骨髓瘤细胞作为融合对象，有时抗体产 生细胞所产生的免疫球蛋白重链会和此轻链结合。为此，最好使用不产生免疫球蛋白轻链 的骨髓瘤细胞比如P3X63-Ag8 653和SP2/o_Agl4等。融合抗体产生细胞和骨髓瘤细胞获得杂交瘤用常规方法即可。比如，使用聚乙二 醇(PEG)的方法(PEG法)、使用仙台病毒的方法和使用电融合装置的方法等。用PEG法时， 在约含30 60% PEG(平均分子量1000 6000)的适当培养基或缓冲液中以1 1到 10 1、最好为5 1到10 1的混合比例悬浮脾细胞和骨髓瘤细胞，在温度约25 37 度、PH6 8的条件下反应约30秒 3分钟即可。反应结束后，清洗细胞，除去PEG溶液， 在次磺嘌呤培养基(HT培养基)等再次悬浮，比如可以在微量滴定板中播种，继续培养。融合后的细胞在选择培养基培养，选择杂交瘤。作为选择培养基，只要是亲 本细胞株死亡，仅融合细胞能繁殖的培养基即可，无特别限定。通常使用次黄嘌呤 (hypoxantin)-氨基蝶呤(aminopterin)-胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)培养基(HAT培养 基)。杂交瘤在普通融合操作一天后，通过添加选择培养基，或将培养基的一部分最好是约 一半换成选择培养基来开始筛选，培养7 10天。培养的杂交瘤是否产生了所希望的抗体可以通过采集培养上清进行抗体价检测 来确认。检测抗体价可以使用普通方法，无特别限定。比如在固化的抗原上添加阶段性稀释 的上述上清进行反应，再促使用荧光物质、酶或放射性同位素(RI)等标记的二次抗体(抗 球蛋白抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体等)反应，就能够检测出上述上清中产生的抗体，就可 以测定抗体价。如此筛选培养板各孔中的培养上清，可以获得产生所需抗体的杂交瘤。然后分离单一克隆。作为分离法可以使用众所周知的方法，无特别限定。比如可 以用有限稀释法、软琼脂法、利用荧光激活细胞分选仪的方法等。比如用有限稀释法时，在 培养基中阶段性稀释杂交瘤至1细胞/孔，播入培养板后培养。约培养10天后，确认1群/ 孔的培养上清中是否产生目标单克隆抗体，即可单离目标杂交瘤克隆。获得的杂交瘤克隆 与约10w/v%的二甲基亚砜(DMS0)或甘油等防冻剂一起冷冻，在-196 -70度保存，可半 永久性地保存。细胞可以用时在37度前后的恒温槽中快速解冻使用。最好充分清洗到无 残留冷冻保护剂的细胞毒性后使用。要检查杂交瘤产生的抗体的免疫球蛋白亚类，只要在一般条件下培养杂交瘤，用 市面上出售的抗体类 亚类鉴定用试剂盒等测试该培养上清中分泌的抗体即可。杂交瘤产生的单克隆抗体的获得方法可根据需要量和杂交瘤的性状等适当选择 使用。比如，有从移植了杂交瘤的小鼠腹水获取的方法和通过培养细胞从培养上清获取的 方法等。如果是能在小鼠腹腔内繁殖的杂交瘤，可以从腹水获得几毫克每毫升的高浓度单 克隆抗体。在体内不能繁殖的杂交瘤从培养细胞的培养上清获得。通过培养细胞获得单克 隆抗体的方法比在体内进行的方法抗体产量小，但具有小鼠腹腔内所含免疫球蛋白和其他 杂质混入少、易生成的优点。当从移植杂交瘤的小鼠腹水获取单克隆抗体时，向预先注射姥鲛烷(2，6，10， 14-四甲基十五烷)等有免疫抑制作用的物质的小鼠腹腔内移植杂交瘤，约一周后采集滞 留的腹水。当杂交瘤为不同动物种类的细胞融合而成(比如小鼠和大鼠)时，最好使用裸鼠和放射线处理小鼠。当从细胞培养上清获得抗体时，可以用用于维持细胞的静置培养法、高密度培养 法和细胞悬浮培养瓶培养法等培养方法。通过运用其中某一种方法培养杂交瘤，获得含有 抗体的培养上清。从腹水和培养上清提炼单克隆抗体可以通过众所周知的纯化免疫球蛋白方法进 行。作为纯化免疫球蛋白方法无特别限定，比如可以使用用了硫酸铵和硫酸钠的盐析法、聚 乙二醇法、乙醇法、DEAE离子交换层析法、琼脂过滤法等。当单克隆抗体为小鼠IgG时，可通过使用蛋白质A结合载体或抗小鼠免疫球蛋白 结合载体的亲和层析法提纯。如上生成的抗麻疹病毒单克隆抗体可以用于检测样本或用样本制备的试样中所 含麻疹病毒的免疫检测。作为检测麻疹病毒的免疫检测方法最好是以所谓夹心法为检测原 理的免疫检测法，其包括用抗麻疹病毒的第一和第二抗体形成含有固定在固相上的第一抗 体、标记的第二抗体及麻疹病毒的复合物的步骤。为此，第一抗麻疹病毒单克隆抗体和第二 抗麻疹病毒单克隆抗体应使用能识别麻疹病毒核蛋白质的不同部位并与之结合的抗麻疹 病毒单克隆抗体。用夹心法检测麻疹病毒时，作为固定抗体的固相可以使用以常规方法即可固定抗 体的固相，比如可以使用薄膜、微球、粒子、纳米粒子、试管、微量滴定板等众所周知的固相。 作为标记抗体的标记物可以使用酶、放射性同位素、荧光发光性标记物、显色粒子、胶体粒丁寸。在上述各种以夹心法为检测原理的免疫检测法中，从检测的简便性及快速性的角 度看，以用薄膜作固相的膜层析法为宜。作为膜层析法有侧向流动式膜层析法和渗透式膜 层析法，本实施方式的抗麻疹病毒单克隆抗体可以适用于其中任何一种方法。在此，所谓侧向流动式膜层析法指在含固定有捕捉物的判断区的层析膜滴下试 样，将试样在层析膜平行展开，以此检测被判断区捕获的待测物。另一方面，所谓渗透式膜 层析法是在表面固定有捕捉待测物(抗原)的捕捉物(抗体)的层析膜滴下含有待测物的 试样，使试样垂直通过层析膜，以此检测被膜表面捕获的待测物。无论哪种方法待测物都要 被一定标记物标记，因此根据层析膜上是否出现标记就可确认是否有待测物。下面参照附图，就本实施方式涉及的膜层析用测试试剂盒进行说明。另外，作为抗麻疹病毒单克隆抗体，本发明提供以下三种单克隆抗体识别并结合 序列号9所示麻疹病毒核蛋白质第135位到241位氨基酸序列的单克隆抗体(135-241抗 体)、识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白质第485位到525位氨基酸序列的单克隆抗 体(485-525抗体)和识别并结合序列号9所示麻疹病毒核蛋白质第91位到134位氨基酸 序列的单克隆抗体(91-134抗体)。在夹心法检测麻疹病毒中，可以以上述三种单克隆抗体其中之一作为被标记的第 二抗体、以其他抗体作为固定在固相上的第一抗体使用。对所用抗体组合没有特别限定，但 从提高检测灵敏度的观点，最好使用135-241抗体或485-525抗体作为固定在固相上的第 一抗体，使用91-134抗体作为被标记的第二抗体。也可在第一抗体的基础上再在固相上固 定与第一、第二抗体不同的第三抗体，也可以采取将135-241抗体和485-525抗体都固定在 固相上使用的形式。
图1为第一实施方式涉及的膜层析用测试试剂盒(以下称测试试剂盒)的外观 图。此测试试剂盒是用于侧向流动式膜层析法(侧向流动式免疫层析法)的测试试剂盒， 包含盛放试样的试验容器1、从一端4a插入试验容器1使用的膜层析用试验用具4 (以下称 试验用具4)、盛放与样本混合制备测定试样的样本处理液15的样本处理容器14。图2为 图1的试验用具4的(a)平面图和(b)侧视图。试验用具4如图2所示，在表面有粘附层的塑料板制衬底12上有由棉质无纺布构 成的加样垫5、由玻璃纤维无纺布构成的标记附着垫7、由硝化纤维等多孔物质构成的层析 用膜载体(以下称层析膜)9和由纤维无纺布构成的吸收垫11。标记附着垫7接触加样垫5配置，吸附能与麻疹抗原特异性结合且被标记物标记 的抗麻疹病毒单克隆抗体(以下称标记抗体)和质控用标记物。标记抗体为用蓝色乳胶粒 子标记的抗麻疹病毒单克隆抗体，质控用标记物为用红色乳胶粒子标记的亲和素。层析膜9 与标记附着垫7接触配置，从上游一侧依次有条状判断区9A和质控区9B。判断区9A固定 能与麻疹病毒抗原特异性结合的抗麻疹病毒单克隆抗体(以下称捕捉用抗体)，质控区9B 固定生物素。吸收垫11与层析膜9接触配置。当试样中含有麻疹病毒时，吸附在标记附着垫7的标记抗体识别麻疹病毒的一定 部位，通过抗原抗体反应与之结合，形成复合物。层析膜9的判断区9A上固定的捕捉用抗体 识别麻疹病毒的其他部位将复合物捕获。当捕获到复合物时，判断区9A上出现蓝色线条， 目视即可判断麻疹病毒的存在。亲和素不会被层析膜9上的捕捉用抗体捕获，但能与生物素特异性结合，因此质 控用标记物被固定在质控区9B的生物素捕获。当质控用标记物被捕获时，质控区9B出现 红色线条，目测可以确认质控用标记物已到达质控区9B。质控区9B设在判断区9A的下游， 因此凭红色线条即可确认试样已通过判断区9A。试验容器1由试管状且有底呈筒形的容器构成，该容器有两个部分，一个是有开 口 lb的锥形接受部分16，一个是底部la盛放试样的试样盛放部分17。试验容器1的外壁表面贴有标签3。标签3在试验用具4插入试验容器1时与试 验用具4的判断区9A和质控区9B相对应的位置有显示试验用具4判断区9A和质控区9B 的记号24a、24b。如图所示，此标签3的记号24a、24b分别为“T”、“ ！，，图3为样本处理容器14的分解平面图。如图所示，样本处理容器14由塑料瓶141、 瓶嘴142和瓶盖143构成。塑料瓶141其内部盛放样本处理液15，在塑料瓶141开口由瓶 盖143密封的状态下保存。瓶嘴142的前端有排样口，内侧装有过滤部件。装在瓶嘴142内侧的过滤部件依次由第一玻璃纤维滤纸、膜口径大于第一玻璃纤 维滤纸的第二玻璃纤维滤纸和无纺布状的玻璃过滤片层叠而成。此过滤部件安装在瓶嘴 142上时，玻璃过滤片在瓶嘴142与塑料瓶141的连接部位一侧，第一玻璃纤维滤纸在排样 口一侧。过滤部件不限于此结构，但最好使用能除去样本中粘性成份的无纺布状的玻璃过 滤片，以在此无纺布状的玻璃过滤片上加一张或二张玻璃纤维滤纸组合起来使用最佳。样本处理液15最好为含有表面活性剂的水溶液。此目的是因麻疹病毒有外皮(包 膜)，故用表面活性剂在外皮上开孔，使内部的抗原蛋白质释放到样本处理液中。对于表面活性剂的种类无特别限定，可以广泛使用阴离子表面活性剂、阳离子表 面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂等表面活性剂。
非离子表面活性剂可以使用聚环氧乙烷类的非离子表面活性剂，最好使用乙醚 (ether)型非离子表面活性剂。具体而言，最好是从由以下组份构成的组群中选择的一种或 二种以上的混合物辛烷基酚聚氧乙烯(9)醚(Polyoxyethylene octylphenol ether)、辛 烷基酚聚氧乙烯(10)醚、壬基酚聚氧乙烯(9)醚(Polyoxyethylene nonyl phenylether) 等烷基酚聚氧乙烯醚类、聚氧化乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate)、单油酸脱水山梨糖醇酉旨(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate)等聚山 梨酯(PolyoxyethyleneSorbitan Fatty Acid Esters)类、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、 聚氧乙烯烷基醚。两性离子表面活性剂无特别限定，最好使用3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨 基]-1-丙磺酸(CHAPS)等。如果增加非离子表面活性剂在样本处理液15的添加量的话， 也可以并用两性表面活性剂，以提高其溶解性，从而提高样本处理液的保存稳定性。对阴离子表面活性剂无特别限定，最好使用十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、 N-十二烷基肌氨酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠等。样本处理液15最好含有硫氰酸类化合物以免出现非特异性反应。硫氰酸类化合 物除硫氰酸(HNCS)外，还可以是硫氰酸酯和硫氰酸盐等，只要是水溶性化合物，无特别限 制。构成硫氰酸的盐如有含钠、钾等金属成份的无机盐基或有机盐基铵盐等。其中也包含 其盐的水合物和溶剂合物。具体而言，有硫氰酸钠、硫氰酸钙、硫氰酸铵、硫氰酸胍等。最适 用的是硫氰酸钙和硫氰酸胍。样本处理液15最好还含有还原剂，以降低样本(特别是鼻涕、鼻腔吸取液、鼻腔拭 液和咽喉拭液)中的高粘性物质的粘性。作为还原剂最好是含硫还原性化合物，比如有巯 基乙胺、巯基乙胺盐酸盐、巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、乙胺硫脲、三 (2-甲酰乙基)膦化氢(TriS(2-carb0Xyethyl)ph0Sphine)、次硫酸盐及亚硫酸盐等。样本处理液15也可以含有螯合剂，以抑制酶的活性分解抗原蛋白或降低非特异 性反应。作为螯合剂，比如可以列举出乙二胺四乙酸、1，2_环己二胺四乙酸、乙二胺四乙 酸、亚氨基二乙酸、羟乙基亚氨基二乙酸、1，3-丙二胺四乙酸(DPTA-0H)、二乙烯三胺五乙 酸(DTPA)、乙二胺二乙酸、乙二胺二乙酸二丙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、乙二胺 四(亚甲基膦酸)、乙二胺二丙酸、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺三 乙酸、氨基三乙酸、氨基三丙酸、次氨基三(亚甲基膦酸)、(2羟乙基)氨基乙酸及1，2-丙 二胺四乙酸及其以上试剂的盐类。样本处理液15也可添加碱金属离子。作为碱金属离子，比如有锂+ (Li+)、钠+ (Na+)、 钾+ (K+)、铷+ (Rb+)、铯+ (Cs+)、钫+(Fr+)等，但最好可以使用钠和钾。碱金属离子可以使用一 种或二种以上。对于能生成这种碱金属离子的化合物无特别限定，比如可以从氯化钠、氯化 钾、氢氧化钠、氢氧化钾、EDTA钠盐、叠氮化钠构成的组群中选择一种或二种以上混合使用。 通过添加碱金属离子可以防止非特异性反应。碱金属离子的含量为0. 3M 2. 0M，理想的是 0. 4M 1.5厘，尤以0. 45M 1.0M为佳。样本处理液15最好还含有缓冲剂，比如可以列举出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、 ACES、M0PS0、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPS0、TAPS0, P0PS0、HEPPS0、EPPS、Tricine、Bicine、 TAPS、CHES、CAPS0、CAPS 等 Good 缓冲剂，其中以 ADA、PIPES、ACES、M0PS0、BES、MOPS、TES、 HEPES、DIPS0、TAPS0、P0PS0、HEPPS0、EPPS 为宜，最好是 PIPES、ACES、M0PS0、BES、M0PS、TES、
10HEPES。样本处理液的pH为5 10，以5. 5 9. 0为佳，最好在6. 0 8. 0。与样本处理液15混合的样本只要是从受检者采集的生物成份即可，无特别限定。 比如可以是血液、血清、尿液、鼻涕、唾液、鼻腔拭液、鼻腔吸取液或咽喉拭液。特别以在麻疹 感染者易检出麻疹病毒的唾液、鼻涕、鼻腔拭液或咽喉拭液为宜。下面，就本实施方式涉及的测试试剂盒的使用方法用图4加以说明。首先，打开样本处理容器14的盖143，将已采集的样本加入瓶141，与样本处理液 15混合，制备测定试样13。接着，用瓶嘴142取代瓶盖143，并将瓶嘴142安装在瓶141的 开口部位，通过瓶嘴142将测定试样13供应到试验容器1。然后，将试验用具4由一端4a 插入试验容器1，使一端4a触试验容器1底部la (在此所说“底部”指试验容器1带圆形的 部分)。以此使试验用具4和试验容器1上下方向对位。在此状态下，放置10 20分钟， 则测定试样13由于毛细管现象依次沿加样垫5、标记附着垫7、层析膜9和吸收垫11展开。 当测定试样13通过标记附着垫7时，吸附在标记附着垫7的标记物(标记抗麻疹病毒单克 隆抗体和质控用标记物)析出到测定试样中。若测定试样13含有麻疹病毒，则在上述作用 下，判断区9A出现蓝色线条。不论有无病毒，质控区9B总出现红色线条。上面以特定的实施形式为例进行了说明，本实施方式的测试试剂盒不限于上述例 示，可以有各种变化。比如，也可以用玻璃纤维、纤维素纤维等材质取代棉花作加样垫5。也可以用纤维 素纤维取代玻璃纤维作标记附着垫7。标记抗体和质控用标记物除显色乳胶粒子外，还可 以用酶、荧光发光性标记物、磁性标记物、放射性同位素、胶体金粒子等标记。作为层析膜 9可以用尼龙(如也可以羧基和烷基作为置换基的导入了氨基的修饰尼龙)、聚偏氟乙烯 (PVDF)和醋酸纤维素取代硝化纤维。吸收垫11可以用玻璃纤维取代硝化纤维。如此，加样垫5、标记附着垫7、层析膜9和吸收垫11除无纺布或多孔材质材料外， 还可以使用能通过毛细管现象展开试样的各种结构的材料。在上述实施方式中，例示了判断区9A只固定有一种抗麻疹病毒单克隆抗体的结 构，结构不限于此，也可以判断区固定二种以上的抗麻疹病毒单克隆抗体。比如，也可以在 制作试验用具4时将含有二种以上抗麻疹病毒单克隆抗体的试样涂于层析膜9。如此采取 判断区固定二种以上抗麻疹病毒单克隆抗体的结构，可以提高麻疹病毒检测灵敏度，进而 降低假阴性的可能性。另外，还可以在层析膜9上分别固定二种抗麻疹病毒单克隆抗体，设 置二个以上判断区。在上述实施方式中例示，有一个用于盛放测定试样13的试验容器1，将试验用具4 插入试验容器1进行检测，但不限于此结构，也可以采取没有试验容器1的结构。比如也可 以将用样本处理液15制备的测定试样13直接滴到加样垫5。采用此种结构时，最好将试验 用具4比如放入在加样垫5、层析膜9和吸收垫11的相应位置上有开口的盒子里。此结构 的试验用具4 一例见图5。如图5所示，将试验用具4放入盒子40中可以防止测定试样从 试验用具4的各部件渗漏，可以卫生地进行检测。加之，盒40上的几个开口使测定试样13 所含液体成份易于蒸发，促进测定试样的展开。在图5所示结构中，盒40与加样垫5对应位置上的开口 50采取所谓的锥形，使开 口面积向内侧渐小。采取这种结构，滴到加样垫5的测定试样因为在开口 50处存留一定 量，所以即使加样过多也不会从试验用具4溢出。同时由于测定试样在开口 50处存有一定量，储存的测定试样会依次在试验用具4上展开，省去了定期加少量测定试样的麻烦，检查 可以简便地进行。以上就侧向流动式膜层析用测试试剂盒进行了说明，本实施方式涉及的抗麻疹病 毒单克隆抗体还可以应用在渗透式膜层析用测试试剂盒。下面参照附图，就渗透式膜层析 用测试试剂盒进行说明。图6为第二实施方式涉及的膜层析用测试试剂盒的显示图。此测试试剂盒为用于 渗透式膜层析法的测试试剂盒，包括试验用具31和盛放用于混合样本制备测定试样的样 本处理液37的样本处理容器36。图7(a)为试验用具31的平面图，图7(b)为沿X_X方向的剖面图。试验用具31 从下层依次有吸收垫35、层析膜34和覆盖部件32，由这些部件层叠而成。覆盖部件32有 开口 33，通过此开口 33，配置在下一层的层析膜34的判断区34A露出。判断区34A固定有 捕捉抗体。样本处理容器36与第一实施方式的样本处理容器14结构相同。放在样本处理容 器36的样本处理液37含有与第一实施方式的样本处理液15相同的成份，本实施方式的样 本处理液37含有标记抗体。下面就本实施方式的测试试剂盒的使用方法进行说明。首先，如在第一实施方式所述，在样本处理液37悬浮样本，制备测定试样。如果样 本中含有麻疹病毒，样本处理液37中所含标记抗体就会与麻疹病毒因抗原抗体反应而结 合，在测定试样中形成由麻疹病毒-标记抗体构成的复合物。再按第一实施方式所述顺序将制备的测定试样滴入一定量于试验用具31开口 33。在此状态下放置20分钟，则测定试样通过层析膜34，被其下层的吸收垫35吸收。当测 定试样含麻疹病毒时，固定在层析膜34判断区34A的捕捉抗体识别不同于标记抗体和麻疹 病毒的结合部位的部位，与麻疹病毒结合，在判断区34A上形成含标记抗体-麻疹病毒-捕 捉抗体的复合物。于是，判断区34A上出现蓝色线条。通过目测确认判断区34A上是否出 现蓝色线条，即可知道麻疹病毒的存在与否。在本实施方式中，标记抗体与样本处理液37装在同一容器中，不限于此结构。比 如也可以分别用不同的容器装标记抗体和样本处理液37。还可以使标记抗体吸附在层析膜 34，可以随测定试样所含液体成份游离。如上所述，本实施方式可以提供用抗麻疹病毒单克隆抗体便捷检测麻疹病毒的测 试试剂盒。而且，第一实施方式的膜层析用测试试剂盒只有试验容器1、试验用具4和样本 处理容器14，第二实施方式的膜层析用测试试剂盒只有试验用具31和样本处理容器36，可 以用很少量的部件检出麻疹病毒，检测非常方便。实施例1.单克隆抗体的制备1-1.麻疹病毒核蛋白质的制备从取自各野生麻疹病毒株的RNA通过逆转录反应合成cDNA。通过聚合酶链式反 应(PCR)从合成的各cDNA合成麻疹病毒核蛋白质的DNA产物，用小麦胚芽无细胞表达用试 剂盒 ENDEXT (注册商标)(Wheat Germ Expression TRI-GG Kit (Cell-Free science 公司 制))将DNA产物植入试剂盒附带的载体，让麻疹病毒核蛋白质表达，制备出抗原液。用定序仪(应用生物系统公司制)和序列分析软件(日立软件公司制)分析基因序列和分析预测 氨基酸序列。在此，将获得的麻疹病毒核蛋白质的氨基酸序列表示为序列表的序列号1 9。以下称由序列号1的氨基酸序列构成的麻疹病毒核蛋白质为Agl，由序列号2的氨基酸 序列构成的麻疹病毒核蛋白质为Ag2，依次类推，称由序列号N的氨基酸序列构成的麻疹病 毒核蛋白质为AgN。1-2.小鼠免疫在lOOiiL含有60iig购自先进生物技术有限公司(AdvancedBiotechnologies Inc.，以下称ABI公司)的麻疹病毒株(商品名风疹(麻疹)病毒感染细胞提取物)的磷 酸缓冲液(PBS)中添加100 u 1福氏完全佐剂(FCA)，浮化后，制备200 u L FCA混合麻疹病 毒抗原溶液。再用同样方法，但不使用FCA而使用福氏不完全佐剂(FIA)，制备FIA混合麻 疹病毒抗原溶液200 iiL。用FCA混合麻疹病毒抗原溶液200 u L腹腔注射7周龄的BALB/C鼠，进行首次免 疫。首次免疫后，每隔2周用FIA混合麻疹病毒抗原溶液200 yl进行追加免疫。最后一次 免疫不使用佐剂，取代ABI公司的麻疹病毒株，静脉注射500 iiL 1-1中制备的含50 yg Ag5 的PBS。(免疫实验1)。除用1-1制备的Ag5或Ag8取代ABI公司的麻疹病毒株作为免疫抗原外，用与上 述免疫实验1相同的方法，进行小鼠免疫(免疫实验2)。从最终免疫4天后，分离脾细胞，用PEG法使之与P3X63-Ag8 653鼠骨髓肿瘤细 胞融合，生产杂交瘤。1-3杂交瘤培养将杂交瘤悬浮于HAT培养基，浓度至2. 5X106细胞/ml，向96孔微孔板(Corning 康宁公司制；以下称培养板)各孔加2.5X105细胞/孔。培养板在371、8%0)2的恒温槽 内静置，开始杂交瘤培养。翌日，在培养板各孔添加HAT培养基各25 yL，继续培养。培养 10天，出现杂交瘤集落时筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。1-4杂交瘤筛选在含有0. lw/v% NaN3的0. 1M磷酸缓冲液(PBS pH7. 5)中添加蛋白质浓度稀释 到0. 5 u g/ml的麻疹病毒(ABI公司制)，制备致敏用麻疹病毒溶液。将此致敏用麻疹病毒 溶液100 u 1加入96孔板(NUNC公司制)各孔(以下称抗原固定板)。抗原固定板4°C过 夜后，用含有0. 05%吐温(Tween)20的PBS(以下称第一缓冲液)洗涤三次。洗涤后，加含 lw/v% BSA的PBS(以下称第二缓冲液)300 yl于抗原固定板各孔，2 8°C静置存放4小 时以上。抗原固定板在使用前一直在2 8°C保存。加第二缓冲液于抗原固定板各孔各75 yl。再从培养板各孔取出1-3制备的杂交 瘤培养上清，加入抗原固定板各孔中每孔25 yl。添加第二缓冲液和培养上清后，室温培养 一小时。培养后，用300 u 1第一缓冲液洗涤抗原固定板各孔。洗涤后，加用第二缓冲液稀释 10000倍的辣根过氧化物酶(P0D)标记抗小鼠Ig多克隆抗体(DAK0公司制；编号No. P0447) 于抗原固定板各孔各100 yl。室温反应30分钟后，用300 yl第一缓冲液洗涤抗原固定板 各孔。洗涤后，每孔各加P0D的底物含邻苯二胺(0PD)的底物液100 u 1，室温静置10分钟。 再加含2N H2S04的反应终止液于抗原固定板各孔各100 ill后，对于各孔中的反应液，用酶 标仪(分子仪器公司制)测定492nm处的吸光度。
其结果，确认制备的杂交瘤产生了抗麻疹病毒单克隆抗体。2.抗麻疹病毒单克隆抗体反应性的确认通过以下实验确认在上述1制备的杂交瘤所产生的抗麻疹病毒单克隆抗体的反 应性。2-1.反应性试验用第二缓冲液分别将1-1制备的含Agl Ag9的抗原液稀释到10倍。制备琼脂糖凝胶珠-抗鼠抗体IgG悬浮液，此悬浮液含有浓度15v/v%的市面上出 售的抗鼠抗体IgG与琼脂糖凝胶珠(AmershamBiosciences公司制)结合而成的粒子。以 等量混合琼脂糖凝胶珠_抗鼠抗体IgG悬浮液、含Agl Ag9的抗原液用第二缓冲液分别 稀释到0. 2 0. 5 y g/mL的抗原稀释液和第二缓冲液，制备抗原试样。加入96孔V底板(sanplatec公司制)各孔抗原试样60 i L和各30 i L抗体液， 抗体液含有用第二缓冲液稀释到抗体浓度为l.Oyg/ml的本实施例的抗麻疹病毒单克隆 抗体(anti-MV mAb)。底板在室温下搅拌60分钟后，静置10分钟，使琼脂糖凝胶珠沉降。然后，按以下步骤制备抗麻疹病毒单克隆抗体致敏的微量滴定板。作为在微量滴 定板致敏的抗麻疹病毒单克隆抗体使用的是杂交瘤MV1-225产生的225抗体。用0. 1M磷酸缓冲液(PBS pH7. 5)将含225抗体的抗体液稀释到浓度10 u g/ml。 在微量滴定板(NUNC公司制)各孔各加入100 yL此225抗体稀释溶液，4°C静置一晚。用 第一缓冲液洗涤各孔三次后，在各孔各注入300 u L第二缓冲液，将225抗体封闭在板孔中 (以下称此微量滴定板为225抗体致敏板)。封闭后，在2 8°C静置保存4小时以上。225 抗体致敏板使用前一直在2 8°C保存。杂交瘤MV1-225由希森美康株式会社寄存在国家技术评估研究所专利微生物寄 存中心，保藏号为NITE BP-599(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2_5_8)，保藏 日期为2008年6月26日。接下来，用第二缓冲液混合，使生物素标记的抗麻疹病毒单克隆抗体液达到 0. 25 u g/ml，链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(POD)溶液达到40mU/ml，制备POD标记抗体液。作为生物素标记的抗麻疹病毒单克隆抗体使用的是杂交瘤MV1-1117产生的1117 抗体。杂交瘤MV1-1117由希森美康株式会社寄存在国家技术评估研究所专利微生物寄存 中心，保藏号为NITE BP-600(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2_5_8)，保藏日 期为2008年6月26日。弃225抗体致敏板中的第二缓冲液。弃后，在225抗体致敏板各孔添加上述POD 标记抗体液50 y L和96孔V底板的反应液上清50 u L，搅拌60分钟后，用第二缓冲液洗涤 三遍225抗体致敏板各孔。此时，因本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体对抗原的反应性，可能出现96孔V底 板的反应液上清中含有抗原和不含抗原的情况。S卩，当本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体对抗原有反应性(抗体和抗原结合)时， 反应液中形成由琼脂糖凝胶珠_抗鼠抗体IgG-抗菌素麻疹病毒单克隆抗体_抗原组成的 复合物。此复合物由于琼脂糖凝胶珠的重量而沉入96孔V底板的孔中，因此上清中不含抗 原。而当本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体对抗原没有反应性(抗体和抗原未结合)时，反应液中没有形成上述复合物，抗原未沉降，因此，上清中含有抗原。因此，当本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体对抗原不显示反应性时，通过上述操 作在225抗体致敏板的孔中形成225抗体-抗原-POD标记抗体构成的复合物。当本实施 例的抗麻疹病毒单克隆抗体对抗原显示反应性时，不形成上述复合物。在225抗体致敏板各孔加POD的底物含0PD的底物液各100 yl，室温中静置10分 钟。再在225抗体致敏板各孔各加100 u 1反应终止液(含2N H2S04)，用酶标仪(Molecular Devices公司制)测定各孔中反应液在492nm处的吸光度(吸光度A)。在此获得的吸光度 为吸光度A。从上述说明得知，吸光度A显示225抗体致敏板各孔有无复合物。即，吸光度A越 低，复合物越少，本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体显示出对抗原的高反应性。作为质控实验，用第二缓冲液取代1. 0 u g/mL抗体液制备质控试样，进行同样的 试验，测定吸光度。在此获得的吸光度设为吸光度B。作为质控试验，还用第二缓冲液代替1. 0 u g/mL抗体液和抗原试样，制备质控试 样，进行同样试验，测定吸光度。在此获得的吸光度设为吸光度C。用所得吸光度A C按下述(1)式求使用本实施例抗麻疹病毒单克隆抗体获得的 测定试样的吸光率。所得吸光率见表1，基于吸光率的反应性评价结果如表2所示。在表 2中，“+++”表示(1)式所求吸光率为90%以上，“++”表示50%以上，“ + ”表示30%以上， “_”表示为30%。吸光率(%) = {1-(A-C)/(B-C)} X100... (1)[表1]
6抗体使用抗原抗体裒雄名同麵照mm家接病_蛋囱质抗原种HID3HIH1HIHID9D5A型AfilAsZAa4As5Ae6Ag7抗原名MV2-2649IeGI/K88.092.287.1100.097.896.985.699.282.0吸光串MV2-3707IeG1/ir57.493.197.2100.069.599.189.7100.0100.0MV2-32411eG2a/K55.194.397.2100.074.2100.092.5100.0100.0MV3-320leG2b/jc100.099.6100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0[表 2]
細使用杭原镔体宽後名阕型对玀S雌麵毒核邐白癀抗原种HID3HIH1H1H1D9D5A型A^IAfiZAfl3Afi4Afi6Afi7As8A 9杭原名MV2-2G49IeGI/if+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ + ++ +反应性MV2-3707IcQI/K+ ++ + ++ + ++ + ++ ++ + ++ ++ + ++ + +MV2-32411eG2a/K+ ++ + ++ + ++ + ++ ++ + ++ + ++ + ++ + +MV3-320+ + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ + +如表1和表2所示，本实施例获得的2649抗体、3707抗体、3241抗体和320抗体 均对所有麻疹病毒核蛋白质Agl Ag9显示出高反应性。由此结果得知，本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体可与麻疹病毒核蛋白质结合， 且反应性不因置换改变部分核蛋白质的氨基酸序列而降低。3.抗麻疹病毒单克隆抗体对麻疹病毒抗原结合部位的筛选通过以下实验确认了本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体对麻疹病毒核蛋白质的 结合部位。
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3-1.抗原试样的制备用第二缓冲液将含有上述1-1中制备的麻疹病毒核蛋白质Ag3的抗原液稀释到 0. 15 u g/mL,制备含Ag3的抗原试样。3-2.抑制试验以与上述2-1所述同样方法制作225抗体致敏板。在此225抗体致敏板各孔加含 Ag3的抗原试样100 u L，搅拌30分钟。之后，用第一缓冲液冲洗225抗体致敏板各孔三次。用第二缓冲液混合，使生物素标记的3707抗体溶液浓度为0. g/ml，链霉亲和 素标记过氧化物酶(POD)溶液浓度为40mU/ml，制备POD标记抗体液。在225抗体致敏板各孔添加用第二缓冲液将本实施例获得的2649抗体稀释到 10 u g/ml的抗体液50 u 1和上述POD标记抗体液50 u 1，室温搅拌60分钟。搅拌后，用第 一缓冲液冲洗三遍225抗体致敏板。在225抗体致敏板各孔中各加入含0PD的底物液100 u L，室温中静置10分钟。再 在225抗体致敏板各孔中各加100 u L反应终止液(含2NH2S04)后，用酶标仪测定在492nm 处的吸光度。在此所得吸光度设为吸光度D。作为质控试验，用第二缓冲液代替10 u g/mL抗体液，制备质控试样，进行同样试 验，测定吸光度。在此获得的吸光度设为吸光度E。作为质控试验，还用第二缓冲液代替10 y g/mL抗体液和抗原试样，制备质控试 样，进行同样试验，测定吸光度。在此获得的吸光度设为吸光度F。用所得吸光度D F按下述(2)式求在上述实施例中测定试样的吸光率。基于所 得吸光率评价2649抗体和3707抗体对麻疹病毒核蛋白质的结合部位的相同性。所得吸光率见表3。基于吸光率得出的相同性评价结果如表4所示。在表4中， “+++”表示⑵式所求吸光率为90%以上，“++”表示50%以上，“ + ”表示30%以上，“-”表 示为30%。以上述实验例为例，根据(2)式求出的吸光率越高，说明2649抗体和3707抗体对 麻疹病毒核蛋白质的结合部位的相同性越高。吸光率(%) = {1-(D-F)/(E-F)} X100... (2)此实验对从2649抗体、3707抗体、3241抗体和320抗体中可以选择的所有组合， 进行了上述实验例中10 y g/mL抗体液所含抗体与生物素标记抗体的组合。[表3] [表 4]
从表3和表4的结果可以看出，2649抗体和3707抗体对麻疹病毒核蛋白质的结合 部位相同性很低，两抗体为可以识别麻疹病毒核蛋白质不同部位并结合的抗体。关于2649 抗体和3241抗体的组合、320抗体和3707抗体的组合、320抗体和3241抗体的组合也可以 看出同样的结果。从以上结果可以知道，按照特定的组合使用本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体， 可以使抗麻疹病毒单克隆抗体与麻疹病毒核蛋白质各不相同的第一结合部位和第二结合 部位结合，用夹心法可以检出麻疹病毒。4.试验用具的制作用本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体制作如图1所示侧向流动式膜层析用试验 用具。试验用具1用320抗体作为附着在标记附着垫7的第一单克隆抗体。用2649抗体和3707抗 体作为固定在层析膜9判断区9A的第二单克隆抗体。如图1所示，用磷酸缓冲液(pH7. 0)将3707抗体稀释到2. OmglgG/mL,制备3707 抗体液。用抗体涂敷机(Bio-Dot公司制)将含3707抗体的抗体液在硝化纤维膜制层析膜 9的判断区9A涂1mm宽，再移开1mm位置，同样涂含2649抗体的抗体液，50°C干燥30分钟。干燥后的层析膜9浸入含BSA的磷酸缓冲液(pH7. 0))，将抗体固定在层析膜9上。 再用洗涤液(含有S D S的磷酸缓冲液(pH7. 0))洗涤，40°C干燥120分钟，获得层析膜9。然后，将320抗体致敏于蓝色显色聚苯乙烯乳胶粒子(粒径0. 3 y m)，悬浮于分散 用缓冲液(含BSA和蔗糖的磷酸缓冲液(pH7. 0))，制备320抗体致敏乳胶粒子悬浮液。320 抗体浓度为每lmLl%乳胶粒子中有200 u g IgG。将此320抗体致敏乳胶粒子悬浮液加入 玻璃纤维制衬垫后，用真空干燥机干燥，获得标记附着垫7。加样垫5、吸收垫11和衬底12使用上述实施方式中说明的部件，即获得试验用具 1。再用3241抗体取代3707抗体作为固定在层析膜9判断区9A的抗体，除此之外用 上述同样方法获得试验用具2。5.性能试验5-1.培养麻疹病毒的检测实验此实验为用在4中制备的试验用具1和试验用具2检测试样中的麻疹病毒的实验。在本试验例中，作为病毒液使用的试样是培养以下表5所示二种野生型麻疹病毒 Vero/SLAM细胞，用含有1 % BSA的磷酸钠缓冲液稀释而成的。IC-B株和Edmonston株均为 野生型麻疹病毒，IC-B株的氨基酸序列如序列号10所示。Edmonston株的氨基酸序列与序 列号9所示氨基酸序列相同。
病毒液中的病毒浓度用蚀斑法定量，用PFU表示其定量值。各病毒液中的病毒浓 度如表5所示。PFU(溶斑形成单位，plaque-forming unit)是一种表示病毒数的单位，该 病毒数是使100%汇合(confluent)的细胞感染病毒，根据感染细胞所形成的蚀斑能确认 的感染病毒细胞数算出的。在表5中，以对数形式来表示PFU。力卩150iiL—定浓度的病毒液于800iiL含0. 3w/v% NP-40 (乙基苯基聚乙二醇) 的磷酸缓冲液(PH7.3)中进行混合，作为抗原试样。约200 y L抗原试样滴入玻璃试管，上述方法制作的试验用具1的上游(加样垫1) 浸入此玻璃试管静置约10分钟。用肉眼判断判断区9A的乳胶粒子显色情况。确认显色的 试样评价为(+)，未确认显色的试样评价为(_)。结果见表5。[表 5] 如表5所示，当抗原试样中的病毒浓度在一定浓度以上时，试验用具1和试验用具 2的判断区9A都有显色，可以检出麻疹病毒。据此证实，用本实施方式的膜层析用测试试剂 盒可以切实检测出麻疹病毒，并能够检测出野生型麻疹病毒。5-2.患者样本的麻疹病毒检测实验本项实验是用在4所制试验用具1和试验用具2检测从患者采集的样本中的麻疹病毒。另外，在5-1中使用了判断区9A的二种抗体液涂于不同位置而制的试验用具，本 实验例中使用的试验用具是将二种抗体液混合而得的试样涂于判断区9A制作的。用棉棒从经RT-PCR法筛选判断为麻疹病毒阳性的各患者采集咽喉拭液。将此棉 棒浸入lw/v% SDS溶液75ii L中，使咽喉拭液溶出到SDS溶液。溶液中的病毒浓度通过比较实时定量PCR法获得的Ct值和用5-1所述方法定量 的已知浓度试样的CT值算出。加上述SDS溶液于800 ii L含0. 3w/v% NP-40 (乙基苯基聚乙二醇)的磷酸缓冲液 (PH7.3)中进行混合，作为抗原试样。用此抗原试样按照5-1所述步骤和判断条件，判断判断区9A中的乳胶粒子显色。 该判断结果如表6所示。[表 6]
18 如表6所示，本实施例制作的试验用具1和试验用具2均可以在所有患者样本中 检出麻疹病毒。由此结果证实，用本实施例制作的试验用具可以切实检测出患者样本中的麻疹病 毒。此结果还证实，从患者身上采集样本制备测定试样，用此测定试样和膜层析用试验用具 可以非常简便地用肉眼检测出麻疹病毒。6.表位分析通过以下实验，确认本实施例的抗麻疹病毒单克隆抗体对麻疹病毒核蛋白的抗原 识别位点。6-1.麻疹病毒位点缺失核蛋白的制作从谷胱甘肽S-转移酶(以下称GST)融合蛋白表达用载体pGEX-4T_3(GE Healthcare公司制)，用含限制酶Not I识别序列(以下称Not I序列)的序列号11的引 物和含限制酶BamH I识别序列(以下称BamHI序列)的序列号12的引物进行聚合酶链反 应(PCR)，合成在GST序列上游插入Not I序列、下游插入BamH I序列的cDNA。合成的cDNA用限制酶Not I和限制酶BamH I处理。同样，用限制酶Not I和限 制酶BamH I处理麦胚无细胞表达用试剂盒ENDEXT (注册商标)(Wheat Germ Expression TRI-GG Kit) (Cell-Free science 公司制)附带的载体。连接所得限制酶处理产物，构建含有GST序列的麦胚无细胞表达用载体。从麻疹病毒的Edomonston株提取的RNA经逆转录反应，合成cDNA。合成的麻疹 病毒cDNA用含限制酶Xho I识别序列(以下称Xho I序列)的序列号13的引物和序列号 14的引物进行PCR扩增。以所得PCR产物为模具，用序列号13的引物和含NotI序列的序 列号15的引物进行PCR扩增。以此合成在麻疹病毒核蛋白序列上游含Xho I序列、下游含 NotI序列的DNA产物。用限制酶Xho I和限制酶NotI处理合成的DNA产物。同样用限制酶Xho I和限 制酶NotI处理含GST序列的麦胚无细胞表达用载体。连接所得限制酶处理产物，构建含麻 疹病毒核蛋白序列和GST序列的麦胚无细胞表达载体(以下称为全长核蛋白表达载体)。 用麦胚无细胞表达用试剂盒ENDEXT (注册商标)(Wheat Germ Expression TRI-GG Kit) (Cell-Free science公司制)从构建的全长核蛋白表达载体让核蛋白全长表达。用下述方法制作从全长麻疹病毒核蛋白除去C末端的位点缺失核蛋白 Truncate-1 4，以便分析2649抗体、3707抗体、3241抗体和320抗体的抗原识别位点。图 8示意性地显示了所制作的位点缺失核蛋白。以全长核蛋白表达载体为基础，用序列号16的引物和序列号17的引物及KOD-Plus位点特异性突变导入试剂盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)(东洋纺公司制) 对除麻疹病毒核蛋白第399位到C末端(第525位)氨基酸外的质粒全长进行扩增，构 建Truncate-1表达载体。从构建的Truncate-1表达载体，用麦胚无细胞表达用试剂盒 ENDEXT (注册商标)(Wheat Germ Expression TRI-GG Kit) (Cell-Free science 公司制) 让Trimcate-1表达。以此获得从第399位到C末端氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-2用与Truncate-1同样的手法获得，所不同的是用序列号18的引物取 代序列号17的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白从第321位到C末端氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-3也用与Truncate-1同样的手法获得，所不同的是用序列号19的引物 取代序列号17的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白从第242位到C末端氨基酸缺失的核蛋 白。Truncate-4也用与Truncate-1同样的手法获得，所不同的是用序列号20的引物 取代序列号17的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白从第135位到C末端氨基酸缺失的核蛋白。然后制作从核蛋白N末端到第398位氨基酸缺失的Trimcate-5。Trimcate-5用上述合成全长核蛋白表达载体和让载体表达同样的手法获得，所不 同的是用序列号21的引物取代序列号13的引物。序列号21的引物是对应于麻疹病毒核 蛋白从cDNA第1195个碱基到下游的碱基序列的引物，是含有Xho I序列的引物。为了进一步分析2649抗体、3707抗体、3241抗体和320抗体的抗原识别位点，还 制作了位点缺失核蛋白Trimcate-6 14。制作的位点缺失核蛋白见图8。以全长核蛋白表达载体为基础，用序列号22的引物和序列号23的引物，按照 KOD-Plus位点特异性突变导入试剂盒(东洋纺公司制)的使用方法对麻疹病毒核蛋白 除N末端到第44位氨基酸外的质粒全长进行扩增，构建Trimcate-6表达用载体。从 构建的Truncate-6表达载体，用麦胚无细胞表达用试剂盒ENDEXT(注册商标)(Wheat GermExpression TRI-GG Kit) (Cell-Free science 公司制)让 Truncate-6 表达。以此获 得N末端到第44位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-7用与Trimcate-6相同手法获得，所不同的是用序列号24的引物取代 序列号22的引物，用序列号25的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 45位到90位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-8用与Truncate-6相同手法获得，所不同的是用序列号26的引物取代 序列号22的引物，用序列号27的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 91位到134位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-9用与Truncate-6相同手法获得，所不同的是用序列号28的引物取代 序列号22的引物，用序列号20的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 135位到170位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-10用与Truncate-6相同手法获得，所不同的是用序列号29的引物取代 序列号22的引物，用序列号30的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 171位到206位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-11用与Truncate-6相同手法获得，所不同的是用序列号31的引物取代 序列号22的引物，用序列号32的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第207位到241位氨基酸缺失的核蛋白。Trimcate-12用与Trimcate-6相同手法获得，所不同的是用序列号33的引物取代 序列号22的引物，用序列号17的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 399位到441位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-13用与Truncate-6相同手法获得，所不同的是用序列号34的引物取代 序列号22的引物，用序列号35的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 442位到484位氨基酸缺失的核蛋白。Truncate-14用与Truncate-6相同手法获得，所不同的是用序列号16的引物取代 序列号22的引物，用序列号36的引物取代序列号23的引物。以此获得麻疹病毒核蛋白第 485位到525位氨基酸缺失的核蛋白。所得全长核蛋白和Trimcate-1 14用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B 50 % (GE Healthcare公司制)纯化作为GST结合蛋白。作为阴性质控，在麦胚无细胞表达试剂盒附带的载体插入附加了 GST序列的质 粒，经转录、翻译息，纯化蛋白质。以所得蛋白质为抗原识别位点的阴性质控。6-2.抗原识别位点分析用第二缓冲液稀释上述6-1中制备的全长核蛋白和Trimcate-1 14的各抗原 液，制备抗原试样。按下述要领制备抗GST抗体(GE Healthcare公司制)被致敏的微量滴定板。用含0. lw/v% NaN3的0. 1M磷酸缓冲液(PBS，pH7. 5)将抗GST抗体液稀释到浓度 5 u g/ml，在微量滴定板(NUNC公司制)各孔各加入50 y L此抗GST抗体稀释溶液，4°C静置 一晚。用第一缓冲液洗涤各孔三次后，在各孔各注入300 yL第二缓冲液，进行封闭(以下 称此微量滴定板为抗GST抗体致敏板)。封闭后，在2 8°C静置保存4小时以上。抗GST 抗体致敏板使用前一直在2 8°C保存。弃抗GST抗体致敏板中的第二缓冲液。弃后，在抗GST抗体致敏板各孔添加上述 全长核蛋白和Trimcate-1 14的各抗原试样50 u L，搅拌30分钟。然后，用第二缓冲液洗 涤三遍抗GST抗体致敏板各孔。2649抗体、3707抗体、3241抗体和320抗体用第二缓冲液稀释到10 u g/ml，制备 各抗体反应液。抗GST抗体致敏板各孔加入各抗体反应液50 yL，搅拌30分钟。然后，抗 GST抗体致敏板各孔用第二缓冲液洗涤三遍。过氧化物酶(POD)融合抗鼠IgG抗体(DakoCytomation公司制)用第二缓冲液稀 释到20mU/ml，制备POD融合抗鼠IgG抗体液。抗GST抗体致敏板各孔加入P0D融合抗鼠 IgG抗体液50 u L，搅拌30分钟。然后，抗GST抗体致敏板各孔用第二缓冲液洗涤三遍。在抗GST抗体致敏板各孔加含0PD的底物液各100 u 1，室温中静置10分钟。再在 抗GST抗体致敏板各孔各加100 u 1反应终止液(含2N H2S04)，用酶标仪测定在492nm处 的吸光度。所得吸光度见表7，基于吸光度得出的各抗体对全长核蛋白和Truncate-1 14的 各抗原的评价结果如表8。在表8中，“+++”表示吸光度为大于1. 5，“++”为大于0. 5且小 于1. 5，“ + ”为大于阴性质控的3SD值且小于0. 5，“-”为小于阴性质控的3SD。[表7-1]
[表 7-2] [表 7-3] [表 7-4] [表 8-1] [表8-2] [表 8-3] 从表7和表8的结果可以看出，2649抗体识别第135个残基到241个残基的氨基 酸序列。3707抗体和3241抗体识别第485个残基到525个残基的氨基酸序列。320抗体 识别第91个残基到134个残基的氨基酸序列。序列表.seq<110>希森美康株式会社<120>麻疹病毒检测方法、膜层析用试验用具及膜层析用测试试剂盒<130>08-001JP<150>JP 2008-222626<151>2008-08-29<150>JP 2008-274807<151>2008-10-24<160>36<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>181<212>PRT
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权利要求
一种从样本中检测麻疹病毒的方法，包括在固相上形成包含可与麻疹病毒核蛋白质结合且固定在所述固相上的第一单克隆抗体、可与所述麻疹病毒核蛋白质结合且被标记的不同于所述第一单克隆抗体的第二单克隆抗体和所述样本所含的所述麻疹病毒核蛋白质的复合物；及根据在所述固相上形成的所述复合物的标记数检查所述麻疹病毒。
2.如权利要求1所述方法，还包括通过混合所述样本和含非离子表面活性剂的样本处 理液来制备测定试样的步骤，其中，所述复合物形成步骤包括用制备的所述测定试样形成 所述复合物。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于所述样本选自包括唾液、鼻涕、鼻腔拭液、鼻腔 吸取液和咽喉拭液的组群。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于所述第一单克隆抗体是从包括识别并结合序 列号9所示所述麻疹病毒核蛋白第135位到第241位氨基酸序列的单克隆抗体、识别并结 合所述序列号9所示所述麻疹病毒核蛋白第485位到第525位氨基酸序列的单克隆抗体及 识别并结合所述序列号9所示所述麻疹病毒核蛋白第91位到第134位氨基酸序列的单克 隆抗体在内的单克隆抗体组群中选择一个单克隆抗体，所述第二单克隆抗体是从所述单克 隆抗体组群选出的其他抗体。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于所述第一单克隆抗体是识别并结合所述序列 号9所示所述麻疹病毒核蛋白第135位到241位氨基酸序列的单克隆抗体和识别并结合所述序列号9所示所述麻疹病毒核蛋白第485位到525位氨基酸序列的单克隆抗体其中之 ？所述第二单克隆抗体是识别并结合所述序列号9所示所述麻疹病毒核蛋白第91位到 134位氨基酸序列的单克隆抗体。
6.一种膜层析用试验用具，包括膜载体，具有固定有能与麻疹病毒核蛋白质结合的第一单克隆抗体的判断区；及标记附着垫，用于附着能与麻疹病毒核蛋白质结合且不同于所述第一单克隆抗体的被 标记第二单克隆抗体。
7.如权利要求6所述试验用具，其特征在于所述判断区还固定能与所述麻疹病毒核 蛋白质结合并不同于所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体的第三单克隆抗体。
8.—种膜层析用测试试剂盒，包括权利要求6所述膜层析用试验用具；及含有非离子 表面活性剂并用于与样本混合制备测定试样的样本处理液。
9.如权利要求8所述测试试剂盒，还包括可盛放所述测定试剂并可插入所述试验用 具的试验容器。
10.一种膜层析用测试试剂盒，包括具备膜载体的试验用具，所述膜载体含有固定有可与麻疹病毒核蛋白质结合的第一单 克隆抗体的判断区；及含有第二单克隆抗体的标记液，所述第二单克隆抗体能与所述麻疹病毒核蛋白质结合 且与所述第一单克隆抗体不同。
11.如权利要求10所述测试试剂盒，其特征在于所述判断区还固定能与所述麻疹病 毒核蛋白质结合并与所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体不同的第三单克隆抗体。
12.如权利要求10或11所述测试试剂盒，其特征在于所述标记液还含有非离子表面 活性剂。
13.一种杂交瘤，选自包括寄存于国家技术评估研究所专利微生物寄存中心的保藏号 为 NITE BP-563、NITE BP_564、NITE BP-565 和 NITE BP-566 的组群。
14.一种单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由权利要求13所述的杂交瘤产生。
全文摘要
本发明提供一种从样本中检测麻疹病毒的方法，包括在固相上形成一个包含可与麻疹病毒核蛋白质结合且固定在固相上的第一单克隆抗体、可与麻疹病毒核蛋白质结合且被标记的不同于上述第一单克隆抗体的第二单克隆抗体和样本所含麻疹病毒核蛋白质的复合物；及根据在该固相上形成的复合物的标记数检查麻疹病毒。此外，本发明还提供一种从样本中检测麻疹病毒的膜层析用试验用具和膜层析用测试试剂盒。
文档编号G01N33/577GK101852806SQ20091017140
公开日2010年10月6日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年8月29日
发明者中岛纪觉, 坂口晃司, 朝枝步, 沖津直哉, 长谷川武宏, 隈元裕司 申请人:希森美康株式会社